专利名称:利用海洋细菌光-暗耦联制氢的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域：
，涉及一种利用海洋细菌光-暗耦联制氢的方法。
背景技术：
生物制氢是利用某些微生物代谢过程来生产氢气的一项生物工程技术，具有其他 方法所没有的独特优势①工艺条件温和，通常在常温常压下进行；②不产生硫化物、烟尘 以及难降解的有机废水；③所产生的气体只包括氢气、二氧化碳、水蒸气，不需要脱硫、除 尘，氢气分离纯化工艺简单；④能利用可再生能源，并可进行废物利用，在生产氢能的同时 达到环境治理与废物利用的目的，具有广阔的应用前景。
产氢微生物研究起步比较晚，目前国际上大量的研究是针对陆地淡水产氢菌株，
对于海洋产氢菌株的研究报道较少。对于海洋资源开发和利用普遍重视的今天，发展和利
用海洋资源进行微生物制氢具有现实意义。
暗发酵细菌发酵葡萄糖产氢理论化学方程式为
C6H1206+2H20 — 4H2+2C2H402 (乙酸)+2C02
光合细菌利用乙酸产氢的理论化学方程式为
2C2H402 (乙酸)+4H20 — 8H2+4C02
由上面两个关系式可见光合细菌和暗发酵细菌联合制氢理论上为
C6H1206+6H20 — 12H2+6C02
因此，光合细菌与发酵性细菌混合培养，就有可能实现有机物完全降解并持续产
氢，提高光能转换效率和底物的利用效率，降低挥发酸对细菌的毒性，提高产氢量。
通过检索，发现一篇与本专利申请相关的对比技术，其名称为利用海水养殖场污
泥和污水培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，公开号CN1011307S6。该方法首
先利用海水养殖中产生的富含有机质的污水和污泥等作为放氢培养基进行暗培养产氢，然
后进行光培养产氢，最后将暗培养放氢后的培养基中加入光发酵细菌进行耦联产氢，以提
高氢气的释放量，从而恢复海洋暗发酵产氢菌的产氢活性。因此，该发明是利用暗发酵细菌
制氢，产氢结束后底物还没有利用完，在把发酵细菌除去之后又把PH值调到光合细菌适合
生长的范围然后再加入光合细菌，实际上就是说光合细菌可以利用发酵细菌产物制氢，两
种菌是分开生长的，产氢效率较低，实际应用价值受到一定限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用海洋细菌光_暗耦联 制氢的方法；该方法在暗发酵细菌菌液中加入光合细菌菌群，可充分分解有机物，提高产氢 效率。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
—种利用海洋细菌光_暗耦联制氢的方法，其步骤是
(l)菌株筛选[0016] 将潮间表层带污泥及底层带污泥分别加入到培养基中，培养得到菌群，再进一步 经富集、分离纯化、镜检，分别得到光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株； (2)耦联制氢
将上述得到的光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株按比例同时加入LM培养基中，充 氮气置换上层空气，将菌液置于摇床中，振荡培养制氢。
而且，所述光合细菌和暗发酵细菌纯菌株的混合比例为1 : 1-30 : 1。
而且，所述将菌液置于摇床中振荡培养的条件为温度37t:、光强40001ux、转速
150rpm。
本发明的优点和积极效果是
1、本发明选用从潮间带底泥中筛选到的菌种海洋暗发酵细菌与海洋光合细菌耦 联制氢，将两类细菌按光合细菌多于暗发酵细菌的不同比例同时接入到培养基中，二者协 同作用，可以极大地提高产氢效率，比单种细菌产氢效率提高10倍左右，且不用除菌和调 pH值，在生物制氢和污水处理方面具有重要的应用价值。
2、本发明适用于高盐度有机废水和海洋养殖废水的处理，在污水处理的同时得到 清洁能源——氢气，也可以作为陆地环境中各种不同盐度有机废水的处理与生物制氢的方 法。
图1为本发明BH-18的系统进化树；
图2为本发明LC83序列系统进化树；
图3为本发明在有氧条件下NaCl浓度对P. agglomerans BH-18生长状态的影响； 图4为本发明在有氧条件下NaCl浓度对Marichromatium sp. LC83生长状态的影 响；
图5为本发明光合细菌和暗发酵细菌同时接入培养基的产氢量和葡萄糖利用率 柱状图；
图6本发明在暗发酵细菌发酵8小时后接入光合细菌的产氢量和葡萄糖利用率柱 状图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，
不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1 :
—种利用海洋细菌光_暗耦联制氢的方法，其步骤是
从北海市红树林潮间带取底层污泥，命名为BH，从青岛第一海水浴场潮间带取表 层污泥，命名为LC，采样后密封置于4t:保存。取少量样品BH接种于有100ml LM培养基的 250ml血清瓶中，用橡胶塞盖紧，充氮气60s置换上层空气，创造厌氧或微好氧环境，置于摇 床中37t:振荡培养24h。将样品LC接种于有100ml RCVBN培养基的250ml血清瓶中，充氩 气60s置换上层空气，创造厌氧或微好氧环境，置于30°C、2000 80001ux的光照培养箱中 培养3到5天。分别取lml培养物加入到各自新鲜的100ml培养基中，相同条件下培养。上述步骤重复3次，以达到富集产氢微生物的目的。(5)将富集的培养物稀释为10—、10一2， 10—3， 10—4， 10—5， 10—6， 10—7， 10—8， 10—9和10—"的菌液，取合适的浓度在固体培养基中(暗发酵细 菌为LM，光合细菌为Molish)划线，5min后再倒一层固体培养基或琼脂，冷凝后再倒一层固 体石蜡，达到密闭效果，再放至两种菌各自相应的条件下培养。由此可以获得由单一细菌生 长而来的菌落。(6)挑取形态和颜色单一的菌落至装有液体培养基的螺口管中，进行富集扩 增，将螺口管倒置，观察产气高度，选取产气量较大的试管进行编号，进行再一次的分离纯 化。上述操作重复进行，直至固体培养基上的菌落和普通光学显微镜下菌体细胞形态一致 为止。 一般采用"固体_液体"法培养细菌，反复操作3 5次即可。
利用分子生物学方法，测定了上述两种细菌的16S rDNA序列并提交GenBank， 通过Blast进行同源性分析，采用Clustal x软件进行多序列比对并构建系统进化 树(如图1、图2)分析表明，海洋暗发酵细菌属于成团泛菌(Pantoea agglomerans)， 命名为P. agglomerans BH-18 ;海洋光合细菌属于Proteobacteria (变形菌门)， Gammaproteobacteria ( Y _变形菌纟冈)，Chromatiales (着色菌目)，Chromatiaceae (着色 菌禾斗)，Marichromatium属，命名为Marichromatium sp. 1X83。
分别对两种细菌进行耐盐实验，调整培养基中的NaCl的终浓度，使其浓度分别为 0%。、10%。、30%。、50%。、70%。，在30 37°C (光合细菌在光强5000Lux左右)、接种量在10% 的培养条件下，每隔一段时间测定其细胞的生长量。结果表明菌株P. agglomerans BH-18 在盐度为0 70%。的条件下都可生长(如图3);菌株Marichromatium sp. LC83在盐度为 10 70%。的条件下可以生长(如图4)。
配制3份LM培养基(起始pH为9)各100ml，装入有翻口橡胶塞的250ml血清瓶 中，112.6t:灭菌15min后，在无菌操作台中对其中1瓶加入lml暗发酵细菌BH-18 (0D600 =1.6065)，1瓶加入lml光合细菌LC83 (0D660 = 1.6018)，1瓶加入lml暗发酵细菌 BH-18(0D600 = 1.6065)和lml光合细菌LC83 (0D660 = 1. 6018)，盖好塞子，充氮气置换 上层空气。将菌液置于摇床中，在37t:、40001ux、转速150rpm条件下振荡培养，集气采用 排水法，在产气开始和结束时分别用5ml注射器取样，分析菌液中葡萄糖含量，待产气结束 后，将所收集的气体用气象色谱仪分析其氢含量。结果表明纯光合细菌LC83产氢量为 3ml/dl，葡萄糖利用率为25.9% ;纯暗发酵细菌BH-18产氢量为40ml/dl葡萄糖利用率为 76. 5% ;光/暗为1/1的产氢量为52ml/dl，葡萄糖利用率为99. 4% (如图5)。分析表明，
光_暗耦联后可提高产氢量，扩大底物利用率。
实施例2 :
其他操作和实例1相同，区别为配制3份培养基，每瓶100ml培养基中分别加暗发 酵细菌BH-18(0De。。 = 1. 6065) lml和光合细菌LC83(0D66。 = 1. 6018) 10ml、20ml、30ml。结 果表明，光/暗为10/1 、20/1 、30/1的产氢量分别为84ml/dl、78ml/dl、 157ml/dl，葡萄糖利 用率分别为99. 3%、99. 2%、98. 7% (如图5)。
实施例3 :
其他操作和实例1相同，区别为配制2份培养基，每瓶100ml培养基中加暗发酵细 菌BH-18(0D, = 1. 6065) lml，在与实例1相同条件下培养8小时后用注射器分别加入光合 细菌LC83(0D,二 1.6018)4ml和8ml。结果表明，光/暗为4/1、8/1的产氢量分别为96m1/ dl和125ml/dl，葡萄糖利用率分别为99. 24%和99. 21% (如图6)。[0041] 本发明的工作机理
由于不同细菌利用有机物的高度特异性，其所能分解的有机物的成分相差很大。 一方面，暗发酵细菌具有很高的降解大分子有机物的能力，光合细菌分解大分子有机物的 能力不强，但是它们能分解发酵菌分解后剩下的小分子有机物，而采用两者混合培养可以 充分利用有机质，提高产氢量；另一方面，发酵菌在发酵产氢的过程中会放出大量的有机酸 等使培养环境中的PH下降，偏离了发酵菌的最适生长条件，从而使H2产量下降。光合细菌 可以分解这些小分子有机酸，使培养环境中的pH保持恒定。把这两种微生物联合培养有利 于提高底物的利用率和产氢量，同时可进一步处理废水，在生物制氢和污水处理方面有重 要意义。
权利要求
一种利用海洋细菌光-暗耦联制氢的方法，其特征在于其步骤是(1)菌株筛选将潮间表层带污泥及底层带污泥分别加入到培养基中，培养得到菌群，再进一步经富集、分离纯化、镜检，分别得到光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株；(2)耦联制氢将上述得到的光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株按比例同时加入LM培养基中，充氮气置换上层空气，将菌液置于摇床中，振荡培养制氢。
2. 根据权利要求
1所述的利用海洋细菌光_暗耦联制氢的方法，其特征在于所述光 合细菌和暗发酵细菌纯菌株的混合比例为1 : 1-30 : 1。
3. 根据权利要求
1所述的利用海洋细菌光_暗耦联制氢的方法，其特征在于所述将菌液置于摇床中振荡培养的条件为温度37t:、光强40001ux、转速150rpm。
专利摘要
本发明涉及一种利用海洋细菌光-暗耦联制氢的方法，其步骤是(1)将潮间表层带污泥及底层带污泥分别加入到培养基中，培养得到菌群，再进一步经富集、分离纯化、镜检，分别得到光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株；(2)将上述得到的光合细菌和暗发酵细菌的纯菌株按比例同时加入LM培养基中，充氮气置换上层空气，将菌液置于摇床中，振荡培养制氢。本发明选用从潮间带底泥中筛选到的菌种海洋暗发酵细菌与海洋光合细菌，将两类细菌按光合细菌多于暗发酵细菌的不同比例同时接入到培养基中，二者协同作用，可以极大地提高产氢效率，比单种细菌产氢效率提高10倍左右，且不用除菌和调pH值，在生物制氢和污水处理方面具有重要的应用价值，也可以作为陆地环境中各种不同盐度有机废水的处理与生物制氢。
文档编号C12R1/01GKCN101717809SQ200910245106
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月25日
发明者才金玲, 朱大玲, 李延川, 潘光华, 王广策, 高广琦 申请人:天津科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan