通过改进谷物产量和品质增加谷物价值的方法

专利名称:通过改进谷物产量和品质增加谷物价值的方法
通过改进谷物产量和品质增加谷物价值的方法
发明背景 发明领域
本发明涉及表达转基因柠檬酸合酶(⑶)的转基因植物和使用方法。与同基因品 系对照(isoline control)相比较时，表达转基因CS的转基因植物、特别是在种子中表达 或在种子中表达并进一步靶向细胞区室如质体时的转基因植物具有更高水平的谷物产量 和/或氨基酸、尤其半胱氨酸、和/或油，其中所述的同基因品系对照不含有与种子偏好的 启动子连接或还与细胞区室靶向序列有效连接的转基因。
背景技术：
禾谷植物谷粒是人和动物的最重要可再生能量来源之一。随着世界人口增加并且 可耕地有限，对食物、饲料、纤维和生物燃料的需求正在增加。增加每英亩谷物产量和增强 每英亩谷物营养价值以满足这些需求是必需的和非常宝贵的。由于超过90%的谷物粒现 今用于动物饲料和乙醇生产，谷物是动物营养的最重要作物之一。黄色凹陷谷物的谷粒由 60-70%淀粉、8-10%蛋白质和3-4%油组成。但是，即便含有这些有价值的饲料组分，黄色 凹陷谷物不含有充分的热量和必需氨基酸以支持大多数动物中的最佳生长和发育。因此， 为弥补这些缺点，需要用其他养分补充基于黄色凹陷谷物的饲料。最常见地，黄色凹陷谷物 与豆粕混合以改善饲料的氨基酸组成。不幸地，动物缺少消化豆粕中存在的非淀粉基于的 多糖必需的酶，并且谷物和大豆饲料混合物产生高的粪便体积。此外，豆粕昂贵。另外，为 改进热量含量，基于谷物的动物饲料也用脂肪补充，如动物内脏和饲料级动物脂肪和植物 脂肪，所述的脂肪可以包括餐馆、制皂和精炼工业的副产品。使用动物下水来补充牛饲料已 经停止了，因为它与有关牛海绵状脑病和克-雅氏病有关。改善谷物产量和谷物粒的营养 品质将增加每英亩价值、每英亩能量，并且改善饲料效率并减少对环境的影响和与肉生产 相关的其他成本。
呼吸作用，包括三羧酸(TCA)循环，不仅提供用于合成贮藏化合物的能量，还产生 用于油和氨基酸生物合成的中间体。柠檬酸合酶(⑶)催化柠檬酸从草酰乙酸和乙酰CoA形 成。这是TCA循环中的第一关键步骤，所述的TCA循环通常存在于线粒体中。CS在TCA循环 和代谢中发挥重要作用。已经尝试工程化柠檬酸合酶以改进作物生产力。US2005/0137386 描述了用于获得具有改善的养分摄取能力和有毒化合物耐受性的转基因植物的方法，其 中所述的有毒化合物存在于土壤中。de la Fuente等人所做的研究显示，烟草中铜绿假 单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)柠檬酸合酶基因的表达提高铝耐受性(Science 276 1566-1568，1997)。Lopez等人报道了因有机酸增溶磷酸盐的低可溶形式所致增强的磷摄取 (Nature Biotech 18 :450_453，2000)。但是，这种方法似乎受环境影响，因为使用这些相同 的植物以及被工程化表达柠檬酸合酶基因至更高水平的植物，另一个研究小组不能够重复 这些研究结果(Delhaize 等人 Plant Physiology 125 :2059-2067,2001)
WO 2004/056968公开了通过近红外光谱法测量时，与非转基因对照相比较，拟南芥属(Arabidopsis)柠檬酸合酶基因(At3g58750)的过量表达引起籽油增加多 达7%。美国专利申请公开号2003/0233670和2005/0108791公开了来自苛养木杆菌 (Xyllelafastidia)、大肠杆菌(E. coli)、稻、玉米和大豆的柠檬酸合酶和它们在改善转基 因植物的磷酸盐摄取中的用途。已经报道了过量表达线粒体形式和胞质形式的柠檬酸合酶 改善模型植物中的磷酸盐摄取(Lopez-Bucio等人，2000 ;Kayama等人，2000)。但是，存在 以下报道烟草中铜绿假单胞菌柠檬酸合酶基因的表达与增强的柠檬酸积累或流出不相关 (Plant Physiology，2001，第125卷2059-2067)。所述作者提出植物中的CS表达不太可 能是用于增强作物的铝耐受性和磷营养的有力和轻易可再现策略。
尽管结合的氨基酸(蛋白质组成)占据谷物种子中90-99%的总氨基酸，但是游 离氨基酸占据1-10%的总氨基酸。存在进一步增加必需氨基酸含量的严重挑战。一个挑 战是增加游离氨基酸浓度不总是导致总氨基酸增加，因为游离氨基酸流和掺入蛋白质可以 变得有限的。再者，游离氨基酸的积累经常与不利的农艺性能如矮化生长(因而影响销售 性)相关。从营养品质角度看，理想谷粒将是具有改善含量的油、蛋白质和必需氨基酸如缬 氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和/或精氨酸的谷粒。
持续存在对增加的谷物产量和对下述植物谷粒的需求，其中所述的植物谷粒具有 想要的农艺特征和提高的必需氨基酸、蛋白质或油水平。
发明概述
本发明提供了在转基因植物种子中或在种子的胞内区室中表达编码柠檬酸合酶 (CS)蛋白的基因的转基因植物和其部分，其中与不以这种方式表达转基因柠檬酸合酶蛋白 的同基因品系(isoline)植物或种子相比较时，该CS赋予更高水平的谷物产量和/或更高 水平的氨基酸(如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、苏氨酸、赖氨酸和/或缬氨酸)和/或油。 本发明也包括使用本文中所述多核苷酸和载体以赋予所得转基因植物和其部分经济重要 性状的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了转基因植物和其部分，其包含在种子中或在种 子的胞内细胞区室中表达的编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，其中多核苷酸选自由以下多 核苷酸组成的组a)具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的 多核苷酸；b)编码具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、对或25中所定义序列的多肽的 多核苷酸；c)与具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核 苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；d)编码与具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、 23,24或25中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；e)在严格 条件下与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、13、14或15中所定义序列的多核苷酸杂交 的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、对或25中所 定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多 核苷酸。前述转基因植物的额外实施方案提供了该植物是单子叶植物或双子叶植物，或更 具体地，该植物选自由玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大 豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花 椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。前述转基因植物的又一实施方案 提供了，其中该多核苷酸的表达能够赋该植物经济相关的性状并进一步其中该经济相关性 状选自由以下性状组成的组油含量超过同基因品系油含量增加至少2%、半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量增加至少4%和每英亩蒲式耳产量超过同基因品系每英亩蒲 式耳产量增加至少3蒲式耳。前述转基因植物的另一个实施方案提供其中植物在谷物产量 上具有超过同基因品系谷物产量的每英亩约3-19蒲式耳增加。
另一个实施方案提供前述转基因植物的种子，其中(a)该种子在选自由苏氨酸、 半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸方面具有超 过所述氨基酸在同基因品系中量的至少3%增加；或(b)该种子在半胱氨酸含量方面具有 超过同基因品系半胱氨酸含量的约4%-27%增加；或(c)该种子在甲硫氨酸含量方面具有 超过同基因品系甲硫氨酸含量的约2%-13%增加；或(c)该种子在油含量方面具有超过同 基因品系油含量的2%-10%增加。其他实施方案提供了从前述转基因植物产生的种子，其 中该种子包含所述多核苷酸，并且又一实施方案提供了其中该多核苷酸在种子中的表达赋 予该种子不以同基因品系中相同水平存在的经济相关性状。
在另一个实施方案中，本发明提供了在所述种子中表达CS基因的转基因植物种 子，其中所述种子包含农艺或营养重要的经济相关性状，其选自由以下性状组成的组
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多至少4%的半胱氨酸；
C)谷物产量超过同基因品系增加至少3蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子 具有至少4%的半胱氨酸增加和至少2%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多至少4%的半胱氨酸和多至少2%的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中 该方法包括步骤:A)将包含与多核苷酸有效连接的种子偏好转录调节元件的表达载体导 入该植物，其中该多核苷酸编码能够赋予经济相关性状的多肽并且其中该多核苷酸选自由 以下多核苷酸组成的组
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷 酸；
b)编码具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的
多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核
苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO 16、17、18、19、22、23、24或25中所定 义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸，和B)选择具有经济相关性状的转 基因植物。
本发明的另一个实施方案提供了在种子的胞质中过量表达活性异源柠檬酸合酶的转基因植物和其部分，其中分离的CS蛋白被选自由以下多核苷酸组成的组中的多核苷 酸编码
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷 酸；
b)编码具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的
多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核
苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定 义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的又一实施方案提供了包含与多核苷酸有效连接的种子偏好转录调节元 件的表达载体，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组成的组
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷 酸；
b)编码具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的
多核苷酸；
c)与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核
苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸；
d)编码与具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在严格条件下与具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；
f)在严格条件下与编码具有如SEQ ID NO 16、17、18、19、22、23、24或25中所定
义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸；和
g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
该表达载体还可以与胞内靶向序列有效连接。另外，表达载体的种子偏好转录调 节元件可以是胚乳偏好的启动子。本发明人确定了活性异源CS在种子的质体或胞质中的 靶向表达有效增加谷物产量和/或增加谷物养分含量如必需氨基酸半胱氨酸。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中 该方法包括步骤:A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核 苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一 个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品系种子多至少4%的半胱氨酸；
C)谷物产量超过同基因品系增加至少3蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种子 具有至少4%的半胱氨酸增加和至少2%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加至少3蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多至少4%的半胱氨酸和多至少2%的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中 该方法包括步骤:A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核 苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一 个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多约4-27%的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加约3-19蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种 子具有约4-27%的半胱氨酸增加和约2-18%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-19蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多约4-27%的半胱氨酸和多约2-7%的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中 该方法包括步骤:A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核 苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一 个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组
a)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳；
b)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多约4-15%的半胱氨酸；
c)谷物产量超过同基因品系增加约3-10蒲式耳/英亩并且种子比同基因品系种 子具有约4-15%的半胱氨酸增加和约2-10%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物产量超过同基因品系每英亩增加约3-10蒲式耳并且种子具有比同基因品 系种子多约4-15%的半胱氨酸和多约2-5%的油。
本发明的另一个实施方案涉及产生具有经济相关性状的转基因植物的方法，其中 该方法包括步骤:A)将包含如上所述的本发明多核苷酸的表达载体导入植物，其中该多核 苷酸的表达赋予该植物经济相关性状；和B)选择具有该经济相关性状的转基因植物。在一 个实施方案中，转基因植物的经济相关性状选自由以下性状组成的组
a)油含量超过同基因品系油含量的至少2%增加；
b)半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量的至少4%增加；
c)半胱氨酸含量超过同基因品系半胱氨酸含量的约4% -27%增加；
d)在选自由苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和精氨酸组成的组中的 一种或多种氨基酸方面超过所述氨基酸在同基因品系中量的至少约3%增加；和
e)种子中的油含量超过同基因品系种子中油含量的约2-10%增加。
本发明的另一个实施方案是由任一前述方法产生的转基因植物和其部分。
附图简述[0065]图la-b显示基因和元件以及相应的SEQ ID NO。
图 2 显示 AnaCS (SEQ ID NO 19)、大肠杆菌 CSl (SEQ ID NO 16)、玉米 CSl (SEQ ID NO :24)、玉米 CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 CS (SEQ IDNO :20)、稻 CSl (SEQ ID NO :22)、稻 CS2 (SEQ ID NO :23)、酵母 CS1(SEQID NO :17)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :18)的蛋白质序列总 体同一性/相似性百分数。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10， 空位延伸罚分=0. 05，空位分离罚分=8)。
图 3 显示 AnaCS (SEQ ID NO 19)、大肠杆菌 CSl (SEQ ID NO 16)、玉米 CSl (SEQ ID NO :24)、玉米 CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 CS (SEQ IDNO :20)、稻 CSl (SEQ ID NO :22)、稻 CS2 (SEQ ID NO :23)、酵母 CS1(SEQID NO :17)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :18)的蛋白质序列局 部同一性/相似性百分数。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10， 空位延伸罚分=0. 05，空位分离罚分=8)。
图 4 显示 AnaCS (SEQ ID NO :7)、大肠杆菌 CSl (SEQ ID NO 1)、玉米 CSl (SEQ ID NO :14)、玉米 CS2(SEQ ID NO 15)、南瓜 CS (SEQ ID NO :9)、稻 CSl (SEQ ID NO: 12)、稻 CS2 (SEQ ID NO :13)、酵母 CSl (SEQ ID NO :3)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :5)的 DNA 序列总体 同一性百分数。DNA分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10，空位延伸罚 分=0. 05，空位分离罚分=8)。
图5显示蛋白质鱼腥藻属_CS (SEQ ID NO 19)、大肠杆菌_CS1 (SEQID NO :16)、 玉米 _CS1(SEQ ID NO :24)、玉米 _CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS(SEQ ID N0:20)、稻_ CSl (SEQID NO :22)4S_CS2(SEQ ID NO :23)、酵母 _CS1 (SEQ ID NO 17)和酵母 _CS2 (SEQ ID NO 18)的系统发育关系。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10， 空位延伸罚分=0. 05，空位分离罚分=8)。
图6a-c 显示鱼腥藻属 _CS (SEQ ID NO 19)、大肠杆菌 _CS1 (SEQ IDNO :16)、玉米 _ CSl (SEQ ID NO :24)、玉米_CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20) 4S_CS1 (SEQ ID NO :22)、稻 _CS2(SEQ ID NO :23)、酵母 _CS1 (SEQ ID NO 17)和酵母 _CS2 (SEQ ID NO 18) 的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10，空位延 伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的 氨基酸以小写字母表示。
图 7 显示玉米 _CS2 (SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20)和稻 CS2 (SEQ ID NO 23)的蛋白质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10， 空位延伸罚分=0.05，空位分离罚分=8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而 相似的氨基酸以小写字母表示。
图 8 显示玉米_CS1(SEQ ID NO :24)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20)、稻 _CS1 (SEQ ID NO :22)、酵母_CS1(SEQ ID NO :17)和酵母_CS2 (SEQ IDNO :18)的蛋白质序列比对。序歹丨J 分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10，空位延伸罚分=0. 05，空位分离 罚分=8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸以小写字母表示。
图9显示鱼腥藻属_CS (SEQ ID NO 19)和大肠杆菌_CS1 (SEQ IDNO :16)的蛋白 质序列比对。序列分析在Vector NTI9软件包中进行(空位开口罚分=10，空位延伸罚分 =0.05，空位分离罚分=8)。相同和保守的氨基酸以粗体大写字母表示，而相似的氨基酸 以小写字母表示。[0074]图IOa显示正在发育的玉米种子03DAP)中酵母CS2 (构建体CS1008)的活性。实 心正方块表示来自同基因品系对照谷物种子的天然CS活性并且空心正方块表示玉米CS峰 和酵母CS2在级分四附近的额外活性峰。图IOb显示正在发育的玉米种子03DAP)中酵 母CS1(构建体CS1012)的活性。实心正方块表示来自同基因品系对照谷物种子的天然CS 活性并且空心正方块表示玉米天然CS峰和酵母CSl在级分25附近的额外活性峰。按照以 下的相同模式实心正方块表示未转化的同基因品系中的天然玉米CS峰并且空心正方块 表示正在发育的玉米种子03DAP)中转基因CS的天然玉米CS峰和额外的活性峰；图IOc 显示酵母CSl (CS1001)在约第25级分处的活性峰，图IOd显示大肠杆菌CSl (CS 1002)在 约第33级分处的活性峰，图IOe显示大肠杆菌CSl (CS1004)在约第32级分处的活性峰，图 IOf显示鱼腥藻属CS(CS10(^)在约第30级分处的活性峰，图IOg显示鱼腥藻属CS(CS1007) 在约第30级分处的活性峰。

图11显示表达包含异源CS的多种构建体中的CS对T2种子中谷粒养分组成的影 响。
图12显示在(通过事件与专利近交种B杂交产生的)谷物杂种中表达(尤其与 种子偏好的启动子有效连接或与种子偏好的启动子和胞内靶向序列有效连接的)异源CS 对谷物产量和组成的影响(通过3-6个位置所测试的全部事件的平均数)。
图13显示在个体事件(选自对谷物产量(6个位置)和组成(来自3个位置的F2 谷粒)测试过的构建体中的两个事件)中(通过事件与专利近交种B杂交产生)的谷物杂 种中表达(尤其与种子偏好的启动子有效连接或与种子偏好的启动子和胞内靶向序列有 效连接的)异源CS对谷物产量和组成的影响。
图14显示(通过事件与专利近交种A、B和C分别杂交产生的)3个谷物杂种中表 达异源CS (大肠杆菌CSl和酵母CS》的影响。在跨越4个中西部州的12个位置测试谷物 产量。在3个位置进行F2谷粒的养分组成测试。
图15显示(通过事件与专利近交种A、B和C分别杂交产生的)3个谷物杂种中表 达异源CS(具有不同启动子和胞内靶向作用的酵母CSl)的影响。谷物产量在跨越4个中 西部州的12个位置测试。在3个位置进行F2谷粒的养分组成测试。
发明详述
可以通过参考本发明实施方案的以下详述和其中所包含的实施例更轻易地理 解本发明。除非另外说明，本文中所用的术语将根据相关领域技术人员的常规用法进 行理解。除了下文所提供术语的定义之外，分子生物学领域中常见术语的定义也可以 在 Rieger 等人，1991Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5 版，柏林 Springer-Verlag ；禾口在 CurrentProtocols in Molecular Biology, F. Μ· Ausubel 等人编 著，CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc 与 John Wiley & Sons,Inc. 之间的合资公司(1998Supplement)中找到。
在本申请书的全文范围内，参考了多种出版物。全部这些出版物及在这些出版物 中引用的那些参考文献的公开因而以全文并入本申请作为参考，以更充分地描述本发明所 属领域的状态。本申请要求美国临时专利申请60/061，231的优先权益，该文献因而通过 引用方式并入本申请。用于克隆、DNA分离、扩增与纯化、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合 酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术和多种分离技术是本领域技术人员已知并通常采用的那些技术。在 Sambrook 和 Russell，2001MolecularCloning，第 3 版，Cold Spring Harbor, Plainview, New York ;Sambrook 等人，1989Molecular Cloning,第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York ；Mani at is 等人，1982Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, Plainview, New York ；Wu (编著)1993Meth. Enzymo 1. 218，第 I 部份；Wu (编著)1979Meth Enzymo 1. 68 ;Wu 等人，(编著)1983Meth. Enzymo1. 100 和 101 ；Grossman 和 Moldave(编著)1980Meth. Enzymol. 65 ；Miller(编 著)1972Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ；Old 和 Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University of CaliforniaPress,Berkeley ;Schleif 和Wensink, 1982Practical Methods in MolecularBiology ；Glover (编著)1985DNA Cloning，第 I 和 II 卷，IRL Press, Oxford, UK ；Hames 和 Higgins (编著)1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK ； 以及 Setlow 和 Hollaender 1979Genetic Engineering !Principles and Methods,第 1-4 卷，Plenum Press, New ^rk中描述了众多标准技术。使用的缩写和命名视为该领域中的 标准并且通常用于专业期刊(如本文中所引用的那些期刊)中。
如本文中所用的术语“转基因”指通过实验操作导入细胞的基因组中的任何多核 苷酸。转基因可以是天然DNA或非天然DNA。“天然” DNA (也称作“内源” DNA)意指一种多 核苷酸，其可以天然存在于向其中导入该多核苷酸的宿主物种的细胞中。“非天然”DNA(也 称作“外源”DNA)意指从不同于宿主物种的细胞中起源的多核苷酸。非天然DNA可以包括 具有一些修饰的天然DNA，其中不可以在宿主生物中找到所述的修饰。
如本文中所用的“转基因植物种子”意指具有稳定整合至种子基因组中的目的转 基因的植物种子。“植物种子”可以包括但不限于近交种子、通过雄性亲本系与雄性亲本系 杂交所产生的Fl杂交种子、从Fl杂交种长出的F2种子和来自群体的任意种子。“同基因 品系(isoline)” 或“等基因系(isogenic line) ” 或“等基因植物(isogenic plant)” 意 指从其衍生本发明转基因植物的未转化的亲本系或任意植物种子。
根据上下文，如本文中所用的术语“植物”可以理解为意指完整植物、植物细 胞、植物器官、植物种子和其后代。词语“植物”也指任意植物，包括其部分，并且可以包 括但不限于作物植物。植物部分包括但不限于茎、根、小苗、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分 生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花 粉、种子等。植物的类别总体上如适用于转化技术的高等和低等植物那么广泛，所述植 物包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属(horsetail)、 裸蕨类植物(psilophyte)、苔藓类植物和多细胞藻类。所述植物可以源于选自苜蓿 属(Medicago)、番爺属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、黄瓜属(Cucumis)、爺属 (Solanum)、胡桃属(Juglans)、锦葵属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金 鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、 云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵 牛属(Pharbifis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小 麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大 麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、 甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、甜瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属 (Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属 (Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、 萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子 属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、 Majorana、菊芋属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属 (Asparagus)(Antirrhinum) >(Heterocallis) >7Κ^ 1]Μ (Nemesis)
葵属(Pelargonium)、稷属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛直属(Ranunculus)、千里 光属(Senecio)、喇叭舌属(&ilpiglossis)、紫水晶属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、 燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。如本文中所用的“植物”可以是 单子叶作物植物，如，例如禾谷类，包括小麦(普通小麦(Triticus aestivum))、大麦 (Hordeum vulgare)、高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor))、黑麦(Secalecereala)、黑小麦 (triticale)、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、稻(Oryza sativa)、甘蔗，和树，包括苹果树、桃 树、柑桔树(quince)、李树(plum)、樱桃树(cherry)、梨树(peach)、油桃树(nectarine)、 杏树(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)、杨树(poplar)、松(pine)、红杉(sequoia)、 雪松(cedar)和栎树(oak)。“植物”可以是双子叶作物植物，如豌豆、苜蓿、大豆、胡萝 卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜 (broccoli)、莴苣和拟南芥。
“产量”是每个土地面积收获的谷物。例如，在谷类作物的情形时，产量一般被度量 为每英亩的蒲式耳数或每公顷的吨数。
当谈及本发明的CS蛋白使用时，“酶促活性的”意指在转基因植物中表达的转基因 具有CS活性。
术语“约”在本文中用来意指大约、大致、左右和在...范围内。当术语“约”与一 个数字范围一起使用时，它通过扩展界限值高于和低于所述数值而修饰此范围。通常，术语 “约”在本文中用来修饰某数值高于和低于所述值达10%以上或以下(更高或更低)的变
已
如本文中所用的，“氨基酸含量”意指总氨基酸的量，包括游离氨基酸和蛋白质形 式的结合性氨基酸。本文中提及的氨基酸、蛋白质、油和淀粉的全部百分数是干重百分数。 在本发明的转基因植物种子中增加的氨基酸优选地选自由天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱 氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组。更优选地， 本发明的转基因植物种子在选自由天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨 酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸组成的组中的一种或多种氨基酸方面显示 超过等基因植物种子的所述氨基酸增加至少5%。
本发明转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加至少2%。 在另一个实施方案中，转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加至少 4%。在另一个实施方案中，转基因植物种子的油含量超过等基因植物种子的油含量增加约 2-10%。
本发明包括了用包含分离的多核苷酸的表达载体转化的转基因植物。在另一个实 施方案中，本发明的该多核苷酸具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义的序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、 23、对或25中所定义序列的多肽。在又一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含了与具有 如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸至少约50-60% 或至少约 60-70% 或至少约 70-80%、80-85%、85-90 %、90-95% 或至少约 95%、96%、 97^^98^^99%或更多同一或相似的多核苷酸或其部分。在又一个实施方案中，本发明的 多核苷酸包含了编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽与具有如SEQ ID NO 16,17,18,19, 22，23，对或25中所定义序列的多肽至少约50-60%或至少约60-70%或至少约70_80%、 80-85%、85-90%、90-95%或至少约 95%、96%、97%、98%、99%或更多同一或相似。序列 同一性和序列相似性定义如下。
实施方案之一包括具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
义序列的多核苷酸或编码多肽的多核苷酸的等位基因变体，其中所述的多肽具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定义的序列。如本文中所用的，术语“等位基因变体” 指含有多态性的多核苷酸，其中所述的多态性导致由该核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列 改变并存在于天然群体(例如，植物物种或变种)内部。此类天然等位基因变异一般可以 导致编码蛋白质的多核苷酸的1-5%差异或所编码蛋白质的1-5%差异。等位基因的变体 可以通过对许多不同植物中的目的核酸测序进行鉴定，所述的测序可以通过使用例如用来 鉴定那些植物中相同基因遗传基因座的杂交探针轻易地实施。一种多核苷酸的任意及全部 此类核酸变异和所得氨基酸多态性或作为天然等位基因变异之结果并且不改变所编码蛋 白质的功能活性的蛋白质变异意图处在本发明的范围内。
如本文中所用，术语“在严格条件下杂交”意图描述用于杂交和洗涤的条件，在所 述的条件下彼此至少60%相似或相同的核苷酸序列一般仍保持相互杂交。在另一个实施方 案中，所述条件是这样的，从而彼此至少约65 %或至少约70 %或至少约75 %或至少约80 % 或更多相似或同一的序列一般仍保持相互杂交。此类严格条件是本领域技术人员已知的并 且描述如下。严格条件的优选的非限制例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45°C 杂交，随后在50-65°C于0. 2X SSC, 0. 1% SDS中进行一次或多次洗涤。
在又一个实施方案中，分离的核酸互补于如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、 14或15中所定义的多核苷酸，或编码具有如SEQ IDNO 16、17、18、19、22、23、24或25中所 定义序列的多肽的多核苷酸，或与如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定 义多核苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸，或编码与如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、 M或25中所定义多肽具有70%序列同一性的多肽的多核苷酸，或与如SEQ ID N0:l、2、 3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义多核苷酸杂交的多核苷酸，或与编码具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本 文中所用，“互补的”多核苷酸指根据标准Watson-Crick互补性法则能够进行碱基配对的那 些多核苷酸。具体而言，嘌呤将与嘧啶进行碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和 在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的 组合。
在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含了具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、 7、8、12、13、14或15中所定义序列的多核苷酸或编码具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、 23,24或25中所定义序列的多肽的多核苷酸或前述多核苷酸同源物之任一种，其中所述多核苷酸编码赋予植物中经济相关性状的CS。另外，本发明的多核苷酸可以仅包含如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定义的多核苷酸的或编码下述多肽的多核苷酸 的或其同源物的编码区的一部分，例如，可以用作探针或引物的片段，其中所述多肽具有如 SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24 或 25 中所定义的序列。
本发明的转基因植物种子可以通过使用转化单子叶植物或双子叶植物的任何 已知方法将CS基因转化入植物来产生。用于将多核苷酸导入植物基因组和用于从植物 组织或植物细胞再生植物的许多方法是已知的。例如见Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC 出版社，BocaRaton，Florida))，第 6/7 章，第 71-119 页(199 ；White FF(1993)Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants ；Transgenic Plants,第 1 卷， Engineering and Utilization, Kung 禾口 Wu R 编著，Academic Press, 15-38 ；Jenes B 等 Α (1993)Techniques for Gene Transfer :Transgenic Plants，第 1 卷，Engineering and Utilization，Kung禾口 R. Wu编著，Academic Press，第 128—143 页；Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42 :205-225 ；Halford NG,Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1) :62-73 中。
转化方法可以包括直接和间接转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的 DNA摄入、脂质体介导的转化(US 4，536，475)、使用基因枪的生物弹射击法(Fromm ME等 人，(1990)Bio/Technology. 8(9) :833-9 ;Gordon-Kamm 等人，(1990)Plant Cell 2:603)、 电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚和显微注射。在这些直接转化法的情况下，所用 的质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，如PUC系列、pBR322、M13mp系列 等那些质粒。如果欲从转化的细胞再生完整的植物，则额外的选择标记基因优选地位于该 质粒上。直接转化技术同样地适用于双子叶植物和单子叶植物。
也可以借助农杆菌(Agrobacterium)通过细菌感染(EP 0116718)、借助病毒载 体通过病毒感染(EP 0067553 ；US 4, 407, 956 ；WO 95/34668 ；WO 93/03161)或借助花粉 (EP 0270356 ；WO 85/01856 ；US 4, 684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术是本领域 熟知的。农杆菌菌株(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒(Ti或 Ri质粒)和T-DNA元件在用农杆菌感染后转移至植物。T-DNA(转移的DNA)整合入植物细 胞的基因组。该T-DNA可以位于Ri-或Ti-质粒上或分别地包含于所谓双元载体中。用 于农杆菌介导的转化的方法在例如Horsch RB等人(198Qkience 225 :1229中描述。在 例如 White FF, Vectors for GeneTransfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering andUtilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu 编著，Academic Press, 1993,第 15-38 页；Jenes B 等人，Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants,第 1 卷， Engineering and Utilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu 编著，AcademicPress, 1993,第 128-143 M ；Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol PlantMolec Biol 42 :205-225 ^ ! 过农杆菌转化植物。
使用如美国专利号4, 945, 050 ；5，036，006 ；5，100，792 ；5，302，523 ；5，464，765 ； 5，120,657 ；6, 084, IM等中所述的粒子轰击法，可以将CS基因转化到谷物植物中。可以使 用如美国专利号 5，591,616 ；5，731，179 ；5, 981,840 ；6，162,965 ；6，420，630，美国专利申请 公开号2002/0104132等中所述的农杆菌转化法，制备本发明的转基因谷物种子。备选地，可以使用适用于谷物中的质体转化方法产生本发明的转基因谷物种子。烟草中的质体转化 法在例如^)1^6111 )等人(1994)Nucleic Acids Res. 22,3819-3824 ；Ruf 等人(2001)Nature Biotechnol. 19，870-875 ；Kuroda 等人 O001)PlantPhysiol. 125,430-436 ；Kuroda 等人 (2001)Nucleic Acids Res. 29，970-975 ;Hajdukiewica 等人(2001)Plant J. 27，161-170 ； 和Corneille等人(2001)Plant J. 72，171-178中描述。使用phiC31噬菌体整合酶的额外 质体转化方法在Lutz等人QO(M)The Plant J. 37，906中公开。额外的转化方法包括但不 限于表1中的以下原材料和方法
表 1
权利要求
1.转基因植物和其部分，包含编码异源柠檬酸合酶的多核苷酸，该多核苷酸在种子中 或在种子的胞内细胞区室中或在种子的胞质中表达，其中多核苷酸选自由以下多核苷酸组 成的组a)具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸；b)编码具有SEQID NO 18中所定义序列的多肽的多核苷酸；c)与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多 核苷酸；d)编码与具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的 多核苷酸；e)在严格条件下与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多 核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
2.从权利要求
1的植物产生的种子，其中多核苷酸在种子中的表达赋予该种子在同基 因品系中不存在的或不以同基因品系中相同水平存在的经济相关性状。
3.权利要求
2的种子，其中经济相关性状是谷物产量相对于同基因品系而言增加每英 亩至少3蒲式耳。
4.权利要求
1的植物，其中多核苷酸具有SEQID NO :5或6中所定义的序列或多核苷 酸编码具有SEQ ID NO 18中所定义序列的多肽。
5.权利要求
1的植物，其中多核苷酸与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷 酸具有至少70%序列同一性或多核苷酸编码与具有SEQ ID NO :18中所定义序列的多肽具 有至少70%序列同一性的多肽。
6.权利要求
1的植物，其中植物是单子叶植物、双子叶植物或选自由玉米、小麦、稻、 大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉、黑麦草、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、旱芹、番茄、马铃薯、棉花、 烟草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、莴苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)组成的组。
7.权利要求
1的植物，其中植物在谷物产量上具有超过同基因品系谷物产量的每英亩 约3-19蒲式耳增加。
8.表达载体，其包含与多核苷酸有效连接的种子偏好的转录调节元件，其中多核苷酸 选自由以下多核苷酸组成的组a)具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸；b)编码具有SEQID NO 18中所定义序列的多肽的多核苷酸；c)与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸；d)编码与具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的 多核苷酸；e)在严格条件下与具有SEQID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；f)在严格条件下与编码具有SEQID NO :18中所定义序列的多肽的多核苷酸杂交的多 核苷酸；和g)与a)至f)的任一多核苷酸互补的多核苷酸。
9.权利要求
8的表达载体，其中种子偏好的转录调节元件还与胞内细胞区室靶向序列 有效连接。
10.权利要求
8的表达载体，其中种子偏好的转录调节元件是胚乳偏好的启动子。
11.权利要求
8的表达载体，其中多核苷酸具有SEQID NO :5或6中所定义的序列或 多核苷酸与具有SEQ ID NO :5或6中所定义序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
12.权利要求
8的表达载体，其中多核苷酸编码具有SEQID NO :18中所定义序列的多 肽或多核苷酸编码与具有SEQ ID NO :18中所定义序列的多肽具有至少70%序列同一性的 多肽。
13.产生包含经济相关性状的转基因植物的方法，其中该方法包括步骤a)将权利要求
8、9或10的表达载体导入植物中，其中多核苷酸编码能够赋予经济相关 性状的多肽；和b)选择显示经济相关性状的转基因植物。
14.权利要求
13的方法，其中经济相关性状是每英亩蒲式耳产量超过同基因品系每 英亩蒲式耳产量增加至少3蒲式耳或是谷物产量超过同基因品系谷物产量每英亩增加约 3-19蒲式耳。
15.由权利要求
13或14的方法产生的转基因植物和其部分。
专利摘要
本发明提供了转基因植物，其表达编码柠檬酸合酶(CS)的转基因，其中本发明的转基因植物种子的特征是与不表达该转基因的同基因品系相比较时，蛋白质、必需氨基酸或油的产量增加和/或水平增强；并且本发明也提供了产生具有经济相关性状的转基因植物的方法并提供了包含编码柠檬酸合酶的多核苷酸的表达载体。
文档编号C12N15/82GKCN102066565SQ200980122107
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月10日
发明者S·哈丁, 关汉平, 徐範锡 申请人:巴斯夫植物科学有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan