专利名称：:利用环介导等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医学诊断领域，具体涉及一种用于使用环介导等温扩增(LAMP)技术快速方便检测淋病奈瑟菌的方法。可用于临床诊断以及个人早期筛查等。
背景技术：
：淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)是常见的泌尿生殖系统传播疾病病原体。传统的临床检测方法是使用细菌培养法，但是该方法操作难度大，耗时长，标本运送条件极为严格，并且还存着检出率低的缺点，容易导致漏诊误诊。此外，该方法还需侵入式的获取样本，对患者造成较大痛苦。常规的PCR检测方法可以避免这一问题，并已有一些利用核酸扩增的方法检测淋病奈瑟菌的商业试剂盒，但是这些试剂盒都需要使用特定的专业仪器，需要在专业的实验室内完成检测。另外最重要的是常规聚合酶链式反应技术(PCR技术)难以完全回避假阳性的问题。这是由于PCR结束电泳需要人工开关PCR管并使用移液器吸取样品，进行琼脂糖凝胶电泳对结果进行判断。由于PCR产物的高浓度，开管闭管对其产物的处理对操作人员的要求极高，稍不小心则极为容易产物气凝胶的污染，导致假阳性结果的出现。此外，使用这一技术进行核酸扩增放大需要用到离心机，PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统等一系列专业分子生物学仪器。这些仪器都非常昂贵，需要受过训练的专业人员来操作，不仅如此，对结果的检测确定还需要使用琼脂糖凝胶电泳，不仅耗时长，工序复杂难以实现大样本操作，而且需要操作人员有熟练的分子生物学操作技术，还需要操作人员长时间接触致癌物溴化乙锭等对健康有严重影响的有毒有害化学物质。另一种后来发展的技术，荧光定量PCR技术，通过使用PCR反应的同时测定PCR管内荧光值的变化来对结果进行判读。由于不需要开管取出PCR产物进行电泳判断结果，可以在一定程度上避免PCR产物气凝胶交叉污染的假阳性问题。一些使用荧光定量PCR技术检测淋病的方法也被发展起来，如专利CN100415900c公开了一种使用自身淬灭探针的荧光定量PCR技术来检测淋病的试剂盒。然而荧光定量PCR技术需要使用昂贵的荧光定量PCR仪(动辄几十万至上百万人民币)，这限制了这个技术的广泛使用，只有少数专业的实验室才能进行相应的检测。淋病作为性病的一种，一般通过性途径传播但并不止限于性传播。可是中国传统文化的影响或者一些心理上的原因，一些患者或者怀疑患者不愿意或者不好意思上正规的医院进行检查，而倾向找一些地下的非正规游医进行诊断治疗。这些地下游医技术良莠不齐，而且通常情况下由于仪器设备条件限制，只能仅仅靠经验判断而不是使用现代分子生物学技术进行确诊，导致误诊率漏诊率高，不仅可能给患者造成不必要的巨大的精神压力的经济损失，而且可能由于漏诊造成疾病的更大范围传播，给公共卫生带来潜在的威胁。如果有一种快速的可以在正规药房购买的检测试剂盒或者检测方法，可以自己完成检测并提供科学的诊断治疗建议，无疑将会对公共卫生水平的提高带来很大帮助。在2000年后，对于核酸扩增技术出现了一种和聚合酶链式反应技术截然不同的技术环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)环介导等温扩增技术主要利用了BstDNA聚合酶能将新生成的核酸单链从新合成的DNA双链上置换下来的机理，实现在一个恒定不变温度下对核酸进行扩增。关于这项技术的详细的反应机理以及其和聚合酶链式反应的不同可参见专利CN100422323C(授权号)和CN101173317A(公开号)。目前已有将这个技术应用于一些疾病的快速检测的学术文章报道，如艾滋病，登革热甚至猪病毒的检测等。但将其应用于淋病奈瑟菌的检测，国内外仍未见报道。
发明内容在本发明中公开了一种利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)对淋病检测的方法。LMAP反应最主要的特点是等温链替换扩增。这使得一个简单廉价的小型恒温装置就可以完成反应。如小型金属浴装置，小型水浴装置或者小型烘箱。如果做成和lamp试剂盒配套的65度恒温超小型装置的话甚至可以以更为廉价的简单电路实现。环介导等温扩增技术需要对目标基因的六个位置设置4个引物或者6个引物，利用特定的具有链置换活性的耐热DNA聚合酶Bst酶在等温的条件下形成特殊结构从而使目标基因实现高效扩增，而根本不需要进行传统的的热循环。相比PCR技术，LAMP技术更适合于应用到有大量样品的，非实验室的检测场所。这种技术不仅几乎不需要专业仪器，操作上更为简单，对操作人员技术要求更低，而且反应时间仅需一小时左右。相比于PCR技术较为容易的引物设计，LAMP技术的难点在于其需要设计两长两短的特殊的四个引物。使得其能够特异的对目标序列形成铃型的结构从而实现与PCR反应完全不同的交替链替换的扩增放大。引物设计的好坏及其序列特异性关系最终检测的成功与否。本发明的目的在于克服目前现有淋病检测方法的不足，利用环介导等温核酸扩增技术实现一种快速的无需专业仪器的淋病检测方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。本发明第一次提出将环介导等温扩增技术应用于淋病奈瑟菌检测。具体通过如下步骤来实现选择淋病奈瑟菌的隐蔽质粒DNA片段。将其分段提交至美国国家生物技术中心网站上的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索(点击网页左上角Blast按钮，并以fasta格式提交序列，选择nt选项)，通过BLAST程序分析寻找淋病特有的，和其他细菌没有高同源性的DNA片段。在本发明中，发明人根据Blast结果选择隐形质粒上的B蛋白编码序列以及B蛋白和A蛋白之间非编码序列，自行进行LAMP引物设计。本方案中提供了五套可以用于该位置特异扩增的LAMP引物F3，B3以及FIPBIP0这五套引物均可以对淋病奈瑟菌上的目的片段进行有效LAMP扩增。第一套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>第二套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>第三套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>第四套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>第五套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[0020]以上五套引物用于LAMP方法扩增淋病奈瑟菌B蛋白编码序列以及B蛋白和A蛋白之间非编码序列。将引物序列委托上海生工公司进行引物合成。其阳性对照选择淋病奈瑟菌隐蔽质粒上如下片段CATTCCCCATCCCCTGCTTTGGGTTCGTTTGTATCGTTGGCTTATCGTTTGGCTGGTTGATTCAAGATTTCGCTCTGCCGTTGCCGTATTTCGCTCTGCCGCTCTAACTCGGCTGCCAAGCTCGCTAGCTGCTGCGCTAAACTCGTGTTTTCCTGCTCTAGCTCTGCCAACCTTTCGCCCAAGTGCGTTAAGGCTTTCATCATTCGCTGCTCGATTGCTGCGTGATTGCTCTCTAATTCCGCTAACGCGTCCAGCATTCGCTTCTCGGTCGCTACGCATACCCGCGTTGCTTTGCTGTTCTCGACTGGGCAATTTTCCAGTGTCAAACCTTTGGTCTTGGTTTCCAACAGGTCTAGGGTGCGCTCTGCTTCGGCTCTCTGCTGTTTCAAGTCGTCCAGCTCGTTCTTGACGCTCCATATCGCTATGAACAGCCCTGCTATGACTATCAACCCTGCCGCCGATATACCTAGCAAGCTCCACAGATAGGGCTTGAATACTGCCTTGCTCATGCGTAACTGCCGGGCGTTTATATCGGCGGTTATTTTCTGCTCGCTTTGCTTCAATGCCTCGTTGATATTTTTCCGTAACGTCTCTAAGTCTGCTTTCGTTTGTTGCTCTATGCTGGCGGCTTCGGTGCGTGATGTCTGCTCGAAGGTCTTCGCCAAATCGGAAATCTTGCTCATACAGTGCGCCTTTCAGTCGGATGTTGCGCCCTTTTGGGTCCGGGTTCTTGATGCTGATGCTGCTGATGGTCGCTCGTGATATTTCAAAACCTACCTTTTCCAGCGTTTCCAGCACGTCTGCGCGGCTTTTTAGCTTGCCTGATAGGGCTAGGGCTTCTAAGCCGTCTGTGATGCTCTGTGATGCTCTGTGCGGCTTCCTGCGTGTTTCTCGGCAGGTCTTTGGCTTGGGTCATGCTCTGCCGTTTGGCGGGGTCGTCTGGGTCGCTGTATCCGTGCGTCAGGTTCTGCATGGTGCGCCATGCGTCCACTCTTCCTCTGTCGGCGGCGSEQIDNO33使用PCR技术制备阳性模板，反应条件如下设计引物如下，并委托上海生工公司合成。正向引物5'CATTCCCCATCCCCTGCTTTGGGTT3‘SEQIDNO29反向引物5'GCCGCCGACAGAGGAAGAGTGGACG3‘SEQIDNO30PCR体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>将上述所有成分加至一小PCR管，放入PCR仪，PCR仪器设置反应条件如下步骤一94度2分钟步骤二94度1分钟，然后54度1分钟，然后[0033]72度1分钟步骤三重复步骤二32次。将所得PCR产物电泳之后委托北京华大公司测序确认。随后再以确认PCR产物作为标准模板替换上述PCR体系中的淋病奈瑟菌总DNA进行多管PCR扩增。将所得到的产物每50μ1使用MinielutePCRpurificationkit(QIAGEN公司产品)进行纯化，并稀释至0.5ml,即制成阳性正对照模板。0.5ml模板可供使用1000次，每次使用0.5μ1。由于国际上有报道淋病奈瑟菌在世界各地不同地理位置的感染人群有不同的株系，并且在澳洲等地有过ccpB基因片段缺失的淋病奈瑟菌的发现报道。为鉴别这种突变淋病奈瑟菌，本发明同时还设计了2套用于16SrRNA编码区的LAMP引物。由于16SrRNA区blast分析结果和脑膜奈菌有较高同源性(98%)，可能会造成交叉扩增，同时这种突变淋病奈瑟菌在中国极少发现报道。所以这以下两套引物只作为特殊情况下的备用对照。第六套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>第七套引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其阳性对照选择如下16SrRNA编码序列ATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCTTTACACATGCAAGTCGGACGGCAGCACAGGGAAGCTTGCTTCTCGGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATATCGGAACGTACCGGGTAGCGGGGGATAACTGATCGAAAGATCAGCTAATACCGCATACGTCTTGAGAGGGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCCGAGCGGCCGATATCTGATTAGCTGGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTCTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGCTGTTGCCAATATCGGCGGCCGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGGGCGCAGACGGTTACTTAAGCAGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCCGGGAACTGCGTTCTGAACTGGGTGACTCGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGTTCATGTCCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAATTAGCTGTTGGGCAACTTGATTGCTTGGTAGCGTAGCTAACGCGTGAAATTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATGTGCGGAATCCTCCGGAGACGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTCGGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGACCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGTACAGAGGGTAGCCAAGCCGCGAGGCGGAGCCAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGGGATACCAGAAGTAGGTAGGGTAACCGCAAGGAGTCCGCTTACCACGGTATGCTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTSEQIDNO34使用PCR技术制备阳性模板，反应条件如下设计引物如下，并委托上海生工公司合成。正向引物5'ATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGC3‘SEQIDNO31反向引物5'CCGCAGGTTCCCCTACGGCTACCTT3‘SEQIDNO32PCR体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR仪，PCR仪器设置反应条件如下步骤一94度2分钟步骤二94度1分钟，然后54度1分钟，然后72度2分钟步骤三重复步骤二32次。将所得PCR产物电泳之后委托北京华大公司测序确认。随后再以确认之PCR产物作为标准模板替换上述PCR体系中的淋病奈瑟菌总DNA进行PCR扩增。将所得到的产物每50μ1使用MinielutePCRpurificationkit(QIAGEN公司产品)进行纯化，并稀释至0.5ml,即制成阳性对照模板。0.5ml模板可供使用1000次，每次使用0.5μ1。以下以具体实施方式进一步阐述本发明。其中所用样本均为尿道分泌物或者尿液。由于LAMP扩增技术的高度灵敏和特异性，避免了传统的侵入式取尿道标本培养给患者带来的痛苦。使得本方法成为为一种敏感特异的非侵入诊断方法。图1显示以钙黄绿素判断结果的实施例。图2显示以SYBRgreen判断结果的实施例。具体实施方式下面分别就医院临床实施方式及患者自我筛查实施方式阐述如下。医院实施方式使用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN公司)对病人尿道分泌物或者尿液离心沉淀样品提取高纯度DNA，具体操作按照其说明书完成。(本步骤也可使用其他生物公司同类DNA提取试剂盒完成)。使用上述试剂盒回收得到淋病病人尿道分泌物DNA样品50μ1，标记为样品2；及健康人尿道分泌物DNA样品50μ1标记为样品1。从样品1和样品2中各取出2μ1到一新的小PCR管，再加入50μ1反应液(成分如下)。关上PCR管盖。将管子放入65度恒温金属浴保温1小时。随后将管子取出，肉眼观察管内液体颜色。如果管子内液体变为绿色，则说明特异的核酸序列，淋病奈瑟菌ccpB片段DNA得到有效扩增，扩增样品内含有大量淋病奈瑟菌的扩增后的ccpB片段。如果液体颜色不变，则说明样品内不含有淋病奈瑟菌的脱氧核糖核酸。在本实验中，如附图所显示，样品1管内液体仍然为透明无色(以钙黄绿素作为显色剂)或者橙红色(以SYBRgreen作为显色剂)，说明初始检测样品中不含有淋病菌的脱氧核糖核酸，即该样品提供者未被淋病奈瑟菌感染。而样品2中的液体变为绿色，说明其中含有含有淋病菌的脱氧核糖核酸，即该样品提供者已被淋病奈瑟菌感染。反应液成分，其中四个引物可使用上述一至五套引物中任何一套。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上反应液成分均保存于负20度冰箱。患者自检实施方式取淋病病人尿100μ1(清晨初段尿)，标记为样品2；及健康人尿100μ1(清晨初段尿)标记为样品1。从样品1和样品2中各取出2μ1到一新0.5ml小PCR管，再加入5μ1反应液(成分如下)。关上PCR管盖。将管子放入65度恒温小型金属浴保温1小时。随后将管子取出，肉眼观察如果管子内液体变为绿色，则说明特异的核酸序列，淋病奈瑟菌ccpB片段DNA得到有效扩增，扩增样品内含有大量淋病奈瑟菌的扩增后的ccpB片段。如果液体颜色不变，则说明样品内不含有淋病奈瑟菌的脱氧核糖核酸。在本实验中，如附图所显示，样品1管内液体仍然为样品1管内液体仍然为透明无色(以钙黄绿素作为显色剂)或者橙红色(以SYBRgreen作为显色剂)，说明初始检测样品中不含有淋病菌的脱氧核糖核酸，即该样品提供者未被淋病奈瑟菌感染。而样品2中的液体变为绿色，说明其中含有含有淋病菌的脱氧核糖核酸，即该样品提供者已被淋病奈瑟菌感染。反应液成分，其中四个引物可使用上述一至五套套引物中任何一套。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>BstDNA聚合酶20U在病人自检的试剂盒模式中，<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>荧光指示剂钙黄绿素(或者SYBRgreen)50M以液体的形式存在，标记为溶液A。而以下成分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以冻干粉的形式存着，标记为粉末B。溶液A和粉末B均可以密封的形式保存在室温。但粉末B长期放置仍需保存在负20度冰箱以避免酶失活。使用前将溶液A和粉末B混勻。即可得到反应液。同时在试剂盒中以小吸管形式提供小型移液器。即患者用该移液器吸取少量尿液2μ1加入上述混合液中即可开始检测。序列表<110>孙星江<120>使用环介导等温扩增技术快速检测淋病奈瑟菌<160>34<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>引物<400>1taactcggctgccaagct18<210>2<211>18<212>DNA<213>引物<400>2aaagcaacgcgggtatgc18<210>3<211>39<212>DNA<213>引物<400>3aacgcacttgggcgaaaggttctgctgcgctaaactcgt39<210>4<211>40<212>DNA<213>引物[0105]<400>4tcattcgctgctcgattgctgcgaagcgaatgctggacgc40<210>5<211>18<212>DNA<213>引物<400>5agctgctgcgctaaactc18<210>6<211>20<212>DNA<213>引物<400>6aaattgcccagtcgagaaca20<210>7<211>41<212>DNA<213>引物<400>7caatcacgcagcaatcgagcagctgctctagctctgccaac41<210>8<211>39<212>DNA<213>引物<400>8aattccgctaacgcgtccagcgcaaagcaacgcgggtat39<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9cgtgttttcctgctctagct20<210>10<211>20<212>DNA<213>引物<400>10aaattgcccagtcgagaaca20<210>11[0144]<211>40<212>DNA<213>引物<400>11caatcacgcagcaatcgagcaggccaacctttcgcccaag40<210>12<211>39<212>DNA<213>引物<400>12aattccgctaacgcgtccagcgcaaagcaacgcgggtat39<210>13<211>20<212>DNA<213>引物<400>13tgctgtttcaagtcgtccag20<210>14<211>19<212>DNA<213>引物<400>14tgaagcaaagcgagcagaa19<210>15<211>40<212>DNA<213>引物<400>15ggtatatcggcggcagggttgctcgttcttgacgctccat40<210>16<211>41<212>DNA<213>引物<400>16gcaagctccacagatagggctgatataaacgcccggcagtt41<210>17<211>20<212>DNA<213>引物[0183]<400>17tgaacagccctgctatgact20<210>18<211>19<212>DNA<213>引物<400>18cagacatcacgcaccgaag19<210>19<211>40<212>DNA<213>引物<400>19gcccggcagttacgcatgagtacctagcaagctccacaga40<210>20<211>42<212>DNA<213>引物<400>20cgctttgcttcaatgcctcgttgccagcatagagcaacaaac42<210>21<211>18<212>DNA<213>引物<400>21cgcgcccaccttaaacag18<210>22<211>20<212>DNA<213>引物<400>22ccgttgcgtcaaaagtcaac20<210>23<211>41<212>DNA<213>引物<400>23atttgtcgaagacgcgctgcgcttcaatttttgcgcggtcg41<210>24[0222]<211>40<212>DNA<213>引物<400>24gccccttcttagggacgcaagtccaatcctacggcgttac40<210>25<211>20<212>DNA<213>引物<400>25gcccaccttaaacagcttca20<210>26<211>20<212>DNA<213>引物<400>26ccgttgcgtcaaaagtcaac20<210>27<211>41<212>DNA<213>引物<400>27gtggcaatttgtcgaagacgcggcggtcggttcaaaactgt41<210>28<211>40<212>DNA<213>引物<400>28gccccttcttagggacgcaagtccaatcctacggcgttac40<210>29<211>25<212>DNA<213>引物<400>29cattccccatcccctgctttgggtt25<210>30<211>25<212>DNA<213>引物[0261]<400>30gccgccgacagaggaagagtggacg25<210>31<211>25<212>DNA〈213〉引物<400>31atcctggctcagattgaacgctggc25〈210>32<211>25<212>DNA〈213〉引物<400>32ccgcaggttcccctacggctacctt25<210>33<211>1010<212>DNA<213>Neisseriagonorrhoeae<400>33cattccccatcccctgctttgggttcgtttgtatcgttggcttatcgtttggctggttga60ttcaagatttcgctctgccgttgccgtatttcgctctgccgctctaactcggctgccaag120ctcgctagctgctgcgctaaactcgtgttttcctgctctagctctgccaacctttcgccc180aagtgcgttaaggctttcatcattcgctgctcgattgctgcgtgattgctctctaattcc240gctaacgcgtccagcattcgcttctcggtcgctacgcatacccgcgttgctttgctgttc300tcgactgggcaattttccagtgtcaaacctttggtcttggtttccaacaggtctagggtg360cgctctgcttcggctctctgctgtttcaagtcgtccagctcgttcttgacgctccatatc420gctatgaacagccctgctatgactatcaaccctgccgccgatatacctagcaagctccac480agatagggcttgaatactgccttgctcatgcgtaactgccgggcgtttatatcggcggtt540attttctgctcgctttgcttcaatgcctcgttgatatttttccgtaacgtctctaagtct600gctttcgtttgttgctctatgctggcggcttcggtgcgtgatgtctgctcgaaggtcttc660gccaaatcggaaatcttgctcatacagtgcgcctttcagtcggatgttgcgcccttttgg720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