专利名称：一株产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株厌氧条件下发酵高产琥珀酸的微生物菌株(F3-ZK)的选育，以及发酵产琥珀酸过程，属生物技术领域。
背景技术：
琥珀酸，学名丁二酸，因最早于琥珀中发现而得名。作为一种重要的C4平台化合物，广泛应用于医药、食品、可降解塑料和化学工业。琥珀酸主要是通过来源于石化原料的顺丁烯二酐水解得到。由于石化资源的不可再生和石化工业对环境产生的负面影响，发酵法生产琥珀酸作为一种新兴的绿色工艺，已成为近年来研究的热点。发酵法生产琥珀酸具有低碳、清洁环保的特点，符合可持续发展的要求。其中选育高产琥珀酸菌株是实现发酵法生产琥珀酸工业化的关键一环。目前，已报道发酵法生产琥珀酸的微生物菌株有产琥珀酸放线杆菌Mc tinobacillus succinogenes )、 产琥拍酸厌氧螺、lif (.Anaerobiospirillum succiniciproducens ) > 产琥拍酸曼氏溶血杆HMannheimia Succiniciproducens ) >大肠杆菌(万.coli )和谷氨酸棒杆菌 (Corynebac terium glu tanicum )。早期研究较为成功的严格厌氧螺菌Jaaero力io^iriW腫 succiniciproducens ATCC 四305，其产琥珀酸可达 43g/L，产率 91% (US 5, 143, 833 ；US 5，143，834和US 5，168，055)；密歇根大学和密歇根生物技术研究所筛选的兼性厌氧菌 Bacterium 130Z (Actinobacillus succinogenes ATCC 55618)，产琥珀酸含量可达 70g/ L，产率80% (US 5，04，004，1996 ；US 5，723，322，1998)，其最高研究水平发酵7 产酸达到 106.8 g/L，对葡萄糖产率83% (US 5573931，1996)；韩国科学技术研究院研究组筛选曼氏琥珀酸杆菌sWccifliciZTroifoceas,报道的最高产琥珀酸水平为52. 4 g/L，生产强度 1.8 g/L'h, (S. J. Lee et al. Appl Envi Microbiol, 2006)。美国阿贡国家实验室Μ. I. Donnelly等、南伊利诺斯州大学的Clark DP等研究组、乔治亚大学的Mark Α. Eiteman研究组等研究构建大肠杆菌基因工程菌，其中五cWi AFPlll/pTrc99A- pyc最高水平产酸 99. 2 g/L(Vemuri G N et al. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002)。但是，上述有生产前景的菌株受专利保护，不易获得。中国专利 CN 1884484A 公布了一株 Jciiz7O^ciBw1S succinogenes NJ113，编号为CGMCC N0. 171，其产琥珀酸可达38. 5 g/L ；中国专利CN1884484A公布了一株高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌CGMCC N0. 3991，其发酵液最高产琥珀酸35. 8g/L。本研究小组前期从牛的瘤胃中筛选到一株产琥珀酸的野生菌株，通过菌种鉴定确认为产琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593 (中国专利ZL 200610038113. 6);通过NTG诱变选育氟乙酸钠抗性突变株，得到产量提高的诱变菌株SF-9 (工业微生物，2007, 37 (2) 1_7)，其5L发酵罐中发酵3 可积累琥珀酸 40. 5g/L，应用基因组改组技术选育到耐钠、氟乙酸钠抗性改组菌CGMCC 2653 (即F3-IO,中国专利ZL 200810146688. 9)，该菌株在5L发酵罐中补料分批发酵4 产琥珀酸53. 96g/L。 2009年报道了采用基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌F3-21，其在5L发酵罐中补料分批发酵7 产琥珀酸达到67. 4g/L (微生物学通报，2009，36 (11) :1676_1681)。但是这些菌株的产琥珀酸水平多数达不到70g/L，生产强度在1.3 g/(L.h)以下，应用于工业化生产的成本相对还是偏高。本发明针对上述问题，在前期工作的基础上，采用基因组改组技术，通过改进筛选方法，选育到高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌F3-ZK，其产酸水平为70-95. 6 g/L。比出发菌株F3-21产酸提高41. 8%，生产强度提高111. 7%，糖酸转化率提高9. m。该菌株具有高产、 降低生产成本的优势。
发明内容
本发明的目的是提供一株产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌，其产酸水平为70-95. 6 g/ L0本发明的技术方案一株高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO :M2012036。所述CCTCC N0:M2012036菌株的应用，该菌在5-15L发酵罐中，补料分批发酵 36-48 h 产琥珀酸 70-95. 6 g/L，生产强度 1. 70-1. 99 g/(L *h)，糖酸转化率 0. 70-0. 83 g/一株高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌JciiflO力aci/^As succinogenes F3-ZK， 巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO :M2012036o通过以下选育得到 CGMCC1593经基因组改技术得到的菌株F3-21为出发菌株，通过吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变，采用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的方法，获得进一步进行基因组改组的出发菌库，再通过三轮的原生质体递进融合，得到改组菌A succinogenes F3_ZK0以下是本发明方法的详细描述
改进的“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”筛选方法 吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍对菌株F3-21进行诱变处理，处理液涂布于选择性平板，并于37°C厌氧培养3-5 d。选择性平板上长出的单菌落用牙签接入96 孔细胞培养板发酵培养基中，置于厌氧手套箱中在100%C02条件下培养M-72 h。采用浓缩检测法对96孔进行HPLC检测第一步96孔板中孔的编号规则先按96孔板发酵批次编号I、II、III、IV、V等，然后在每块96孔板中，按行顺序编号1、2、3··· 12和列顺序编号A、 B、O·· H ；第二步将每行如1-A，1-B,……I-H孔中的发酵液等体积混合，样品处理后进行 HPLC检测；第三步对检测结果最高一组(假设是第2组)中的单孔发酵液进行下一轮检测， 如对2-A，2-B,……2-H孔中的发酵液分别用HPLC检测，通过减少测定数量，达到浓缩筛选的目的。每块细胞培养板选出1-2株产琥珀酸含量最高的菌株，接种到厌氧瓶中进行复筛， 产酸高的前5-15株菌组成基因组改组的出发菌库。选择平板是在TSB平板培养基中，分别添加0.3-0. 5 mol/L琥珀酸钠、10-100 g/L 丙酮酸钠、1-20 g/L氟乙酸钠和稀释1-5倍发酵液，制成相应的琥珀酸钠的平板，丙酮酸钠的平板，氟乙酸钠的平板以及发酵液的平板。发酵培养基按文献微生物学通报(2009,36 :1676-1681)中报道的方法。基因组改组方法
改组出发菌库的菌株培养12-24 h后转接到另一新鲜培养基中，取基本处于对数生长期的细胞在6000-100000r/min转速下离心，PB缓冲液洗涤和制成菌体悬液，向菌悬液中加入适量溶菌酶于在37°C水浴中酶解得到原生质体。将得到的原生质体悬液等量混合后分成两等份，分别进行紫外(25 W紫外灯下30 cm处照射5_10 min)和热灭活(55°C，20-60 min)，取等量的灭活菌悬液在离心管中混合，离心后用PB缓冲液悬浮，然后加入0.2-5mL PEG在37 °C水浴中融合5-20min，离心弃去上清，用PB缓冲液悬浮，涂布选择性再生平板上， 倒置于37°C厌氧培养箱培养3-5 d。将再生平板上长出的融合子挑入96孔细胞培养板，按 “96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”筛选方法，进行第一轮基因组改组菌的筛选。 将得到的3-5株高产菌，作为第二轮基因组改组的母本，按同样的流程进行第二轮、第三论基因组改组。有机酸产物检测方法，按中国专利ZL 200610038113. 6所述的方法。酶活分析按文献Arch Microbiol (1997,167 332 - 342)所述的方法。本发明的有益效果通过改进筛选方法，选育到高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌 F3-ZK,即CCTCC NO :M2012036，其产酸水平为70-95. 6 g/L。比出发菌株F3_21产酸提高 41. 8%，生产强度提高111. 7%，糖酸转化率提高9. m。该菌株具有高产、降低生产成本的优势。生物材料样品保藏一株高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌Mc tinobacillus succinogenes) F3-ZK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2012年2月洸日，保藏编号CCTCC NO :M2012036。
图1 F3-I改组菌5 L搅拌罐补料分批发酵曲线。
具体实施例方式实施例1
分别用吖啶黄、紫外线、紫外线-硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变A succinogenes F3_21， 得到1056个单菌落；这些单菌经过“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”获得 11株琥珀酸产量高于出发菌株的突变株(III -9-H、IV -7-A、IV _7_C、V -12_B、VI -10-C、 W -11-H、VDI -10-H、IX -2-C、X -8-E、XI -8-B 和ΧΠ _7_B)，其平均摇瓶产琥珀酸较 F3-21 提高了 13. 9%。以该11株突变菌株为出发菌库。实施例2
以11株诱变高产菌株作为改组出发菌库进行第一轮融合，11株菌酶解条件采用酶浓度为0. 25 mg/mL，酶解时间为60 min，采用紫外和热致死双灭活，PEG融合后涂布选择性再生双层平板，平板上共长出360多个单菌落，然后将这些单菌落挑入96孔板内进行通量筛选。第一轮基因组改组，得到4株F1代高产改组菌(F1- I -3-F, F1- II -7-B, F1-III -2-E 和F1- IV -9-D)，其平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了 20. 2%，以F1代改组菌为母本进行第二轮改组，筛选得到了 4株F2代高产改组菌(F2- I -5-B、F2- II -5-H、F2- III -6-D和 F2- III -10-F)，其平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了 32. 9% ；再以F2代改组菌为母本进行第三轮改组，结果筛选得到3株F3代高产改组菌(F3- I -9-C、F3- II _3_F、F3- II -10-D)，平均摇瓶产琥珀酸较F3-21提高了 45. 7%，其中F3- II _3_F(定名为F3-I)，摇瓶产琥珀酸达到 38. 9 g/L,比 F3-21 提高了 47. 6%。实施例3
将F3-I种子液，按10%接种量接入装有3. 5L发酵液的5L发酵罐中，于37°C，搅拌转速200 r/min下厌氧发酵，发酵过程通过补充葡萄糖浆维持糖浓度10-30 g/L，并用碱性盐控制PH，维持5. 8-6. 4之间。其中，种子培养基(每L):葡萄糖5 g，酵母膏5 g，Κ2ΗΡ04·3Η20 1.0 g，NaH2PO4CH2O 1.0 g，pH 7.0。37°C厌氧培养16小时。发酵培养基(每L)甜高粱榨汁糖浆(总还原糖》0-80 g，酵母膏 0-15 g，玉米浆 20 g, MgCl2 0.2 g, Na2HPO4* 12 H2O 1.5 g, NaH2PO4 · 2 H2O 1. 5 g, pH 6. 5。37°C厌氧培养 48 小时。发酵曲线如图1。48 h产琥珀酸95. 6 g/L。实施例4
测定改组菌F3-a(和出发菌F3-21的代谢途径中关键酶的活性，结果如表1。表1. F3-ZK与F3-21代谢途径中关键酶的酶活比较结果
权利要求
1.一株高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌(Jciiz7OAaciWw1S succinogenes) F3-ZK，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO :M2012036。
2.权利要求1所述CCTCCNO :M2012036菌株的应用，其特征在于该菌在5-15L发酵罐中，补料分批发酵36-48 h产琥珀酸70-95. 6 g/L，生产强度1. 70-1. 99 g/(L*h)，糖酸转化率 0. 70-0. 83 g/g。
全文摘要
本发明公开了一株高产琥珀酸的琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)F3-ZK，以及其筛选和应用于发酵法生产琥珀酸的方法。该菌株是以CGMCC1593为出发菌株，经多轮原生质体递进融合，并通过“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的方法获得。该菌株已于2012年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNOM2012036。该菌在5-15L发酵罐中，采用补料分批发酵，48h产琥珀酸95.6g/L，生产强度1.99g/(L·h)，糖酸转化率0.71g/g。与国内外其它菌株比具有高产、降低生产成本的优势。
文档编号C12R1/01GK102533622SQ201210056568
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者张坤坤, 郑璞 申请人:江南大学