通过靶向的乙烯信号传导的减少来增加谷物产量的制作方法

专利名称：通过靶向的乙烯信号传导的减少来增加谷物产量的制作方法
通过靶向的乙烯信号传导的减少来增加谷物产量
背景技术：
已知乙烯为植物发育期间程序性细胞死亡(PCD)的调节物(Campbell and Drew, Planta 157 :350_357(1983) ；Drew et al. , Plantal47 83-88(1979) ；He et al. , Plant Physiol. 112 1679-1685 (1996))并在发育中的谷物胚乳中用于协调PCD :外源乙烯能加速发育中的胚乳中的细胞死亡程序的发作，而乙烯生物合成或感受的抑制剂延迟了该程序(Young et al., Plant Physiol. 119 :737_751 (1997) ；Young and Gallie, Plant Mol. Biol. 39 :915-926 (1999) ;Young and Gallie, Plant Mol. Biol. 42 :397_414 (2000))。乙烯调控植物生长和发育的许多方面，例如果实的发育、根和叶的生长以及种子的发芽。乙烯的感受与定位于膜的受体有关，在拟南芥(Arabidopsis)中，所述受体包括 ETRl、ERSl、ETR2、ERS2 以及 EIN4(Chang et al.，Science262 :539_544(1993) ；Hua et al.，Science 269 :1712_1714(1995)，Hua etal.，Plant Cell 10 :1321-1332(1998)， Sakai et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5812-5817(1998))。ETR1、ETR2 和 EIN4 包含3个结构域N-末端跨膜乙烯结合结构域(Schaller and Bleeker, Science 270 1809-1811 (1995))、组氨酸蛋白激酶结构域和C-末端接收结构域ERSl和ERS2没有接收结构域。基于同源性，这些基因被分为两个亚家族，其中ETRl和ERSl组成一个亚家族，而 ETR2、ERS2 和 EIN4 组成另一个亚家族(Hua et al.，Plant Cell 10 :1321-1332 (1998))。 ETRl和ERSl都含有功能性组氨酸激酶结构域和自磷酸化组氨酸残基，而另一家族成员没有组氨酸激酶活性所需的特殊残基。然而，体外试验表明ETR2、ERS2和EIN4能在丝氨酸和苏氛酸残基上自憐酸化(Moussatche and Klee (2004)，]. Biol. Chem. , 279 48734)。与在拟南芥中鉴定了 5种类型的基因相比，在玉米中仅鉴定了两个乙烯受体基因 (即，ZmETR2 和 ZmERSl) (Gallie and Young(2004)Mol Genet Genomics 271:267-281)。 ZmETR2存在称为ZmETR9和ZmETR40的两个变体。与胚乳相比，在发育中的胚中，两个乙烯受体家族的成员的表达水平都显著提高。这解释了尽管胚乳和胚都有助于合成乙烯的事实，为什么发育中的胚乳表现出对乙烯诱导的细胞死亡的低阈值而胚则受到保护。谷物的胚乳是谷粒的主要存储器官，但在中期至晚期的种子发育期间经历细胞死亡。乙烯在发育中的胚乳中调节细胞死亡发作的时机。因为乙烯是能自由地通过膜的气体， 发育中的谷粒的所有器官都被认为暴露于乙烯，所述乙烯由特定器官产生并且仅被它们距离产生源的距离所稀释。将细胞死亡局限于发育中的谷粒的特定器官的能力表明了对乙烯生物合成和感受机构的表达的严格控制。乙烯在光合作用中的作用还不清楚。光合作用在诸如干旱、臭氧暴露或寒冷的应激条件下经常被抑制(Flexas and Medrano (2002), Annals Bot. 89 183-189 ；Chaves et al. (2002),Annals Bot. 89 :907_916 ；Ramachandra et al. (2004),J Plant Physiol. 161 1189-1202)。光合作用的能力在展叶(leaf expansion)期升高并随着叶龄降低，直至光合作用的能力达到叶衰老开始前的低水平(Gay and Thomas (1995), New Phytol. 130 159-168)。衰老程序的起始速率和进行显著影响叶对植物的最终贡献。这与那些诸如谷物的农作物特别相关，其中通过诱导过早叶衰老的不良环境条件降低了产量潜力。
乙烯对光合作用的影响是有争议的，有的报道表明乙烯对光合作用没有影响，有的则表明有抑制作用(Pallaghy and Raschke (1972), Plant Physiol. 49 275-276 ；Kays and Pallas(1980), Nature 285 :51_52 ;Pallas and Kays(1982), Plant Physiol. 70 598-601；Squier et al. (1985), Environ Sci Technol 19 :432_437 ；Taylor and Gunderson(1986), Merr. Plant Physiol. 86 85-92 ；ffoodrow et al. (1988), Mill.J Exp Bot. 39 :667_684)。物种、生长条件、完整相对切离的叶(intact versus excised leaves) 以及所用的外源乙烯的浓度的差异可以是观察到的影响不同的原因。使用突变方法检测乙烯对玉米中光合作用活性和谷粒发育的影响(Young et al. (2004), Plant J 40: 813-825)。在该研究中，作者发现乙烯产生缺陷的玉米突变体的叶绿素量和CO2同化作用速率相比野生型植物升高。由于乙烯在植物生长和发育中起到如此大的作用，鉴定与乙烯应答途径有关的基因可用于产生具有与改变的乙烯相关过程有关的表型的植物，诸如具有滞绿特性的植物与。因此，需要鉴定与谷物乙烯信号转导途径有关的基因。发明概述本发明提供了影响植物中的乙烯信号转导途径的组合物和方法。本发明提供了能编码诸如显性负性(dominant negative)ZmERSl、ZmETR9或 ZmETR40(分别用SEQ ID N0s:2、4和6表示)的显性负性乙烯受体多肽的分离的核酸。另外，本发明包括编码这些多肽的每一个的多核苷酸序列(例如，SEQ ID N0s:l、3和5)。本发明的多核苷酸包含与SEQ ID NOs :1、3和5具有至少90%—致性的序列，并且更通常地， 与SEQ ID NOs :1、3和5具有至少95%、99%或100%—致性的序列。在本发明的某些实施方案中，分离的核酸编码与SEQ ID N0:2具有至少90%，更通常地，具有至少95%、99%或 100%的一致性的多肽，其中氨基酸65不是半胱氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO :2的氨基酸65是酪氨酸。在某些实施方案中，分离的核酸编码与SEQ ID NO :4具有至少90%， 更通常地，具有至少95%、99%或100%—致性的多肽，其中氨基酸102不是半胱氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO :4的氨基酸102是酪氨酸。在某些实施方案中，分离的核酸编码与SEQ ID NO :6具有至少90%，更通常地，具有至少95%、99%或100% —致性的多肽， 其中氨基酸102不是半胱氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO :6的氨基酸102是酪氨酸。在某些实施方案中，所述核酸编码ZmERSl和ZmETR2的截断突变体(例如，包含 SEQ ID NO :2的氨基酸1-110或SEQ ID NOs :4和6的氨基酸1-147)。在这些实施方案中， 所述截断突变体可以稍微更长，例如SEQ ID NO 2的1-150、1-200、1-250、1-300、1-325或 1-350 或者 SEQ ID NO :4 或 6 的氨基酸 1-200、1-250、1-300、1-350 或 1-375。在某些实施方案中，本发明提供了包含可操作地连接至核酸序列的启动子序列的重组表达盒，所述核酸序列编码显性负性乙烯受体多肽，例如显性负性ZmERSl、ZmETR9或 ZmETR40(分别用SEQ ID NOs :2、4和6表示)。在某些实施方案中，所述核酸编码ZmERSl 和ZmETR2的截断突变体(例如，包含SEQ ID NO 2的氨基酸1-110或SEQ ID NO :4或6的氨基酸1-147)。另外，本发明包括SEQ ID NOs :1、3和5的多核苷酸序列，以及与SEQ ID NOs :1、3和5具有至少90%，更通常地，具有至少95%、99%或100%—致性的核酸序列。在某些实施方案中，本发明提供了包含重组表达盒的转基因植物，所述重组表达盒包含可操作地连接至编码本发明的显性负性乙烯受体多肽的核酸序列的启动子序列。在某些实施方案中，所述核酸编码ZmERSl、ZmETR9或ZmETR40(分别用SEQ ID NOs :2、4和6 表示)。在其它实施方案中，显性负性乙烯受体多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1-110或 SEQ ID NO :4或6的氨基酸1-147。在某些实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID N0:l、3或 5，以及与SEQ ID NOs :1、3和5至少90%—致，并且更通常地，与SEQ ID N0s:l、3和5至少 95%、99 %或100 % —致的核酸序列。在某些实施方案中，所述转基因植物是谷物植物，例如小麦、水稻、大麦、黑麦、小米、高粱或燕麦。在某些实施方案中，所述转基因植物是玉米。在另外的实施方案中，本发明提供了降低植物乙烯敏感性的方法，所述方法包括下述步骤(a)导入构建体(construct),所述构建体包含可操作地连接至编码显性负性乙烯受体多肽的核酸序列的启动子，以及(b)选择具有降低的乙烯敏感性的植物。优选的显性负性乙烯受体多肽包括ZmERSl、ZmETR9或ZmETR40 (分别用SEQ ID NOs :2、4和6表示)。 在其它实施方案中，所述显性负性乙烯受体多肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸1-110或SEQ ID NO :4或6的氨基酸1-147。在某些实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID N0s:l、3或5， 以及与SEQ ID NOs :I、3或5至少90%—致，并且更通常地，与SEQ ID N0s:l、3或5至少 95%、99%或100%—致的核酸序列。在另一方面，本发明提供了产生植物中的滞绿表型的方法。所述方法包括下述步骤(a)导入构建体，所述构建体包含可操作地连接至编码显性负性乙烯受体多肽的核酸序列的启动子，以及(b)选择具有滞绿特征的植物。在某些实施方案中，所述乙烯受体多肽包括ZmERSl、ZmETR9或ZmETR40(分别用SEQ ID NOs :2、4和6表示)。在其它实施方案中， 所述显性负性乙烯受体多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1-110或SEQ ID NO :4或6的氨基酸1-147。在某些实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NOs :1、3或5，以及与SEQ ID NOs
1、3或5至少90%—致，并且更通常地，与SEQ ID NOs :1、3或5至少95%、99%或100% — 致的核酸序列。在某些实施方案中，基于延迟的衰老、增加的光合作用能力或一粒种子中有多个胚来选择植物。通过下文的详细描述，本发明的其它目地、优势和实施方案将是显而易见的。附图
简述图I :通过在拟南芥中表达突变的ZmERSl或ZmETR2而赋予的乙烯不敏感性随一系列ACC浓度的定量。使表达突变的ZmERSl (MSl-Il)或ZmETR2 (MT2-9)的种子在所示浓度的ACC上发芽并在黑暗中生长5天。将野生型种子(WT)包括在内作为对照。发明详述A.介绍本发明提供了通过抑制植物中的乙烯应答来延迟玉米植物中的衰老的新方法。 可以通过乙烯受体蛋白的突变以及野生型或突变体乙烯受体蛋白的过表达实现衰老的延迟。本发明还提供了选择具有延迟的衰老模式或特征的谷物植物的方法。延迟的衰老模式会产生与野生型植物相比具有改变的表型的谷类植物。改变的表型包括但不限于滞绿特性，例如叶在生长季节的晚期保持绿色、增加的光合作用能力、改进的耐旱性、改进的青贮 (silage)、增加的谷物产量和增加的对较高密度种植的耐受性以及多胚的谷粒。因此，通过抑制乙烯应答，仅通过突变的乙烯受体蛋白的产生或结合其它方法，可以鉴定生物量和/ 或产量增加的植物。B.定义
短语“核酸”或“多核苷酸序列”指的是从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可以包括修饰的核酸，其使多聚酶正确地连读而不改变所述核酸编码的多肽的表达。短语“编码...的核酸序列”指的是指导特定蛋白或肽的表达的核酸。所述核酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白质的RNA序列这两者。所述核酸序列包括全长核酸序列以及来自所述全长序列的非全长序列这两者。还应当理解，所述序列包括天然序列或可以被导入以在特定宿主细胞中提供密码子偏爱性的序列的简并密码子。术语“启动子”指的是位于转录起始上游或下游的区域或序列决定簇，并且所述启动子与起始转录的RNA多聚酶及其它蛋白的识别和结合有关。“植物启动子”是能在植物细胞中起始转录的启动子。这种启动子不需要是植物来源的，例如，能在本发明中使用诸如 CaMV35S的来自植物病毒的启动子。术语“植物”包括完整植物、枝条营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包含胚、胚乳和种皮) 和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其后代。能用于本发明的方法中的植物种类一般与可用转化技术处理的闻等和低等植物的种类一样多，其包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、苔藓植物以及多细胞藻类。所述植物包括各种倍性水平，其包括非整倍体、多倍体、 二倍体、单倍体以及半合子。短语“宿主细胞”指的是来自任何生物的细胞。优选的宿主细胞来自植物、细菌、 酵母、真菌、昆虫或其它动物。将多核苷酸序列导入不同类型的宿主细胞的方法在本领域是熟知的。如果多核苷酸序列来自外源物种或者如果来自相同物种，但被人为地修饰其原始形式，所述多核苷酸序列与第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，可操作地连接至启动子的异源编码序列指的是来自与启动子来源的物种不同的物种的编码序列，可选择地，如果来自相同的物种，与任何天然存在的等位基因变体不同的编码序列。对个体植物而言的“外源”的多核苷酸是通过除有性杂交之外的方式被导入所述植物或所述植物的上一代的多核苷酸。下文将描述能实现该结果的方法的实例，并且所述方法的实例包括农杆菌介导(agrobacterium-mediated)的转化、生物导弹法(biolistic methods)、电穿孔、植物原位(in planta)技术等。本发明的具体多肽或核酸的“增加或增强的表达或活性”指的是多肽的活性的增大变化。这种增加的活性或表达的实例包括下述内容多肽的活性或编码所述多肽的基因的表达增加(或存在更长的时间段)至高于野生型、非转基因对照植物的水平的水平。多肽的活性或基因的表达存在于器官、组织或细胞中，其中所述多肽的活性或基因的表达在野生型、非转基因对照植物中通常检测不到(即，多肽或编码多肽的基因的表达的空间分布发生改变)。本发明的多肽或核酸的“降低的表达或活性”指的是多肽的活性降低。这种降低的活性或表达的实例包括下述内容多肽的活性或基因的表达降低至低于野生型、非转基因对照植物的水平。本文所用的术语“生殖结构”或“生殖组织”包括果实、胚珠、种子、花粉、花或诸如
6雌蕊、雄蕊、花药、萼片、花瓣、心皮的花部分或任何胚性组织。本文所用的术语“营养结构”或“营养组织”包括叶、茎、块茎、根、维管组织或根和枝条分生组织。“表达盒”指的是核酸构建体，当被导入宿主细胞时，所述核酸构建体分别引起RNA 或多肽的转录和/或翻译。不或不能被翻译的反义或正义结构特别地包括在本定义中。在转基因的表达和内源基因的抑制(例如，通过反义或正义抑制)这两者的情况下，技术人员会认识到，插入的多核苷酸序列不需要与其来源的基因的序列完全相同，而是可以“基本相同”。如下文解释的，该术语特别地包含这些变体。在插入的多核苷酸序列被转录和翻译以产生功能化多肽的情况下，技术人员会认识到，由于密码子简并性，许多多核苷酸序列将编码相同的多肽。术语“本发明的基因的多核苷酸序列”特别地包括这些变体。另外，该术语特别地包括与编码本发明的多肽的基因序列基本相同(如下文所述测定)的序列(例如，全长序列)和编码保留本发明多肽的功能的蛋白的序列。在多核苷酸被用于抑制内源基因的表达的情况下，导入的序列不需要与靶内源基因的序列完全相同。导入的多核苷酸序列通常至少与靶内源序列基本相同(如下文所述测定)O如果当如下文所述进行最大对应性的比对时，两个核酸序列或多肽序列中的核苷酸或氨基酸残基序列分别是相同的，则这两个核酸序列或多肽被认为是“一致”的。本文所用的术语“互补”表示序列与全部或一部分参考多核苷酸序列互补。可通过下述进行用于比较的序列的最佳比对Smith和Waterman, Add. APL. Math. 2 482 (1981)的局部同源算法、Needleman 和 ffunsch, J. Mol. Biol. 48 443 (1970)的同源比对算法、Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444 (1988)的寻找相似性方法、这些算法的计算机实现(Wisconsin遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP，BESTFIT, BLAST, FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr.，Madison, WI)或目测(inspection)。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列测定“序列一致性百分比”，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列相比(其不包含增加或缺失)，比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，空位)。百分比通过下述方法计算确定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，从而获得匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数并将结果乘以100，从而获得序列一致性的百分比。术语多核苷酸序列“基本一致”表示多核苷酸包含具有与显性负性乙烯受体多核苷酸(例如，SEQ ID N0:l、3或5)至少85% —致性的序列。可选择地，一致性百分比 (percent identity)可以是从85%至100%的任何整数。利用本文所述的程序,大部分实施方案包括相比于参照序列的至少85%、90%、95%或99%的一致性；如下文所述，优选使用标准参数的BLAST。因此，本发明的方法所用的编码多肽的序列包括与本文公开的序列基本相同的核酸序列。技术人员会理解，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，能合适地调整这些值以确定对应的两个核苷酸序列编码的蛋白质的一致性。用于这些目的的氨基酸序列的基本一致表示与显性负性乙烯受体多肽(例如，SEQ ID NO :2、4或6)的序列一致性至少为90%。多肽的一致性百分比可以是从90%至100%的任何整数，例如90%、95%或99%。“基本相似”的多肽共享如上所指出的序列，除了不一致的残基位置可以由于保守氨基酸的变化而不同。保守氨基酸取代指的是具有相似侧链的氨基酸的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代组合包括缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。核苷酸序列基本一致的另一指示是两个分子在严紧条件下是否互相杂交，或与第三个核酸杂交。严紧条件是序列依赖性的并在不同的情况下不同。一般地，严紧条件被选择为在确定离子强度和PH的条件下，比特定序列的热熔点(Tm)低约5°C。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和PH的条件下)。通常，严紧条件是pH为7时，盐浓度为约O. 02摩尔并且温度至少为约60°C或65°C。出于本发明公开的目的，杂交的严紧条件是包括于63°C下进行20分钟、在O. 2X SSC中、至少洗涤一次在内的那些条件，或等同条件。中等严紧条件包括于至少约50°C，通常约55 °C的温度下进行20分钟、在O. 2X SSC中、至少洗涤一次(通常2次)，或等同条件。短语“与乙烯相关过程有关的表型”指的是由乙烯调节的表型。示例性的表型包括但不限于，滞绿特性，诸如改进的耐旱性、改进的青贮、叶在生长季节的晚期保持绿色和增加的对更高密度种植的耐受性。乙烯相关过程的调节能来自，例如，乙烯的过量产生、乙烯的产生不足、对细胞中乙烯的敏感性增加或对细胞中乙烯的敏感性降低。术语“乙烯受体”或“乙烯受体蛋白”指的是来自存在于植物中的任何乙烯受体家族的乙烯受体。作为示例，在拟南芥中，乙烯受体蛋白包括ETR1、ERSU ETR2、ERS2和 EIN4。玉米(Zea mays)乙烯受体蛋白包括ZmERSl和ZmETR2 (包括ZmETR2变体ZmETR9和 ZmETR40)。如本文所用的，能同义地使用“ETR2”、“ZmETR2”、“ZmETRVm“ZmETR40”。类似地，能同义地使用“ERSI ”和“ ZmERSI ”。可以从任何物种的植物中分离本发明的乙烯受体，所述乙烯受体包括示例性乙烯受体的物种同系物。乙烯受体还包括天然存在和具有诱导突变的蛋白质，所述突变包括插入、缺失和点突变。“显性负性”指的是基因产物，所述基因产物在相同的细胞内，甚至在该细胞是杂合子(野生型和显性负性)时，对正常、野生型基因产物的功能有不利影响。所述显性负性突变体的表达通常导致正常功能的下降。可以通过保留二聚体化结构域，但破坏或截断蛋白的其它功能结构域形成“显性负性乙烯受体”。例如，不结合乙烯的乙烯受体突变体(在本文中称为“不结合乙烯的乙烯受体”)以显性负性方式起作用。本发明的不结合乙烯的乙烯受体包括SEQ ID NOs :2、4和6的多肽及其基本上相同的变体，只要SEQ ID NO :2的氨基酸残基65或SEQ ID NOs :4或6的氨基酸残基102不是半胱氨酸。乙烯受体多肽通过位于多肽的N末端的二硫键成为二聚物(参见，例如，Schaller et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 :12526-30)。为了乙烯受体的目的，所述“二聚体化结构域” 指的是介导这种二聚作用的N末端半胱氨酸中的至少一个。与二聚作用有关的半胱氨酸与介导乙烯结合的半胱氨酸残基明显不同。ZmERSl的二聚体化结构域被发现位于SEQ ID NO: 2的氨基酸4和6。ZmETR9和ZmETR40的二聚体化结构域分别位于SEQ ID NO 4的氨基酸 37和40和SEQ ID NO 6的氨基酸38和40。术语“乙烯结合结构域”大体上对应存在乙烯受体多肽的N末端的跨膜结构域。与 ZmERSl中的乙烯结合有关的残基跨越SEQ ID NO 2的氨基酸20-119。与ZmETR2的乙烯结合有关的残基跨越SEQ ID NOs 4和6的氨基酸53-156。能利用本文所述的方法测试所述受体的乙烯结合能力。术语乙烯受体的“跨膜结构域”或“膜内区域”指的是跨越乙烯受体多肽的3或4 个跨膜螺旋的区域。像大部分跨膜结构域一样，所述乙烯受体跨膜结构域主要是疏水的。 在大部分乙烯受体多肽中，所述跨膜结构域大体上对应“乙烯结合结构域”。作为示例，所述 ZmERSl的跨膜结构域大约跨越SEQ ID NO :2的氨基酸20-107。所述ZmETR2的跨膜结构域大约跨越SEQ ID NOs 4和6的氨基酸5-144。乙烯受体的“组氨酸激酶结构域”或“激酶结构域”指的是与信号转导途径有关的区域。ETRl和ERSl受体在该区域中的保守组氨酸残基自磷酸化以应答乙烯。其它乙烯受体家族蛋白(ETR2、ERS2和EIN4)缺乏组氨酸激酶活性所需的残基。然而，这些蛋白仍然能赋予植物细胞乙烯应答性。仅在ETR1、ETR2和EIN4乙烯受体中发现“C末端接收结构域”。所述接收结构域联合所述激酶结构域在调节应答中起作用。所述激酶结构域和接收结构域与CTRl相互作用以调节乙烯应答性。作为示例，所述ETR2的C末端接收结构域大约跨越SEQ ID NOs 4 和6的氨基酸612-767。术语“滞绿”指的是与野生型植物相比，杂交植物在进入生长季节后期保持植物健康的能力。滞绿特性涉及增加的谷物产量、增加的光合作用能力、改进的耐旱性、改进的青贮和增加的对更高密度种植的耐受性。利用标准分析可以方便地测定滞绿表型。例如，能使用黑暗诱导的衰老分析。这种分析通常包括覆盖仍然连接在植物上的叶达I周。光的缺乏诱导叶的衰老，与对照相比，本发明的植物的叶的衰老能被延迟。术语“光合作用能力”指的是植物将光能转变为化学能的能力。例如，通过测量植物结构中的叶绿素的量或CO2同化作用的量可以确定光合作用的能力。这些技术在本领域是已知的。“生物标志物”是指示感兴趣的特性或基因的存在的任何可检测标志物。在某些情况下，生物标志物是容易检测的表型，所述表型与感兴趣的特性或基因连锁或共分离 (cosegregates)。例如,某些生物标志物提供对化学或营养应激的抗性。在某些实施方案中，所述生物标志物是容易检测的蛋白，例如荧光团或类似的报道构建体。在某些实施方案中，所述生物标志物是核苷酸序列，例如单一限制位点或容易扩增的序列。生物标志物能用于指示转基因或内源基因的存在，例如特定的等位基因。生物标志物的用途在本领域是已知的并且可以改变所述技术以适应具体的情况。C.本发明的多肽的抑制活性本发明提供了通过抑制植物中乙烯受体蛋白的活性，调节乙烯相关过程的方法。 在某些实施方案中，本发明提供了抑制植物中乙烯受体活性的方法，所述方法包括导入包含可操作地连接至编码乙烯受体的核酸序列的启动子的构建体，构建体所述核酸序列例如SEQ ID NO :1、3或5、其变体或截断突变体。在某些实施方案中，能通过表达编码突变的显性负性多肽的转基因来制备本发明的多肽的无功能或显性负性突变。如上文所解释的，显性负性突变体多肽在相同的细胞中， 甚至当该细胞是杂合子(野生型和显性负性)时，对正常、野生型基因产物的功能有不利影响。不希望被理论所约束，所述显性负性基因产物被认为起作用并与至少某些与野生型基因产物相同的成分相互作用，但阻断野生型功能的某些方面。显性负性突变的实例是作为二聚体起作用的蛋白质。除去功能性结构但是保留二聚体化结构域的突变导致显性负性表型，因为野生型蛋白的某些部分被无功能的蛋白结合，从而产生无功能的二聚体。乙烯受体蛋白符合这一模式，因为其作为同型二聚体在细胞膜中起作用。因此，作为实例，通过保留所述二聚体化结构域但破坏或截断蛋白的其它功能结构域可以形成显性负性乙烯受体。不结合乙烯的乙烯受体以显性负性方式起作用。因此，破坏ZmERSl或ZmETR2的乙烯结合结构域的至少一个残基能导致乙烯的不敏感性。例如，我们发现破坏ZmERSl中的 Cys65和ZmETR2中的Cys 102导致植物中的乙烯不敏感性。破坏乙烯结合结构域的其它残基也能干扰乙烯的结合，例如ZmERSl的残基20-119、25-36或61-91的任意残基或者ZmETR2 的残基53-156、58-67或90-120的任意残基。Mizukami et al. , Plant Cell 8:831-845(1996)中描述了使用显性负性突变体以在转基因植物中产生失活的靶基因。如上文指出的，通过向植物中导入乙烯受体的显性负性突变体，该方法能用于降低植物中的乙烯敏感性。例如，改变的拟南芥ERS基因能用于提供显性乙烯不敏感性(Hua et al. ,Science 269 :1712_4(1995))。也使用了拟南芥ETRl 突变体(Wilkinson et al. , Nat Biotechnol. , 15AU-I (1997)和 Chang et al. , Science, 262 :539-44(1993))。其它策略是抑制本发明的多肽与自身或其它分子相互作用的能力。例如，利用特异性抗体能实现这种策略。例如，抗体的细胞特异性表达能通过抗体抗原识别使功能性结构域失活(参见，Hupp et al. , Cell 83:237-245(1995))。在某些实施方案中，本发明包括乙烯应答性降低的乙烯受体。在没有乙烯的条件下，乙烯受体负向调节乙烯应答途径。CTRl介导乙烯受体蛋白的信号传导下游，CTRl 是涉及哺乳动物RAF型丝氨酸/苏氨酸激酶的乙烯应答的负向调节子(Kieber et al., Cell, 72 =427-441(1993)) ο乙烯的结合导致CTR-I的活性降低，并因此导致EIN2 (其作为 CTR-I的下游)活性的增加,这最终导致乙烯应答性的升高(Bleeker and Schaller, Plant Physiol.，111 :653-660 (1996) ；Hua and Meyerowitz, Cell, 72 427-441 (1998)) 因此，乙烯的结合抑制负性受体信号传导。因此，可以通过防止乙烯与受体结合的突变或通过CTR-I引起组成型信号传导的突变提供显性负性乙烯不敏感性。显性负性乙烯不敏感性突变体的具体实例是拟南芥ETRl 基因的etrl-Ι突变体。其在第二跨膜区域具有防止乙烯结合至受体的Cys至Tyr的突变。 甚至在存在乙烯的条件下干扰乙烯结合或允许CTR-I信号传导的其它乙烯受体突变体在本领域是已知的(参见，例如，Wang et al.，(2006)，Plant Cell, 18 =3429-3442) 在某些实施方案中，乙烯受体蛋白的截断突变体用于提供乙烯不敏感性。所述截断可以位于乙烯受体的N-末端或C-末端或这两者。一个实例是缺乏组氨酸蛋白激酶和
10C-末端接收结构域的乙烯受体。另一实例是缺乏跨膜区域后的细胞内结构域的截断突变体，例如，大约SEQ ID NO :2的残基110后或SEQ ID NO :4或6的残基147后。这些截断突变体能单独或结合其它突变用于降低乙烯的应答性。在某些实施方案中，所述截断突变体能稍微更长，例如，SEQ ID NO 2 的 1-150、1-200、1-250、1-300、1-325 或 1-350 或者 SEQ ID NO :4 或 6 的氨基酸 1-200、1-250、1-300、1-350 或 1-375。定点诱变技术可以用于本发明的核苷酸序列。例如,如Sambrook等人(Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed.(分子克隆实验室手册，第二版)，1989Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, N. Y.)的第 15. 3 节所述,DNA 的限制性内切酶消化然后连接可以用于产生乙烯受体的缺失变体。如上文的Sambrook等人的第15. 3节所述，类似的策略可用于构建插入变体。最近，Zhu et al. , (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 8768-73发明了利用嵌合RNA/DNA寡核苷酸在体内将突变靶向植物基因的方法。寡核苷酸定向诱变也可用于制备本发明的取代变体。其还可以用于方便地制备本发明的缺失和插入变体。如Adelman et al. (1983)DNA2 :183、上文的Sambrook等人 “Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物学方法)”，1991, Wiley (NY), F. T. AusubeI, R. Brent, R Ε. Kingston,D. D. Moore, J. D. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds所述，这种技术在本领域是熟知的。PCR技术也可以用于向靶核苷酸序列导入突变。例如，PCR引物可以设计为将插入、缺失或点突变导入靶序列中。这些技术在本领域是被广泛了解的。上文的技术可以与其它方法组合以降低植物中的乙烯应答性。例如，利用指定的启动子，技术人员能指导外源乙烯受体(例如，ERSU ERS2、ETRU ETR2或EIN4)的表达并产生具有诸如滞绿特性的期望表型特征的植物。技术人员能从多种已知启动子中选择启动子，不论组成型、诱导型、组织特异性启动子。在优选的实施方案中，利用增加功能性乙烯受体的表达的方法降低乙烯敏感性。在另一优选实施方案中，利用降低内源乙烯受体表达的方法降低乙烯敏感性。在第10/876，086号美国专利申请中详细地描述了这些方法，该申请通过引用的方式全文并入本文。D.本发明所用的核酸的分离在某些实施方案中，本发明提供了编码乙烯受体蛋白或其突变形式的分离的核酸。所述分离的核酸与乙烯受体基因的野生型多核苷酸序列至少90%—致。在一实施方案中，所述分离的核酸包含来自玉米乙烯受体的序列。在示例性的实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO :1、3或5至少90%—致，并且更通常地，95%、99%或100%—致。在其它实施方案中，能使用包含小于全长乙烯受体蛋白的截断突变体。在某些实施方案中，所述截断突变体包含N末端跨膜结构域。在优选的实施方案中，所述截断突变体包含SEQ ID NO 1的大约核苷酸1-330 (编码SEQ ID NO 2的氨基酸1-110)。在另一优选实施方案中， 所述截断突变体包含SEQ ID NO :3或5的核苷酸1-441 (分别编码SEQ ID NOs 4和6的氨基酸 1-147)。可以通过许多技术分离本发明所用的核酸。例如，基于其它植物物种的乙烯受体基因的已知序列的寡核苷酸探针能用于从期望植物物种的cDNA或基因组DNA文库中鉴定期望的基因。为了构建基因组文库，通过诸如使用限制性内切酶的随机断裂产生大片段的基因组DNA，并用载体DNA连接所述大片段的基因组DNA以形成能被包装入合适载体的串联体(concatemers)。为了制备胚特异性cDNA文库,从胚中分离mRNA并且从所述mRNA制备含有基因转录本的cDNA文库。然后能利用基于克隆的乙烯受体基因的序列的探针筛选所述cDNA或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种中的同源基因。可选择地，能使用扩增技术从核酸样品中扩增感兴趣的核酸。例如，能使用聚合酶链式反应(PCR)技术直接从mRNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库扩增所述基因的序列。例如，PCR和其它体外扩增方法还能用于克隆编码待被表达的蛋白的核酸序列，制备作为用于检测样品中期望mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的的探针的核酸。通过比较已知乙烯受体蛋白的序列得到合适的引物和探针，所述引物和探针用于鉴定植物组织中编码本发明的多肽的基因。对于PCR的一般概述，参见PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 操作方法和应用指南)·(Innis, Μ· , Gelfand, D.，Sninsky, J. and White, Τ.，eds. )，Academic Press, San Diego (1990)。扩增条件取决于许多因素，所述因素包括引物长度、引物与靶序列之间的相同程度以及待扩增的靶序列的长度。通常的反应条件如下文所述。反应组分10mM pH为8. 3的Tris HCl、50mM的氯化钾、I. 5mM 的氯化镁、0. 001 % 的明胶、200μΜ 的 dATP、200yM 的 dCTP、200yM 的 dGTP、 200μΜ的dTTP、0. 4μΜ的引物以及每mL 100单位的Taq聚合酶。程序96°C、3min.，96°C、 45sec 进行 30 个循环，5(TC、60sec，72°C、60sec，然后 72°C、5min.。可以通过如技术文献所述的熟知技术合成多核苷酸。参见,例如，Carruthers et al.，Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47 :411_418(1982)和 Adams et al.，J. Am. Chem. Soc. 105 661 (1983)。然后可以通过合成互补链并在合适条件下使这两条链一起退火，或者通过使用DNA聚合酶和合适的引物序列添加互补链获得双链DNA片段。本发明的序列的种类包括利用核酸序列和蛋白序列分析鉴定和表征的基因和基因产物，所述核酸序列包括SEQ ID NOs :1、3和5，所述蛋白序列包括SEQ ID N0s:2、4和6。 编码本发明所用多肽的序列包括与SEQ ID NOs :1、3和5基本相同的核酸序列。编码本发明所用的多肽的序列包括那些编码与SEQ ID NOs :2、4和6基本相同的多肽序列的序列。一旦利用上文所述的方法分离了核酸，能使用标准方法确定所述核酸是否编码乙烯受体蛋白。编码本发明的多肽的核酸可以用于产生具有滞绿特性的转基因植物。例如， 乙烯受体多肽的表达增强或增加的转基因植物会表现出与植物中改变的乙烯过程有关的表型，例如延迟的衰老，所述乙烯受体多肽与SEQ ID NOs :2、4或6或其截断突变体相同或基本相同。使用标准方法，技术人员可以将被认为编码，例如，乙烯受体多肽的推定核酸序列的序列与编码乙烯受体多肽的核酸序列进行比较以确定所述推定核酸序列是否编码真实的乙烯受体多肽。编码乙烯受体多肽的核酸，例如包含与SEQ ID NOs :1、3或5或其截断突变体相同或基本相同的序列的核酸，能用于本发明的方法中。E.重组载体的制备本发明提供了重组表达盒，所述重组表达盒包含可操作地连接至编码乙烯受体多肽序列的核酸序列的启动子序列。在某些实施方案中，所述乙烯受体是ERS，例如，SEQ ID NO : I或者SEQ ID NO 1的截断突变体所表示的ERSl核苷酸。在某些实施方案中，所述乙烯受体是ETR，例如，SEQ ID NO :3或5或者SEQ ID NO :3或5的截断突变体所表示的核苷酸。为了使用上文的技术中分离的序列，制备了适合植物细胞转化的重组DNA载体。 用于转化大量高等植物物种的技术是公知的，并且技术和科学文献，例如，Weising et al. ,Ann. Rev. Genet. 22 =421-477(1988)中描述了所述技术。编码期望的多肽的DNA序列， 例如，编码全长蛋白的cDNA序列，优选地与转录和翻译起始调节序列组合，这将指导来自转化植物目的组织中的基因的序列的转录。例如，为了过表达，可以使用植物启动子片段，所述植物启动子片段指导再生植物的所有组织中的基因的表达。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件下和发育或细胞分化状态下是有活性的。可选择地，植物启动子可以指导本发明的多核苷酸在特定组织(组织特异性启动子、器官特异性启动子)或特定环境条件(诱导型启动子)中的表达。如果期望合适的多肽表达，应包含位于编码区3’ -末端的多聚腺苷酸化区域。所述多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。包含来自本发明的基因的序列(例如，启动子或编码区)的载体通常包含赋予植物细胞可选择的表型的标志物基因。例如，所述标志物可以编码生物杀伤剂抗性，具体地， 抗生素抗性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性，或者除草剂抗性，例如对草甘膦(glyphosate)、氯磺隆(chlorosulfuron)或草丁膦(glufosinate)的抗性。在植物细胞中重组表达诸如编码乙烯受体蛋白的核酸序列的本发明的核酸序列以增强和升高内源性植物转录因子的水平。例如，在植物细胞中重组表达本发明的乙烯受体核酸序列以增强和升高内源性乙烯受体多肽的水平。能制备多种不同的表达构建体，例如表达盒和适合植物细胞转化的载体。转化许多高等植物物种的技术是公知的，并且技术和科学文献中，例如，Weising et al. ,Ann. Rev. Genet. 22 :421_477 (1988)中描述了所述技术。能将编码本发明所述多肽的DNA序列，例如编码全长乙烯受体蛋白的cDNA序列，与顺式作用(启动子和增强子)转录调节序列组合以指导在转化的植物的目的组织中转录的时机、组织类型和水平。也可以使用翻译调控元件。本发明提供了可操作地连接至启动子的编码乙烯受体多肽的核酸，所述启动子在某些实施方案中，能驱动植物中的编码序列的转录。例如，所述启动子可以源自植物或病毒来源。所述启动子可以是，例如，有组成型活性的、诱导的或组织特异性的。在本发明的重组表达盒、载体、转基因的构建中，可以选择和使用不同的启动子以差异地指导基因表达， 例如在植物或动物的某些或全部组织中。通常，如上文所讨论的，通过分析对应本文所述的胚特异性基因的基因组克隆的5’序列鉴定期望的启动子。I.组成型启动子可以使用在所有转化的细胞或组织中，例如，再生植物(regenerated plant)的细胞或组织中指导编码乙烯受体蛋白的核酸表达的启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且其在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是有活性的。 组成型启动子的实例包括来自感染植物的病毒的组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S 转录起始区(参见，例如，Dagless, Arch. Virol. 142 :183_191 (1997))、源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I，-或2，-启动子(参见，例如，上文的 Mengiste (1997) ;0’Grady，Plant Mol. Biol. 29 :99_108 (1995))、烟草花叶病毒的启动子、玄参花叶病毒的启动子(参见，例如，Maiti, Transgenic Res. 6 143-156 (1997)), 诸如拟南芥肌动蛋白基因启动子的肌动蛋白启动子(参见，例如，Huang, Plant Mol. Biol. 33 :125-139(1997))、醇脱氢酶(Adh)基因启动子(参见，例如，Millar, Plant Mol. Biol. 31 :897-904(1996))、来自拟南芥的 ACTl I (Huang et al.，Plant Mol. Biol. 33 125-139(1996))、来自拟南芥的 Cat3 (GenBank No. U43147, Zhong et al.，Mol. Gen. Genet. 251 :196_203(1996))、来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶的基因(Genbank No. X74782, Solocombe et al. , Plant Physiol. 104 1167-1176(1994))、来自玉米的 GPcl (GenBank No. X15596, Martinez et al.，J. Mol. Biol. 208 :551-565 (1989))、来自玉米的 Gpc2 (GenBank No. U45855, Manjunath et al.， Plant Mol. Biol. 33 :97_112 (1997))、来自技术人员已知的不同植物基因的其它转录起始区。还参见，Holtorf et al. , Plant Mol. Biol. 29 :637_646 (1995)。2.诱导型启动子可选择地，植物启动子可以指导诸如编码乙烯受体蛋白的核酸的本发明所述的核酸在变化的环境条件或发育条件影响下的表达。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、升高的温度、干旱或光的存在。可以通过诱导型启动子影响转录的发育条件的实例包括衰老。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子。例如，本发明包括玉米的干旱诱导型启动子(上文的Busk(1997))、来自马铃薯的寒冷、干旱、高盐诱导型启动子(Kirch et al.，Plant Mol. Biol. 33 =897909 (1997)) 发育条件的实例包括细胞老化和胚发生。例如，本发明包括拟南芥的衰老诱导型启动子SAG 12 (Gan and Amasino, Science270 :1986-1988 (1995))以及 LECl (Lotan et al.，Cell, 93 :1195-1205 (1998))、 LEC2(Stone et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 11806-11811(2001)),FUS3(Luerssen, Plant J. 15 :755-764(1998))、AtSERKl (Hecht et al.，Plant Physiol. 127 803-816(2001))和 AGL15(Heck et al.，Plant Cell 7 :1271_1282 (1995))的胚发生相关启动子。可选择地，使用暴露于诸如茁长素或细胞分裂素的植物激素而诱导的植物启动子以表达本发明的核酸。例如，本发明能使用大豆(Glycine max L.)中的茁长素应答元件 El 启动子片段(AuxRE) (Liu, Plant Physiol. 115 :397_407 (1997))、茁长素应答的拟南芥 GST6启动子(也应答水杨酸和过氧化氢)(Chen，Plant J. 10 :955_966 (1996))、来自烟草的茁长素诱导型 ParC 启动子(Sakai, Plant Cell Physiol. 37 :906_913 (1996))、植物生物素应答元件(Streit，Mol. Plant Microbe Interact. 10 933-937 (1997))以及对应激激素脱落酸应答的启动子(Sheen, Science 274:1900-1902(1996))。本发明也能够使用 ARR5(Brandstatter and Kieber,Plant Cell 10 1009-1019(1998))>ARR6(Brandstatter and Kieber, Plant Cell 10 :1009-1019 (1998) )、ARR2 (Hwang and Sheen, Nature 413 383-389(2001))的细胞分裂素诱导型启动子、ERFl的乙烯应答启动子(Solano et al.， Genes Dev. 12 :3703_3714 (1998))以及XVE 的 β-雌二醇诱导型启动子(Zuo et al. ,Plant J 24 265-273(2000))ο暴露于诸如除草剂或抗生素的能应用于植物的化学试剂而诱导的植物启动子也能用于表达本发明的核酸。例如，能使用苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2 2启动子(De Veylder, Plant Cell Physiol. 38 568-577 (1997))以及地塞米松应用诱导的糖皮质激素受体蛋白融合的启动子(Aoyama，Plant J. 11 =605-612(1997));不同的除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和枝条顶端分生组织中的表达。 所述核酸的编码序列还能受例如，诸如含有Avenasativa L.(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物所述的四环素诱导型启动子或水杨酸应答元件(Stange，Plant J. 11 1315-1324(1997))的调控。3.组织特异性启动子可选择地，植物启动子可以指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达(组织特异性启动子)。组织特异性启动子是转录调控元件，其仅在植物发育的特定时间在特定细胞或组织中有活性，例如在营养组织或生殖组织中。受发育调控的组织特异性启动子的实例包括仅在(或仅主要在)某些组织中起始转录的启动子，例如诸如在根、叶或茎的营养组织或诸如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊、花、 花药的生殖组织或任何胚性组织。生殖组织特异性启动子可以是，例如，胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子和种皮特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性、 花药特异性或其某些组合的。合适的种子特异性启动子源自下述基因来自玉米的MACl (Sheridan, Genetics 142 1009-1020(1996)),来自玉米的 Cat3(GenBank No. L05934, Abler Plant Mol. Biol. 22 :10131-10138 (1993))、来自拟南芥的胎萌基因-I (vivparous-1) (Genbank No.U93215)、来自拟南芥的 atmycl(Urao，Plant Mol. Biol. 32 571-576 (1996) ；Conceicao Plant5 :493_505 (1994))、来自甘蓝型油菜的 napA 和 BnCysPl (GenBank No. J02798, Josefsson, JBL 26 12196-12201(1987), Wan et al.，Plant J 30:1-10(2002))以及来自甘蓝型油菜的napin基因家族(Sjodahl，Plantal97 :264_271 (1995))。果实特异性启动子包括来自CYP78A9基因的启动子(Ito and Meyerowitz, Plant Cell 12: 1541-1550(2000))。还能使用Reiser，Cell 83 :735_742 (1995), GenBank No. U39944 所述的胚珠特异性 BELl 基因。还参见 Ray，Proc. Nat I .Acad. Sci. USA91 :5761_5765 (1994)。卵细胞和中央细胞特异性FIEl启动子也是有用的生殖组织特异性启动子。萼片和花瓣特异性启动子也用于以生殖组织特异性的方式表达本发明的核酸。例如，拟南芥花同源异型基因APETALAl(API)编码推定的转录因子，其表达于幼花原基，并随后局限于萼片和花瓣(参见，例如，Gustafson Brown, Cell 76:131-143(1994) ；Mandel, Nature 360:273-277(1992))。对于AP2，其是花轮中的萼片和花瓣的正常发育所必需的花同源异型基因，相关的启动子也是有用的(参见，例如Drews，Cell 65 =991-1002(1991)； Bowman, Plant Cell 3:749-758(1991))。其它有用的启动子是调控拟南芥的非寻常的花器官(Ufo)基因的启动子，所述基因的表达被限制在萼片与花瓣原基之间的结合处 (Bossinger，Development 122 :1093_1102 (1996))。在玉米中鉴定了花粉特异性启动子(Guerrero, Mol. Gen. Genet. 224 161-168(1990))。例如，Wakeley，Plant Mol. Biol. 37 187-192 (1998) ；Ficker, Mol. Gen. Genet. 257 :132-142(1998) ；Kulikauskas, PlantMol. Biol. 34 :809_814(1997) ；Treacy, Plant Mol. Biol. 34 :603-611 (1997)描述了特定地表达于花粉中的其它基因。雌蕊和长角果瓣、花序分生组织、茎生叶以及茎和花梗的维管系统特异性的启动子包括来自 FUL 基因的启动子(Mandel and Yanofsky,Plant Cell，7 :1763-1771 (1995))。 发育中的心皮、胎座、隔膜和胚珠的特异性的启动子也用于以组织特异性方式表达LEC2核酸。所述启动子包括来自SHPl和SHP2基因的启动子(Flanagan et al.，Plant J 10: 343-353(1996)，Savidge et al. , Plant Cell 7(6) :721_733 (1995))。花药绒毡层特异性启动子可以来自 TA29 基因(Goldberg et al. , Philos Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :5-17(1995))。其它合适的启动子包括来自编码胚贮藏蛋白的基因的启动子。例如，能使用来自甘蓝型油菜的编码2S贮藏蛋白的基因(Dasgupta，Genel33 :301_302 (1993))、来自拟南芥的2s种子贮藏蛋白基因家族、来自甘蓝型油菜的编码油质蛋白20kD的基因 (GenBank No. M63985)、来自大豆的编码油质蛋白A的基因(Genbank No. U09118)和编码油质蛋白B的基因(Genbank No. U09119)、来自拟南芥的编码油质蛋白的基因(Genbank Νο·Ζ17657)、来自玉米的编码油质蛋白18kD的基因(GenBank No. J05212, Lee, Plant Mol. Biol. 26 1981-1987(1994))以及来自大豆的编码低分子量富硫蛋白的基因(Choi, Mol. Gen. Genet. 246 :266_268 (1995))。来自马铃薯的组织特异性E8启动子具体地用于指导基因表达，从而使期望的基因产物位于果实中。合适的启动子还可以包括那些来自在维管组织中表达的基因的启动子，所述基因例如，ATHB-8、AtPINk AtP5Kl或TED3基因 (Baima et al. , Plant Physiol. 126 :643_655(2001), Galaweiler et al. , Science 282 2226-2230(1998), Elge et al. , Plant J. 26 :561_571 (2001), Igarashi et al. , Plant Mol. Biol. 36 :917_927(1998))。能使用在果实成熟、衰老和叶脱落以及较轻程度的花脱落期有活性的马铃薯启动子(Blume，Plant J. 12 :731_746 (1997))。其它示例性的启动子包括编码雌蕊特异性碱性内切几丁质酶(Ficker, Plant Mol. Biol. 35 :425_431 (1997))的马铃薯(Solanum tuberosum L.) SK2基因的雌蕊特异性启动子、在转基因苜蓿的营养性和花枝条顶端的表皮组织中有活性的来自豌豆(Piisum sativum cv. Alaska)的Blec4基因的启动子。这使所述启动子成为将外源基因的表达靶向生长活跃的枝条的表皮层的有用工具。各种特定地在诸如叶、茎、根和块茎的营养组织中有活性的启动子能用于表达本发明的方法所用的核酸。例如，能使用调控块茎蛋白(patatin)的启动子，所述块茎蛋白是马铃薯块茎的主要贮藏蛋白，例如，Kim, Plant Mol. Biol. 26 =603-615(1994) ；Martin, Plant J. 11 :53-62 (1997)。还能使用在根中表现出高活性的毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的 ORF 13 启动子(Hansen，Mol. Gen. Genet. 254 :337_343 (1997))。其他有用的营养组织特异性启动子包括编码来自大芋头(major taro, Colocasia esculenta L. Schott)球莖蛋白家族的球蛋白的基因 tarin (Bezerra, Plant Mol. Biol. 28 137-144(1995))的tarin启动子、在芋头球茎发育期间有活性的仙茅甜蛋白启动子(de Castro7Plant Cell4 =1549-1559(1992))以及表达局限于根分生组织和未成熟的中柱区域的烟草根特异性基因 TobRB7 的启动子(Yamamoto, Plant Cell3 :371_382 (1991))。能使用诸如二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)启动子的叶特异性启动子。例如，番茄RBCSI、RBCS2和RBCS3A基因表达于叶和光下生长的幼苗中，只有RBCSl和RBCS2表达于发育中的番茄果实中(Meier，FEBS Lett. 415 :91_95 (1997))。能使用如Matsuoka， Plant J.6 311-319(1994)所述的几乎只高水平地表达于叶片和叶鞘的叶肉细胞中的二磷酸核酮糖羧化酶启动子。另一叶特异性启动子是捕光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子， 参见，例如，Shiina, Plant Physiol. 115 :477_483 (1997) ；Casal, Plant Physiol. 116 1533-1538(1998)。Li, FEBS Lett. 379 :117-121(1996)所述的拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb相关基因启动子(Atmyb5)是叶特异性的。所述Atmyb5启动子表达于发育中的叶毛状体、托叶、以及幼莲座叶和茎生叶边缘的表皮细胞以及未成熟的种子中。 Atmyb5mRNA出现在受精和胚发育的16细胞期之间，并且持续超过心形期(heart stage)。 还能使用Busk, Plant J. 11 1285-1295 (1997)在玉米中鉴定的叶启动子。另一类有用的营养组织特异性启动子是分生组织(根尖和枝条尖)启动子。例如， 能使用 Di Laurenzio,Cell 86:423-433(1996)和 Long,Nature 379:66-69(1996)所述的 “ SH00TMERISTEMLESS ”和“ SCARECROW”启动子，其在发育中的枝条或根尖分生组织中是有活性的。另一有用的启动子是调控3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因的表达的启动子，所述基因的表达限于分生和花(柱头的分泌区、成熟花粉粒、雌蕊群维管组织和受精胚珠)组织(参见，例如，Enjuto，Plant Cell. 7 :517_527 (1995))。来自玉米和表现出分生组织特异性表达的其它物种的knl相关基因也是有用的,参见,例如，Granger, Plant Mol. Biol.31 :373-378(1996) ；Kerstetter, Plant Cell 6 1877-1887(1994) ；Hake, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350 :45_51 (1995)。例如，拟南芥KNATl 或KNAT2 启动子。在枝条尖中，KNATl转录子主要局限于枝条顶端分生组织；KNAT1在枝条分生组织的表达在花转换期降低并限于花序茎的皮层(参见，例如，Lincoln，Plant Cell6 :1859-1876 (1994))。技术人员会理解，组织特异性启动子可以驱动可操作地连接的序列在除靶组织外的组织中的表达。因此，如本文所用的，组织特异性启动子是优先驱动在靶组织中的表达、 但也可以导致在其它组织中的某些表达的启动子。在另一实施方案中，本发明所述的核酸通过转座元件表达。这允许组成型活性多肽的组成性但定期和罕见的表达。本发明还提供了来自病毒的组织特异性启动子的用途， 所述启动子可以包括，例如，烟草花叶病毒亚基因组启动子(Kumagai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 =1679-1683 (1995));仅在被感染的水稻植物的韧皮部细胞中复制的水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus) (RTBV),其启动子驱动强烈的韧皮部特异性报道基因的表达；木薯叶脉花叶病毒(CVMV)启动子，其在维管元件、叶肉细胞以及根尖中具有最高的活性(Verdaguer, Plant Mol. Biol. 31 :1129-1139 (1996))。F.转基因植物的制备在另一方面，本发明提供了包含重组表达盒的转基因植物，所述表达盒包含可操作地连接至诸如ERS (例如，SEQ ID NO :1所示)或ETR(例如，SEQ ID NO :3或5所示) 的编码乙烯受体的核酸序列的启动子序列，其中所述分离的核酸与所述多核苷酸序列至少 90%相同。可选择地，分离的核酸是SEQ ID NO :1、3或5的截断突变体。可以通过各种常规技术将本发明的DNA构建体导入期望的植物宿主的基因组中。 例如，可以利用诸如植物细胞原生质体的电穿孔和微注射的技术将DNA构建体直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者利用诸如DNA粒子轰击的生物导弹法将DNA构建体直接导入植物组织中。微注射技术在本领域是已知的，并且在科学和专利文献中被详细地描述。 Paszkowski et al. Embo J. 3 =2717-2722 (1984)中描述了利用聚乙二醇沉淀法导入 DNA 构建体。Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :5824 (1985)中描述了电穿孔技术。Klein et al. Nature 327:70-73(1987)中描述了生物导弹转化技术。可选择地，可以将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区组合并导入常规根癌农杆菌宿主载体中。当细胞被根癌农杆菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒力功能将指导所述构建体及邻近的标志物插入植物细胞的DNA中。科学文献中详细描述了根癌农杆菌介导的转化技术，其包括双元载体(binary vector)的消除和使用。参见，例如，Horsch et al. Science 233:496-498(1984)和 Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 4803 (1983)以及 Gene Transfer to Plants (向植物的基因转移)，Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)。可以培养源自任何上文的转化技术的转化的植物细胞以再生完整的植物，所述植物具有转化的基因型并且因此具有期望的表型，例如降低的法尼酰基转移酶活性。这种再生技术依赖于对组织培养生长培养基中的某些植物激素的调控，通常依赖于与期望的核苷酸序列共同导入的生物杀伤剂和/或除草剂标志物。Evans et al. , Protoplasts Isolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture(原生质体分离和培养,植物细胞培养手册)，ΡΡ· 124-176,MacMillilan Publishing Company,New York, 1983和Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts (植物、植物原生质体的结合和再生)， pp. 21-73，CRC Press, Boca Raton，1985中描述了来自培养的原生质体的植物再生。还能从植物胼胝体、外植体、器官或其部分获得再生。Klee et al. ,Ann. Rev,ofPlant Phys. 38 467-486(1987)中全面地描述了这种再生技术。本发明的核酸可以用于赋予包含玉米在内的基本上任何植物期望的特性。因此，本发明能用于包括来自以下属的物种在内的多种植物腰果属(Anacardium)、花生属 (Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠爺属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、 衣藻属(Chlamydomonas)、小球藻属(Chlorella)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、 辣椒属(Capsicum)、红蓝菊属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、贯众属(Cyrtomium)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、甘吻沙蚕属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属 (Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、直菪属(Hyoscyamus)、莴苣属 (Lactuca)、昆布属(Laminaria)、亚麻属(Linum)、毒麦属(Lolium)、羽扇豆属(Lupmus)、番施属(Lycopersicon)、大囊伞属(Macrocystis)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、墨角兰属(Majorana)、苜猜属(Medicago)、海囊藻属(Nereocystis)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、紫萁属(Osmunda)、黍属(Panieum)、皇竹草属(Pannesetum)、 鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属 (Pyrus)、水龙骨属(Polypodmm)、楼桃属(Prunus)、蕨属(Pteridium)、萝卜属(Raphanus)、 蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、欧白芥属(Sinapis)、爺属 (Solanum)、高梁属(Sorghum)、可可属(Theobromus)、葫芦巴属(Trigonella)、小麦属 (Triticum)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、紅豆属(Vigna)以及玉米属(Zea)。G.本发明的转基因植物的检测本发明提供了调节植物中乙烯受体活性的方法。在某些实施方案中，所述方法还包括选择在其生殖植物结构中具有延迟的衰老表型的植物。在某些实施方案中，所述生殖结构是种子。在某些实施方案中，所述表型是一粒种子中有多个胚。在某些实施方案中，通过有性杂交导入构建体。在某些实施方案中，筛选还包括检测具有期望的表型的植物。例如，可以检测叶的颜色以确定植物的光合作用寿命是否已经被影响。具有延长的光合作用生命周期的植物的特征是与野生型植物相比，叶在更长的时间段内保持绿色。另外，能利用已熟知的技术测量叶绿素水平和CO2同化作用。可以检测植物的营养和生殖结构的大小以确定这些结构是否大于或小于野生型植物营养和生殖结构。本发明的转基因植物可以具有更大的果实、胚珠、 种子、花粉、胚芽组织、花、诸如雌蕊、雄蕊、萼片、花瓣、心皮的花的部分、叶、茎、块茎、根、维管组织、原维管组织或者根或茎分生组织。可以检测得到的转基因植物的增加的耐旱性。检测增加的耐旱性的方法是已知的，所述方法包括测量转基因植物的蒸腾速率、气孔通导率、 分离的叶检测中的失水速率或检查叶的膨胀。例如，蒸腾速率降低的植物具有增加的耐旱性。还能通过测试植物在更高的密度下生长的能力来选择乙烯敏感性降低的植物。不论何种选择方法，具有这种乙烯抗性表型的植物有利地在高密度下种植。类似地，不论何种选择方法，具有乙烯抗性表型的植物有利于在干旱条件下种植。还能通过检测存在的例如标志物基因的生物标志物来选择乙烯敏感性降低的植物。标志物基因通常提供容易检测到的与滞绿表型共分离的表型，其可以不是直接检测到的表型。还能通过“三重反应”表型观察乙烯敏感性，所述“三重反应”包含下胚轴的径向膨胀、根和下胚轴延长的抑制以及顶端倒刺的扩大(exaggeration) (Neljubow(1901), Pflanzen Beih. Bot. Zentralbl.，10 :128_139)。引起组成型乙烯信号传导的突变体的特征在于与野生型植物相比，高度降低(Guzman and Ecker (1990), Plant Cell, 2 513-523 ； Kieber et al. (1993)Cell 72:427-441)。相反地，可以通过延迟的黑暗诱导的叶绿素损失和/或植物体积的增加来观察乙烯的不敏感性。即便与生长于最佳条件，即没有可能在封闭的生长设施中累积的痕量水平乙烯的条件下的野生型植物相比，乙烯不敏感性植物可以更大。然而，本领域的技术人员应当了解，乙烯应答根据植物物种和环境条件变化。利用标准分析可以方便地检测滞绿表型。 例如，能使用黑暗诱导的衰老分析。这些分析通常包括覆盖仍然连接在植物上的叶片达一周。光的缺乏诱导叶的衰老，在本发明的植物中，与对照相比，所述叶的衰老能被延迟。检测转基因植物的生化方法也是熟知的，例如，检测诸如插入到转基因构建体的报道基因的生物标志物的表达，或转基因核酸序列或蛋白序列在植物中的表达。本领域技术人员熟知检测和定量mRNA和蛋白质的方法，例如，RNA印迹法(Northern Blot)、PCR、蛋白印迹法(Western Blot)以及活性检测。例如，向植物中导入表达盒后，基于转基因的存在筛选植物并使所述植物与近交或杂交系杂交。然后基于转基因的存在筛选后代植物并使所述后代植物自花传粉。栽培自花传粉植物的后代。检测产生的转基因植物的任何与改变的乙烯相关过程有关的表型特征，例如，与滞绿特性或延迟的衰老有关的特征。例如，使用本发明的方法，抑制本发明所述的核酸或蛋白可以延迟营养或生殖植物结构细胞中的衰老。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例的目的，并且本领域的技术人员会想到所述实施例和实施方案的各种变型或变化，所述变型或变化包括于本申请的精神和范畴内并在所附的权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都在此通过弓I用的方式整体并入本文用于所有目的。
实施例在下文简述的方法中使用了标准方法。实施例I :拟南芥etrl-Ι在玉米中的表达导致延迟的乙烯应答构建体设计和植物转化上文已经描述了拟南芥etrl-Ι突变体。所述突变体是导致乙烯不敏感性的显性负性突变体乙烯受体。通过胚发生的A 188 X B73 (HiII)胼胝体的粒子轰击(Gordon-Kamm et al. (1990)，Plant Cell, 2 :603_618)产生转基因玉米，所述转基因玉米含有受pACH18 中的玉米泛素(Ub)启动子调控的小麦拟南芥etrl-1 (Christensen and Quail (1996), Transgenic Res. ,5 :213_218)。与bar基因的共转化提供了转化的胼胝体的双丙氨磷选择 (De Block et al. (1987) EMBO J. 6 :2513_2518)。利用 PCR 鉴定含有 Ub-etrl-Ι 构建体的再生物。结果为了确定引入乙烯不敏感性状态是否能改变玉米中乙烯介导的事件，在温室条件下栽培表达受玉米泛素(Ub)启动子调控的拟南芥etrl-Ι的转基因玉米株系。通过PCR证实含有etrl-Ι转基因的Tq子代的叶表现出改变的生长表型。为了检测etrl_l转基因的表达是否导致叶衰老或滞绿表型的改变，覆盖仍然连接在植物上的来自成体Ttj代植物的叶6 和叶7以避免光到达叶子达一周。光的缺乏通常诱导称为黑暗诱导的衰老的叶衰老，并且通常用作滞绿潜力的量度。表达etrl-Ι的转基因叶表现出延迟的叶衰老,这表明玉米的乙烯不敏感性状态导致滞绿表型。这些结果证明通过表达显性负性突变乙烯受体，例如，实施第二跨膜中的 Cys至Tyr的突变或有类似效果的其它突变构建玉米的乙烯不敏感性状态能改变诸如叶老化和衰老的乙烯介导的过程。实施例2 :拟南芥中显性负性ZmERSl和ZmETR2的表达导致乙烯不敏感性然后，我们着手确定突变的玉米乙烯受体的表达是否以相同的方式在拟南芥中导致乙烯不敏感性。构建体设计和植物转化根据实施例I中所述的方法，使用PBI121构建体转化拟南芥。所述构建体包含可操作地连接至下述编码序列中的一个的35S启动子ein2_5 (Alonso et. al. (1999) Science 284 :2148_52中描述的乙烯不敏感性拟南芥突变)、突变体ZmERSl或突变体 ZmETR2 (ZmETR40)。ZmERSl和ZmETR2突变体是显性负性乙烯受体(不结合乙烯)，并且本文描述了其序列。使用野生型植物作为乙烯敏感性对照(表示为WT)。在乙烯的前体ACC 上的发芽抑制了幼苗的生长。通过使转化株避光在含有20 μ M ACC的培养基上发芽来筛选乙烯不敏感性转化株。选择ZmERSl转化株的三种独立株系(指定为MS1-11、MS2-12和 MS1-15)和ZmETR2转化株的三种独立株系(指定为MT2_4、MT2_5或MT2-9)用于另外的试验。结果
20
为了表示突变的ZmETR2和ZmERSl乙烯受体提供了乙烯不敏感性状态，使所述突变体株系在含有20 μ M ACC的培养基或含有20 μ MAg的培养基上发芽，这以化学方法在拟南芥中提供了乙烯不敏感性状态。数据显示，表达突变体ZmERSl或ZmETR2的种子是乙烯不敏感性的，因为它们没有对乙烯表现出典型的“三重应答”，而是表现出长、薄的下胚轴并且没有顶端倒刺。对于乙烯不敏感性突变体ein2-5观察到了类似的结果。相比之下，野生型幼苗表现出对乙烯的典型应答。在存在Ag的条件下,WT幼苗也是乙烯不敏感性的。5天大的幼苗的定量测量示于表I中(除非另外说明，否则P < O. 001)。这些数据表明突变的 ZmERSl和ZmETR2乙烯受体能在拟南芥中提供乙烯不敏感性。表I突变的ZmERSl和ZmETR2受体的表达在拟南芥中提供乙烯不敏感性为了检测提供的乙烯不敏感性随一系列ACC浓度变化的水平，使来自一个ZmERSl 株系(MSl-Il)和一个ZmETR2株系(MT2-9)的种子在含有不同水平ACC(从I. O μ M至 20 μ Μ)的培养基上发芽。突变的乙烯受体的表达在ACC浓度范围内提供了乙烯不敏感性。 在更高的ACC浓度下，达到的乙烯不敏感性水平出现些许下降，但仍显著高于WT幼苗中的乙烯不敏感性水平。定量测量示于图I中。当使幼苗于光下在20 μ M ACC上发芽时，也能表现出乙烯不敏感性。WT幼苗表现出不膨胀的子叶，而表达突变ZmERSl或ZmETR2的株系与乙烯不敏感性突变体ein2_5类似。随后于光下在10 μ M ACC上的生长显示，WT幼苗显著小于生长于Ag上的WT幼苗，而表达突变ZmERSl或ZmETR2的株系与生长于Ag上的WT幼苗或ein2_5乙烯不敏感性突变体类似。表达突变ZmERSl或ZmETR2的植物还具有更大的叶子面积，这与ein2_5和etrl_l 乙烯不敏感性突变体类似。在7周龄时，表达突变ZmERSl或ZmETR2的植物表现出延迟的叶衰老和滞绿表型，这与ein2-5观察到的情况类似。当在第4周进行检测时，观察到的叶绿体含量的差别很小(表2)。然而，表达突变ZmERSl或ZmETR2的植物表现出开花的某种
20111 Vl At (
下胚轴长/I (mm)
根长度
(mm)
τ胚轴长度 (mm)
根长度
(mm)
WT
5.0^0.71
.00 ± ] .03
J4.7 土 1.1:
7.43 .士 2.63
11,0士3.13
6.69 土 1.41
6—27工 1.93 P = 0.371
MT2-4
14’:
1.61
14.4 士 1.()7
13.8
6.05 士 I,
13.0 ±320
4.87^ ，1611.
2.87
6,27 士 ] .76
12.1 ^ 2.40
7.33 ± LHl
I) = 0.122
.39 ± 1.27
7.07 ± 1.58 P = 0.354延迟，以及由此叶数目的增加。表2 :表达突变玉米乙烯受体的拟南芥的表型
权利要求
1.分离的多核苷酸，其编码不结合乙烯的乙烯受体多肽，其中(a)所述不结合乙烯的乙烯受体多肽包含与SEQID NO :6至少95%—致的序列，其中第102位的氨基酸不是半胱氨酸；并且(b)所述不结合乙烯的乙烯受体多肽的表达产生植物的滞绿表型。
2.如权利要求I所述的多核苷酸，其中所述多肽序列是SEQID N0:6。
3.如权利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :5的序列。
4.重组表达盒，其包含可操作地连接至权利要求I所述的多核苷酸的启动子序列。
5.转基因植物，其包含权利要求4所述的表达盒，其中所述植物具有滞绿表型。
6.如权利要求5所述的转基因植物，其中所述植物是谷物植物。
7.如权利要求5所述的转基因植物，其中所述植物是玉米。
8.降低植物中乙烯敏感性的方法，其包括下述步骤(a)导入表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的权利要求I所述的分离的多核苷酸；以及(b)选择乙烯敏感性降低的植物。
9.在植物中产生滞绿表型的方法，其包括下述步骤(a)导入表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的权利要求I所述的分离的多核苷酸；以及(b)选择具有滞绿特征的植物。
10.如权利要求9所述的方法，其中基于增加的光合作用能力选择所述植物。
11.如权利要求9所述的方法，其中基于一粒种子中有多个胚的表型选择所述植物。
12.如权利要求9所述的方法，其中基于延迟的衰老选择所述植物。
13.如权利要求9所述的方法，其中基于所述生物标志物的检测选择所述植物。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述植物是谷物植物。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述植物是玉米。
全文摘要
通过靶向的乙烯信号传导的减少来增加谷物产量，本发明涉及植物遗传工程。具体地，本发明涉及通过抑制乙烯产生绿叶并增加产量。本发明的组合物与方法涉及干扰乙烯信号传导的显性负性乙烯受体。
文档编号C12N15/63GK102604964SQ201210057248
公开日2012年7月25日 申请日期2008年7月18日 优先权日2007年7月19日
发明者丹尼尔·R·加利 申请人:加利福尼亚大学董事会