专利名称:抗人巨细胞病毒(hcmv)的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及从对感染人细胞的病毒具有特异性生物活性的人B细胞分离的新型抗体序列。
背景技术：
人巨细胞病毒(hCMV)是ー种分布广泛、高度种类特异性的疱疹病毒，在免疫抑制或免疫不成熟的个体中造成很高的发病率和死亡率。
最近的几篇文献综述分析了 hCMV的生物和临床表现(Landolfo S et al,2003 ；Gandhi M and Khanna R, 2004 ；Soderberg-NaucIer C, 2006a)。这种病韋病原体感染世界上大多数人口，儿童期时在接触了体液后获得，因为该病毒通过上消化道或呼吸系统的内皮细胞或上皮细胞进入，或通过生殖泌尿系统进入。hCMV的血清阳性在发展中国家或低收入区域中中更加普遍。
在原发感染之后，hCMV可以以潜伏的状态在骨髓细胞系统的特异性宿主细胞中存在，在许多不同类型的细胞(造血细胞、上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞)中复制和传播，并且避开宿主的免疫系统。hCMV在健康人中通常是无症状的，因为hCMV感染和传播是被保持在免疫系统的控制之下的，但是很少达到全部hCMV的清除。实际上，hCMV病毒已经发展了使病毒的基因组以潜伏的状态保留在选择的位点的有效机制。
任何削弱免疫功能的情況，如压カ状态或特殊的治疗，可以导致hCMV激活。hCMV临床表现(如视网膜炎、小肠结肠炎、肺炎、胃炎或肝炎)会在病毒的原发感染、再感染或激活之后发生。大约1 0%的婴儿在从其母亲经由胎盘、在分娩中或通过哺乳传播之后的6个月被感染。
hCMV病毒由二十面的核壳体构成，其含有线形、230kb长的双链DNA基因组。hCMV基因组的表达是由复杂的级联转录事件控制，其引起超过200种与多种涉及病毒感染、潜伏和复制的生物活性相关的蛋白质的合成(Britt W and Mach M，1996)。
结构蛋白形成非常复杂并且仍未完全确定的病毒体包膜。它包括与在其它疱疹中确定的结构蛋白同族的糖蛋白，其可以在病毒体中形成ニ硫键连接的蛋白质复合物:gCI (只包括gB)、gCII (包括gM和gN)和gCIII (包括gH、gL和g 9 )。gB, gH和gN还已被用于基因分型 hCMV 菌株(Coaquette A et al.，2004 ；Dar L，2007)。
糖蛋白gN和gM是最丰富的，并且与gH和gB —起显示出是hCMV包膜和宿主细胞表面之间的最初的相互作用所必需的，因此对于产生感染性的hCMV是必需的。基于这个原因，以gB、gH、gN和/或gM为靶标的化合物可以通过在hCMV感染、再感染或激活之后阻止循环的hCMV进入细胞来有效地抑制hCMV的感染。
因为可用的治疗选择很少，因此hCMV感染的治疗是比较困难的。目前可用的抑制病毒复制(Ganciclovir、Cidofivir、Foscarnet、Maribavir和其它的还在开发中的药物)的药物化合物产生了显著的临床进展，但是可能会出现到了口腔生物活性低、效カ低、出现hCMV抗性(由于病毒目标中的突变)和剂量限制性毒性的问题(DeClercq E，2003 ；Baldanti F and Gerna G,2003 ；Gilbert C and Boivin G,2005)。
在移植安置(transplantation setting)和产前预防中需要预防和治疗hCMV感染的新方法，特别是对于免疫功能低下的个体。事实上，在HIV患者和器官移植接受者体内，hCMV是临床上重要的机会致病菌，其会造成不同于移植排斥的移植失败，导致发病和死亡(Puius Y and Snydman D，2007)。骨髓和实体器官移植接受者数量量的增加使hCMV临床表现的可能性提高，如hCMV视网膜炎(ffiegand T and Young L，2006)。此外，hCMV是出生缺陷(如听觉丧失 、发育延缓或智力迟钝)的主要感染原因，这些出生缺陷是由于通过hCMV感染的母亲传播的先天的或围产期的hCMV感染(Griffiths P and Walter S，2005)。
因此，提供用于普遍的事先性、预防性的hCMV特异性治疗的药物是重要的，例如用于预防移植接受者中(Hebart H and Einsele H, 2004 ；KaKl A et al., 2005 ；Snydman D,2006)、患有hCMV相关的神经病的患者(Griffiths P，2004)中或高危妊娠(Schleiss M，2003)中的hCMV疾病从而预防垂直传播并危及胎儿和新生儿生命的hCMV感染。
此外，抗hCMV的药物组合物可以用于治疗其它的传播更广泛的疾病(如心血管疾病和自身免疫疾病，或某些类型的癌症)，其中hCMV是潜在的辅助因子并且/或在免疫抑制治疗中可被激活。例如，目前hCMV是如肿瘤入侵和免疫逃避中的长期并发症的疾病的越来越重要的人类病原，因为hCMV感染对于细胞凋亡、分化和迁移具有肿瘤调节作用。在自体免疫或血管疾病中，hCMV感染可以改变免疫和炎症反应(Cinatl J et al.,2004 ；Soderberg-Naucler C,2006b)。
一种预防hCMV感染的可替代的方法是在高危患者人群中提供保护的范围内接种疫苗。但是，还未完全了解接种疫苗和产生的免疫反应之间的关系，并且最佳的hCMV疫苗法(使用特异性的候选抗原或活的减毒疫苗)看起来取决于要被保护的患者人群。因此，预防接种法仍然在评价之中(McLean G et al.,2006 ；Schleiss M，2005)。
由于目前hCMV感染的药理学策略的局限，对于宿主与hCMV的关系，尤其是hCMV特异性免疫反应的认识越来越多，使得基于免疫的疗法成为取代或补充现有的用于成功治疗hCMV相关并发症的疗法的良好选择(Gandhi M and Khanna R，2004)。最近，通过输入(transfer,移植)病毒特异性记忆B细胞，在免疫缺陷小鼠中获得了对于CMBV感染的致死过程的长期保护，这表示这样的细胞具有治疗效用(Klenovsek K et al.，2007)。
对于基于细胞的疗法的一种更简单备选方法是被动免疫疗法，该疗法是将包含具有确定的抗人或病毒抗原(例如hCMV)的中和活性的治疗抗体的药物组合物给予个体。
已经根据针对人类或病毒治疗目标的抗体和抗体片段的抗原结合和生物特性来设计该疗法(Dunman P and Nesin M, 2003 ；KellerM and Stiehm E,2000)。被动免疫疗法已经被引入到临床实践中，迅速増加了治疗各种疾病(包括感染性疾病、免疫调节疾病和癌症)的机率。在其免疫系统不能产生阻止和/或消灭目标分子所需的量和/或特异性抗体的患者中，该方法是尤其有效的(Chatenoud L, 2005 ；Laffly E and Sodoyer R, 2005)。
在hCMV治疗的领域中，该方法是通过静脉给药人免疫球蛋白制剂来实施的，人免疫球蛋白制剂是通过收集具有高滴定量的抗hCMV抗体的人血清而获得的，并且被商业化以用于临床应用(名称为Cytotect或CytoGam)。但是对于抑制hCMV感染，这些产品只是部分满足要求的解决方案。事实上，在免疫功能低下的患者中使用这种疗法，主要是为了事先性治疗和预防，其中通常同时给予抗病毒剂(Marasco W and Sui J,2007 ；Nigro G etal.,2005 ；Bonaros Net al.,2004 ；Kocher A et al.,2003 ；Kruger R et al.,2003)。此夕卜，如文献(Bayry J et al, 2007 ；Hamrock D, 2006)中所报道的,这样的制剂的安全问题和短缺越来越弓I起人们的关注。
具有对hCMV包膜上表达的抗原具有高亲和性并且能够中和感染的人类重组抗体可能会成为被动免疫的更适合的药物。事实上，尽管包膜蛋白的化学计量是可变的，并且会发生改变从而逃避宿主免疫反应，但几种hCMV糖蛋白仍会引起包括产生病毒中和抗体的強烈宿主免疫反应。该反应被认为是宿主免疫力的关键组成，并且代表了抗体和疫苗开发的目标。
由于鼠单克隆抗体的固有局限，人单克隆抗体是用于临床应用的最优选的抗体。但是由于在评价这样的抗体的效カ的研究中，例如在造血干细胞移植(Boeckh M et al.，2001)，或视网膜炎(GilpinA et al.，2003)，并没有发现临床有效性，因此用于hCMV治疗的先前确定的人类抗体的发展(Matsumoto Y et al., 1986)已经中断。这些失败的试验使得人们有理由进行g在选择更有效中和最广泛的hCMV病毒株的人类单克隆抗体的进ー步研究。CMV感染的治疗可能受益于具有更有效的包含从培养的人类B细胞纯化的单克隆抗体或作为通过引入到哺乳动物细胞系中的人类序列表达的重组蛋白产生的单克隆抗体的药物组合物。
发明内容
本发明提供了新型的抗体序列， 其结合并且中和hCMV，并且可以被用于检测、治疗、抑制、预防和/或改善hCMV感染或hCMV相关疾病。
从hCMV血清反应阳性的个体获得人B细胞，并且使其永生化。分离该永生化人B细胞的多克隆群体从而产生次培养物(继代培养物，subculture)，检测该次培养物以确定在细胞培养物上清液中是否存在体外中和hCMV感染性的抗体(免疫球蛋白G，IgG)。尤其是，确定命名为26A1的次培养物分泌的抗体的中和活性类型、同种型和无性繁殖能力。抗体被从两种原始细胞培养物上清液亲和纯化并作为重组人单克隆抗体，使用体外模型来确定对于hCMV感染的hCMV特异性中和活性。该抗体可以被用于鉴定hCMV包膜上的中和抗原。
扩增、克隆并编码26A1次培养物分泌的抗体可变区的DNA序列，并且进行测序。分析对应的蛋白质序列从而确定负责hCMV特异性生物活性的互补决定区(CDR)。使用产生重组蛋白的合适技术，这些序列可以被用于产生完整抗体、抗体片段或任何其它的功能蛋白形式(例如生物活性肽、融合蛋白)的具有hCMV特异性结合和中和特性的蛋白质。
可以使用本发明的蛋白质来制备在治疗hCMV感染和hCMV相关素乱中具有治疗、预防和/或诊断功效的组合物，本发明的蛋白质或者是重组蛋白，或者是从26A1次培养的细胞培养物纯化的天然抗体。这样的组合物可以被用于补充或替代现有的基于抗病毒化合物和/或静脉免疫球蛋白(IVIg)制剂的hCMV疗法。
在以下的详细介绍中提供了本发明的其他实施方式。
图1 JA)如文献(Rothe M et al，2001)中所描述的被组装并且用于gB_特异性ELISA中的CG3抗原的图示。重组杂交融合CG3抗原对应于来自hCMV病毒株AD169 (SwissProt Ace.N0.P06473 ;氨基酸 27-84)和 Towne (SwissProt Ace.N0.P 13201 ；氨基酸27-84)的gB抗原区2(AD2 ；SEQ ID NO:1和2)的组合。AD2区包含在不同的病毒株中都是保守的并且显示被中和抗体识别的位点(具有下划线的氨基酸70-81) (Qadri Iet al., 1992 ；KropffB et al.，1993)。(B)用于 gH 特异性 ELISA 检测的 gH (Ag)-GST 融合蛋白中包括的gH抗原的图示。重组抗原gH(Ag)-GST相当于hCMV病毒株VR1814(ReVelloM et al.,2001)的gH氨基末端区(氨基酸16-144 ;SEQID NO:3)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)之间的符合读框的融合。gH氨基末端包含被中和抗体识别的线性抗体结合位点(具有下划线的氨基酸 34-43) (Urban M et al.，1992)。
图2:识别并且表征含有结合并且中和hCMV的IgG抗体的次培养物(孔)的选择过程总览。通过使用PCT/EP2005/056871公开的基于EBV的永生化方法来将hCMV患者的B细胞永生化获得次培养物。在hCMV微量中和试验中直接筛选显示出显著细胞生长的次培养物(孔)的上清液。然后使用gB-和gH-特异性ELISA来筛选显示出中和活性的上清液。在灰色椭圆形中指出了每次筛选试验的阳性孔的数量。
图3:天然26A1抗体的hCMV中和活性，使用蛋白A通过亲和层析从生长在无血清培养基中的源于26A1次培养物的细胞培养物来纯化该天然26A1抗体。在hCMV中和试验(包括人胚胎成纤维细胞(HELF)与hCMV病毒株AD169(1，000PFU/反应；IC50 0.82 u g/ml)，或包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与hCMV病毒株VR1814(1，000PFU/反应；IC50
0.67 u g/ml)中进行计量响应曲线。
图4:永生化人B细胞的含IgG上清液的gH(Ag)-特异性(A)和CG3抗原-特异性(B)结合活性。只使用细胞培养基(培养基，阴性对照)或使用次培养物26A1、1F7(如专利申请EP07111741介绍的，从CMV5供体获得的永生细胞中鉴别的)和8C10 (如本专利申请和专利申请EP07115410中介绍的，从CMV7供体获得的永生细胞中鉴别的)的上清液来进行ELISA。点线代表了认为次培养物为阳性的阈值(0.D.=0.1)。
图5: (A) 26A1 IgG(VH 26A1 ；SEQ ID N0.:4和 5)的重链可变区的DNA(小写字母，393个碱基对)和蛋白质(大写字母，131个氨基酸)共有序列的比对。(B)显示了预测的CDR(HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ;下划线；SEQ ID N0.:6、7 和 8)的 VH26A1 的蛋白质共有序列。在共有蛋白质序列之下显示了由分离的大肠杆菌(E.coli)转化株的质粒中克隆的DNA序列编码的可选氨基酸。
图6:26A1 IgG (VL 26A1 ；SEQ ID N0.:9 和 10)的轻链可变区的 DNA (小写字母，330个碱基对)和蛋白质(大写字母，110个氨基酸)共有序列的比对。(B)显示了预测的VL 26A1 的 CDR(LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 ;下划线；SEQ ID N0.:11、12 和 13)的 VL26A1 的蛋
白质共有序列。
图7:重组人2 6A1单克隆抗体(SEQ ID N0.:15)的重链的DNA (小写字母，1449个碱基对；SEQ ID N0.:14)和蛋白质(大写字母，482个氨基酸)共有序列的比对。如使用SignalP 3.0在线预测程序确定的，信号肽最可能的切割位点是在位置19和20 (VLS-QV)之间(Bendtsen J et al，2004)。在26A1次培养物中的细胞产生的cDNA中最初识别的序列具有下划线(见图5)。氨基酸153-482相当于人IgGl的重链恒定区(SwissProtAce.N0.P01857)。[0032]图8:重组人26A1 IgG (SEQ ID N0.:17)的重链的DNA (小写字母，705个碱基对；SEQ ID N0.:16)和蛋白质(大写字母，234个氨基酸)共有序列的比对。使用SignalP 3.0在线预测程序确定了信号肽最可能的切割位点是在位置16和17 (CTG-SV)之间(BendtsenJ et al，2004)。在26A1次培养物中的细胞中最初识别的序列具有下划线(见图5)。氨基酸 1-19 和 131-234 对应于人 Ig 入链的 1-19 和 131-234 (SwissProt Ace.N0.Q8N355)。
图9:与蛋白A纯化的天然26A1抗体相比较的重组人26A1抗体的hCMV中和活性。在微量中和试验(A ；1000PFU/反应，感染后72小时)或在空斑减数实验(B)中使用HELF细胞和AD169hCMV病毒株来测试活性。
图10:与蛋白A纯化的天然26A1抗体相比较的重组人26A1单克隆抗体的hCMV中和活性。在微量中和试验(A;1000PFU/反应)中使用HUVEC人细胞和VRI814hCMV病毒株，或在空斑减数试验(B ；1000PFU/反应)中使用LELF人细胞和AL-1hCMV病毒株来检测活性。
具体实施方式
PCT/EP2005/056871中描述的方法可以使从血液中含有具有生物活性的抗体(例如结合和/或中和人或病毒靶标的抗体)的个体获得的同种型特异性人B细胞，在获得分泌表现上述生物活性的抗体的细胞的多克隆群体的范围内有效地永生化。然后，在低细胞密度(例如，每孔50、20细胞或者更少)克隆的単一步骤之后，可以使用通过这些方法获得的次培养物的上清液来进行广泛的筛选试验。以这种方式可以获得永生化B细胞的多克隆群体，其中可以表征分泌IgG的次培养物的所有组成成分，并且由此可以识别大量具有理想的抗原结合特异性和/或生物活性的人单克隆IgG。
在这种情况下，从 其血清表现出作为生物活性的很强的hCMV中和活性的hCMV患者的血液获得了分泌IgG 的永生化B细胞的多克隆群体。在20个细胞每孔的単一亚克隆步骤和合适的培养条件下，该多克隆群体被用于产生数千的含有永生化人B细胞的次培养物。然后，在选择那些表现更强活性的范围内，在其中有数百个有效生长的细胞培养物的上清液中检测特异性生物活性，随后确定同种型和(如果可能的话)分泌抗体的抗原表位。
最有前景的次培养物之一被命名为26A1，其被用于从大規模培养物纯化天然的人抗体和从永生化B细胞分离编码这样的抗体的DNA。该DNA序列被用于产生作为重组人抗体的天然人抗体。天然和重组人26A1单克隆抗体被用于进行更广泛的生物试验并评价它们在hCMV相关临床应用中的可能功效。
实施例显示出细胞培养物上清液、天然人抗体和重组人抗体怎样表现出相同的生物活性，该生物活性是在原始血清和人EBV永生细胞的多克隆群体中确定的。这些证据证实了 PCT/EP2005/056871中描述的方法可以能够识别、鉴定和产生生物活性的、同种型-持异性的、天然和重组的人单克隆抗体。事实上，细胞永生和在细胞培养条件下生长的完整方法可以以快速有效和直接的方式获得人抗体的全部组成(repertoire)。此外,可以将由此方法产生的细胞冷冻并其它时间或平行地进行不同的生物活性和/或抗原的筛选。
在一种实施方式中，本发明提供了包含与26A1抗体(SEQ IDN0.:8)HCDR3(重链可变区的⑶R3)序列具有至少90%的同一性的序列的蛋白质。连同HCDRl和HCDR2(SEQ IDN0.:6 和 SEQ ID N0.:7)，该 HCDR3 包括在 26A1 抗体(VH 26A1 ;图 5 ；SEQID N0.:5)的重链的可变区内。该序列由DNA序列(图5A ; SEQ IDN0.:4)编码，使用从分泌26A1抗体的原始次培养物获得的细胞来扩增和克隆该DNA序列。因此本发明的蛋白质含有26A1抗体(图 5B)的 HCDRl 的序列(SEQ ID N0.:6)和/或 HCDR2 (SEQ ID N0.:7)，以及 26A1 抗体的H⑶R3(SEQ ID N0.:8)。这样的蛋白质可包含与26A1抗体的重链可变区的完整序列至少90%的同一性的序列。
26A1抗体还含有轻链可变区，对于此，使用相同的方法，已经确定了 DNA(SEQ IDN0.:9)和蛋白质(SEQ ID N0.:10)序列，以及特异性 LCDR(SEQ ID N0.:11、SEQ ID N0.:12和SEQ ID N0.:13)(图6)。因此本发明的蛋白质还可以包含选自由26A1抗体的单ーLCDR(SEQ ID N0.=IUSEQ ID N0.:12 和 SEQ ID N0.:13)构成的组中的ー种或多种序列，其可以作为包含具有与VL 26A1(图6B;SEQ ID N0.:10)至少90%的同一性的序列的蛋白质序列来提供。当需要包含作为轻链和重链的天然VL 26A1和VH 26A1的人重组抗体(以包含两条轻链和两条重链的四聚体复合物的天然构造形式，或以作为天然抗体的重组变异体的単一蛋白质形式)时特别应用此蛋白。
无论如何指征同一性水平，都应该在本发明的相关序列的整体长度上确定该同一性水平。
`[0042]如实施例中所示，26A1抗体的HCDR3可以被认为是表征能够结合和中和hCMV的特异性人抗体的抗原结合区。尽管如此，通常需要抗体的几种或者全部CDR从而获得抗原结合表面，HCDR3是抗体之间不仅在序列上而且在长度上表现出最高差异性的CDR。这样的多样性是用于通过体液免疫系统识别任何必要的抗原的结合区的基本要素(Xu and Davis,2000 ；Barrios Y et al.2004 ；Bond C etal.，2003)。或者，如最近的综述，在保留了原始的结合特性的非常短的蛋白质中，⑶R的组合可以彼此连接(Ladner R，2007)。
因此可以使用作为hCMV结合部分(moiety)的26A1抗体的HCDR，联合或不联合26A1抗体的其它⑶R，来产生hCMV中和蛋白，其可以在抗体蛋白质框架内(KnappikA etal.,2000)被表达，或在与抗体无关的蛋白质框架内(Kiss C et al.，2006)被表达。
形成26A1抗体(或选择的区域，如分离的HCDR和LCDR)的重链和轻链的可变区可以包括在设计为功能抗体片段的任何其它蛋白质中，如在文献中以不同的名字描述的，如Scfv (单链可变片段)、Fab (可变重链/轻链异源ニ聚体)、双价抗体、多聚肽体(peptabody)、VHH(重链抗体的可变区)、分离的重链或轻链、双特异抗体，或用于临床应用的其它工程抗体变异体(Jain M et al., 2007 ；Laff Iy E and Sodoyer R, 2005)。
可以使用26A1抗体的序列通过轻链可变区(VL)改组(shuffling)的方法来产生备选的抗体。事实上，可以产生几种不同的抗体，并且在确定具有提高的亲和力、稳定性和/或重组产量的特性的VH/VL组合的范围内，使用单一重链可变区VH(如26A1的ー个)与VL区文库的组合来检测hCMV特异性活性(Ohlin M etal.，1996 ;Rojas G et al.,2004 ；Watkins N et al.,2004)。
开发新型的生物活性肽的新方法还显示了合成含有L-氨基酸和/或D-氨基酸的CDR衍生的多肽的可行性，该多肽保持了原始的活性，并且可能具有更合适的药理学分布(Smith J et al., 1995 ；LeviM et al., 2000 ；ffijkhuisen A et al.,2003)。
因此，26A1抗体的HCDR3以及与26A1抗体的HCDR3高度相似的序列、包含其的融合蛋白以及源自其的合成多肽(例如含有L-氨基酸、D-氨基酸，以正常的或以逆反构造)可以被检测并且被用作hCMV结合和中和蛋白质。
此外，已知可在特定的位置修饰抗体从而产生具有改良特性的抗体，尤其是对于临床应用(如更好的药物动力学特性或对抗原更高的亲和力)。可以在CDR和/或26A1抗体的框架中制造这些变化，可以通过应用任何利用亲和カ成熟的抗体合理设计的专用技术和其它方法来选择序列(Kim S et al.，2005 ；Jain M et al，2007)。
一般而言，本发明的蛋白质被提供作为抗体，如具有特异性同种型的完整人单克隆抗体。例如，IgG同种型是几乎所有经批准的治疗抗体的抗体形式(LafTly E andSodoyer R, 2005)。但是，将分离自HIV中和IgGl的抗原表位转移到人IgA序列上，得到的抗体也能够抑制HIV感染(Mantis N et al.，2007)。
本发明的蛋白质还可以被提供作为抗体片段、生物活性肽或融合蛋白。即使不提高的话，所有的这些备选分子也应该保持被确定用于26A1抗体的原始的hCMV结合和中和特性。在融合蛋白的情况中 ，异源蛋白质序列可以位于26A1衍生的序列的N-或C-末端，而不影响hCMV特异性部分(moiety)(例如，抗体片段)的正确表达和生物活性。
术语“异源蛋白质序列”表示不是天然存在于hCMV特异性部分(例如，抗体片段)的N-或C-末端位置的蛋白质序列。一般通过重组DNA技术来融合编码该蛋白质的DNA序列，并且该DNA序列包含编码至少5个氨基酸的序列。
通常选择这样的异源蛋白质序列用于提供hCMV特异性抗体片段附加的特性来进行特异性诊断和/或治疗使用。这样的附加特性的实例包括:更好的检测或纯化方式、附加的结合部分(moiety)或生物配体或融合蛋白的翻译后修饰(例如，磷酸化、糖基化、泛素化、SUMO化修饰或内部蛋白水解切割)。
可替代地(或除了与异源蛋白质序列融合)，本发明的蛋白质的活性可以通过与不同的化合物，如治疗、稳定或诊断制剂的结合来被提高。这样的制剂的实例是可检测到的标记(举例来说，放射性同位素、荧光化合物、毒素、金属原子、化学发光化合物、生物冷光化合物或者酶)，其可以使用化学连接物或聚合物来被结合。可以通过与其它的治疗蛋白质(如改变诊断或治疗应用中的代谢和/或稳定性的蛋白质或聚合物)结合来提高hCMV特异性生物活性。
在文献(NilssonJ et al, 1997 ； " Applications Of Chimeric GenesAnd HybridProteins " Methods Enzymol.Vol.326-328, Academic Press, 2000 ;W0 01/77137)中提供了选择和设计蛋白质部分、配体和合适的连接物的方法，以及用于构造、纯化、检测和使用融合蛋白的方法和策略，并且这些方法和策略在临床和研究实验室中是普遍可获得的。例如，融合蛋白可以含有被市售抗体识别的序列(包括多聚组氨酸、FLAG、c-Myc或HA的标签蛋白)，其能够有助于体内和/或体外融合蛋白的识别，或其纯化。
其它的蛋白质序列可以通过直接的荧光分析(如在绿色荧光蛋白的情况下)，或通过特异性的底物或酶(举例来说，使用解蛋白位点)来识别。可以通过与载体蛋白融合来提高hCMV特异性抗体、抗体片段、生物活性肽和融合蛋白的稳定性，载体蛋白如噬菌体外壳蛋白(cp3或cp8)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、牛血清白蛋白(BSA)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
26A1抗体是本发明的主要目标，在特定次培养物的上清液中，它已经被鉴定为人IgGl单克隆抗体，其由于中和hCMV的能力而被选择。该特性通过使用细胞培养物的上清液(表I)在体外进行中和试验来确定，并且随后确定为蛋白A纯化的(图3)和重组的(图9和10 ；SEQ ID N0.:15和17)人单克隆抗体。
使用病毒抗原中已知的多个hCMV中和抗原表位没有确定出被26A1抗体识别的特异性hCMV抗原(图1、图2和图4)。因此，该IgG抗体可以被用于确定hCMV中和抗原表位和结合这样的抗原的蛋白质(例如，以抗体、抗体片段、生物活性肽、融合蛋白或任何天然/重组蛋白质的形式)，该蛋白质能够通过识别这样的抗原表位来中和hCMV感染。
过去，还使用利用hCMV特异性截短蛋白或合成多肽的ELI SA或蛋白质印迹(Greijer A et al.，1999 ;0hlin M et al.，1993)，以这种方法，针对于 hCMV 的抗体根据它们的抗原被限定为糖蛋白H(TO94/16730、TO 94/09136、TO 92/1 1018)、糖蛋白B(EP248909、W0 93/21952)或糖蛋白 M/糖蛋白 N(Shimamura M et al.,2006) 此外 hCMV病毒的其他组成不仅影响病毒嗜性，而且可以成为hCMV中和抗体的目标，如在pUL130和pUL128(ffang D and ShenkT，2005)的情况中。因此，被26A1抗体识别的CMV抗体/抗原表位可以通过根据以上所引的文献的不同的体外试验来被识别。
本发明的另外ー种实施方式是由26A1次培养物分泌的人IgGl抗体，其可以作为结合和中和hCMV的蛋白A纯化的天然抗体来被提供。该IgGl抗体可以被用于识别也能够结合并中和hCMV的竞争蛋白。在以上的描述和实施例中提供了相似的蛋白，尤其是作为重组人抗体和抗体片段。
与被26A1抗体和以上所确定的其它蛋白识别的病毒抗原表位相关的hCMV中和的机制可以通过现有的对特异性结 构hCMV蛋白和/或病毒株的试验来表征，如在使用人血清组(Navarro D et al,1997 ；Klein M et al.,1999 ；ffeber B et al.,1993 ；Rasmussen L etal, 1991 ； Mar shall G et al., 2000)或单克隆抗体组(Schoppel K et al., 1996 ；SimpsonJ et al., 1993 ；Gicklhorn D et al.，2003)的文献中指出的。
本发明的其它目的是编码任一以上确定的抗体、抗体片段、融合蛋白、生物活性肽或分离的HCDR和LCDR的核酸。实施例提供了这样的序列，尤其是作为编码26A1重链(SEQID N0.:4)和轻链(SEQ ID N0.:9)的完整可变区的(图5A和6A)。这些DNA序列(或选择的区域，如那些编码特异性HCDR和LCDR的；图5和6)可以转移到载体中从而以抗体的可选形式(举例来说，完整的、亲和力-成熟的或CDR移植的或抗体片段)之一或融合蛋白来进行表达。这些核酸可以包含与SEQ ID N0.:4具有至少90%同一性的序列，根据仅需要来自于26A1的重链的序列，还是需要来自于重链和轻链的序列，这些核酸具有或不具有还包含了与SEQ IDN0.:9具有至少90%同一性的序列的序列。
当需要的是完整的人抗体的时候，该抗体应该还包含从IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区构成的组中选择的重链恒定区。优选，重链恒定区是人IgA、IgGl (如在26A1次培养物鉴定的天然26A1抗体中的)、IgG2或IgG4。编码26A1重链和轻链的完整可变区的核酸序列已经通过PCR反应和含有得到的PCR产物的载体(其被用于转化E.coli细胞)被克隆并且鉴定。这样的序列可以被转移到(部分或者完全)到其它的载体中，尤其是到载体的表达框中或可操作地连接到合适的调节序列(举例来说，启动子、转录终止子)的其它载体的表达框中。
可以使用这样的载体来转化合适的宿主细胞，人26A1单克隆抗体或任何源自这种抗体的其它蛋白质序列能够表达为重组蛋白。包含本发明的核酸的宿主细胞可以为原核或真核宿主细胞，并且应该能使理想的重组蛋白被分泌。产生这样蛋白质的方法包括:在合适蛋白质表达的条件下培养转化了包含其编码序列的表达载体的宿主细胞，从宿主细胞培养物中回收该蛋白质。该载体应该包括启动子、核糖体结合位点(如果需要的话)、起始/終止密码子、前导/分泌序列，其可以驱使理想蛋白质的单或双顺反子转录的表达。该载体应该允许重组蛋白质在原核或真核宿主细胞中进行表达。然后可以分离基本上在这样的细胞中富集的细胞系从而提供稳定的细胞系。
通过应用常规的重组DNA技术可以使用核酸和宿主细胞来产生本发明的蛋白质。简单地说，理想的DNA序列可以通过限制酶来消化初始的克隆载体来提取，或者使用这样的载体作为聚合酶链式反应(PCR)的模板和用于特异性扩增重链和轻链的完整可变区或只是其部分(举例来说HCDR3序列)的PCR引物来扩增。然后，如在如何克隆和产生重组蛋白的书籍和文献综述中描述的，包括牛津大学出版社出版的“A Practical Approach”系列(“DNA Cloning 2 !Expression Systems”，1995 ;“DNA Cloning 4:MammaIian Systems”，1996 ； " Protein Expression" ,1999; " Protein Purification Techniques" ,2001),这些DNA片段可以被转移到用于在原核或真核宿主细胞中表达的更为合适的载体中。
对于真核宿主(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，根据宿主的特性可以使用不同的转录和翻译调节序列。它们可以来自病毒源，如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猴病毒等，其中调节信号与具有高水平表达的特殊基因相关。实例为疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择转录起始调节信号，其能够瞬时(或组成性)阻遏和激活以及调节基因表达。
编码重组蛋白的序列可以被改造并且再克隆从而在DNA水平进行修饰，仅DNA水平的修饰能够例如使用其中密码子选择和限制性内切位点是最适合于在特定载体和宿主细胞中克隆和表达的选择DNA序列的软件来确定(Grote A et al, 2005 ；Carton J et al.,2007)。
在其它的克隆步骤中，可以蛋白质序列与理想的抗体形式相连(Scfv、Fab、抗体片段、完整的人抗体等等)而添加或插入、取代或去除的ー个或多个内部氨基酸。这些技术还可以用于进ー步表征结构和功能以及一般蛋白质和特殊抗体的治疗性能的优化(Kim Setal.，2005)，以及用于产生可以使它们在体内稳定传送的载体(Fang J et al.，2005)。例如，通过选择特异性的Fe区从而融合到可变区中(Furebring C et al.,2002 ；LogtenbergT，2007)，通过产生单链抗体片段(Gilliland L et al.，1996)，和通过添加稳定肽序列(W001/49713)、聚合物或放射化学药品来化学修饰残基(Chapman A etal.，1999)，重组抗体还可以在结构和/或活性水平被改进。
编码重组蛋白的DNA序列，一旦插入到合适附加型或非同源或同源整合载体中，可通过任何合适的方法(转化、转染、结合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射)被引入到合适的宿主细胞中从而转化它们。选择特殊的载体时要考虑的重要因素包括:含有该载体的宿主细胞可被识别和选择的难易程度；理想的载体拷贝数量；和该载体是否能够在不同种类的宿主细胞之间“穿梭”。
可以通过引入ー种或者多种的标记(其可使含有表达载体的宿主细胞被选择)选择已经被引入的DNA稳定转 化的细胞。该标记还可以提供营养缺陷型宿主光养性、杀生物剂抗性，举例来说抗生素，或重金属，如铜等，并且如果需要的话，可以为可裂解的或阻遏的。可选的标记基因可以直接连接到要被表达的DNA基因序列，或通过共转染被引入到同ー细胞中。还可以需要其它的转录调节组件以用于最佳的表达。
宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。在原核宿主细胞中，优选的为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和大肠杆菌(E.coli)。在真核宿主细胞中，优选的是酵母、昆虫或哺乳动物细胞。尤其是，例如人、猴、小鼠、昆虫(使用基于杆状病毒的表达系统)和中国仓鼠卵巣(CHO)细胞(如实施例中所示)，提供给蛋白质分子进行翻译后修饰，包括正确的折叠或者在正确位置某些形式的糖基化。酵母细胞也可以进行包括糖基化的翻译后肽修饰。存在多种重组DNA策略，该策略使用强启动子序列和可用于在酵母中产生理想蛋白质的高拷贝数质粒。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物中的前导序列并且分泌含有前导序列的多肽(也就是前肽)。
可利用作为表达宿主的哺乳动物细胞系在所属领域中是已知的，并且包括很多可从美国标准生物品收藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但是不限于中国仓鼠卵巣细胞(CHO)、Hela、幼仓鼠肾脏细胞(BHK)、猴肾脏细胞(COS)、C 127、3T3、BHK、HEK 293、Per.C^、人黑色素细胞瘤细胞和人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其他细胞系。在杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料是以可试剂盒的形式商购获得的(例如，可从Invitrogen购得)。
对于长期的、高产量的重组多肽，优选稳定的表达。例如，可以使用表达载体转化稳定表达所需要的多肽的细胞系，该表达载体可含有复制的病毒源和/或内源表达组件和在相同或不同载体上可选择的标记基因。在引入载体之后，被转移到选择培养基之前，可使细胞在富集培养基中生长一天或多天。 选择性标记的目的是赋予选择抗性，其存在可以使成功表达被引入序列的细胞生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可以使用合适于细胞类型的组织培养技术来増殖。然后分离富含这样的细胞的细胞系从而提供稳定的细胞系。
在完整重组人免疫球蛋白的情况中，ー个重要的步骤是选择特异性的同种型和稳定区。在文献中广泛描述了专门用于表达具有理想的同种型和亚型(例如human IgA、IgGl、IgG2或IgG4)的抗体的载体。那么，在可以作为瞬时或稳定转化的细胞高水平地表达(Dinnis D and James D, 2005)的原核生物(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)；Sorensen H and Mortensen K, 2005 ；Venturi M etal, 2002)、植物(Ma J et al, 2005)或真核细胞中，完整抗体或融合蛋白可作为重组蛋白被表达。当必须使用包括体内试验的更精密的试验进行抗体的鉴定(其中可确定抗体的半衰期)时，这尤其是必需的。可以基于重组蛋白的表达水平进ー步选择宿主细胞。
另外，当蛋白质，特别是作为抗体，在真核宿主细胞中(尤其是哺乳动物细胞系)表达时，已设计了不同的载体和表达系统以产生稳定的转染细胞系库(Aldrich T et al.,2003 ；Bianchi A andMcGrew J, 2003) 还由于细胞培养条件的优化(Grunberg J et al.,
2003；Yoon S et al.,2004)和通过选择或工程改造具有更高水平的抗体产生和分泌的克隆(Bohm E et al., 2004 ；Butler M, 2005 ；),已获得了重组抗体的高水平、优化的稳定表达(Schlatter S et al.,2005)。
以上所确定的能够结合和中和hCMV的抗体、抗体片段、生物活性肽、融合蛋白和任何其它的蛋白可以使用为人熟知的技术(其可以使重组或非重组蛋白从细胞培养物或从合成制备中被分离)纯化。这些技术应该提供足够量的蛋白(微克到毫克的范围)从而进行用于hCMV相关的预防、诊断和治疗用途的更广泛鉴定和确认。基于此目的，重组或天然抗体的制剂在体内或体外试验中被检测(生物化学、组织或细胞试验，在啮齿动物或灵长动物中建立的疾病模型，亲和カ测量的生物物理学方法，抗原表位分析等)，尤其是使用实施例或文献中公开的那些用于研究hCMV发病机理和免疫生物学的任何试验。
可以使用文献中已知的基于器官或细胞的体外试验来确认作为人B细胞上清液的纯化制备物或作为重组蛋白表达的抗体(Eggers M et al.1998 ；Lam V et al, 2006 ；Reinhardt B et al., 2003 ；Forthal D et al., 2001 ；Goodrum F et al.,2002)。此外，可以在hCMV感染的动物中，尤其是在人宿主细胞可被移植的模型中，进行相关的临床前试验(Barry P et al., 2006 ；Gosselin J et al., 2005 ；ThomsenM et al.,2005)。
可以通过任何一个常规的已知用于纯化目的的方法来进行本发明的重组蛋白的纯化，也就是包括提取、沉淀、层析等的任何方法。尤其是，抗体纯化的方法可以使用装于柱中的固定凝胶基质(Nisnevitch M and Firer M, 2001 ；Huse K et al., 2002 ；HorensteinAet al.,2003),利用抗体对基质如蛋白A、蛋白G或合成的基质(Verdoliva A et al.,2002 ；Roque A et al.，2004)的强亲和力，或对于特异性的抗原或抗原表位的强亲和力(Murray A et al., 2002 ；JensenL et al.,2004)。在冲洗之后,通过pH值或离子强度的变化，蛋白被从凝胶上洗堤。或者，可以使用HPLC(高效液相色谱)。使用通常用于蛋白质纯化的水-こ腈溶液来进行洗堤。
以上所确定的使用26A1抗体序列的抗体、抗体片段、生物活性肽、融合蛋白和任何其它的化合物可被用于检测、治疗、抑制、预防和/或减轻hCMV感染。基于此目的，这样的化合物可以被用于制备用于处理hCMV感染的诊断、治疗或预防组合物。
尤其是，这样的化合物可与任何的药物可接受媒介或载体一起来被用于制备药物组合物。这些组合物还可以包含任何其它的治疗或预防的药物,如疫苗、hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白制剂、免 疫调节化合物和/或抗病毒化合物。文献提供了ー些作用于hCMV复制(Foscarnet、Vanganciclovir、Fomivirsen 或 Ganciclovir)并且已经在人中单独或与浄脉免疫球蛋白一起被试验的化合物的实施例(De Clercq E, 2003 ；Nigra G et al, 2005)
此外，最近的文献表明人单克隆抗体可被用于补充(如果可能的话，代替)现有的疗法，如静脉免疫球蛋白制剂和/或抗病毒化合物，提供了减少这样的药物组合物的频率和/或剂量的机会(Bayry Jet al.,2007)。
这些组合物可以包含以上所确定的基于人26A1单克隆抗体序列的序列和活性的抗体、抗体片段、生物活性肽、融合蛋白或任何其它化合物。该组合物还可以包含不同的hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白(IVIg)制剂和/或抗病毒化合物。不同的hCMV中和抗体应该以不同的抗原表位为特征，如文献或专利申请EP07114782、EP07115410和EP07111741(分别为10B7、8C10和1F7)中已经介绍的与gH|、gB或其它hCMV抗原相关的那些。事实上，文献显示了许多实施例，其中，当两种或多种针对于病毒或人目标的抗体被组合到药物组合物中时，得到的组合物可能具有提高的治疗效能，不是由于简单的附加效果而是由于特殊的协同效果(Logtenberg T, 2007)
包含任一以上确定的蛋白质(例如，抗体、抗体片段、融合蛋白、生物活性肽)和核酸的组合物可出于hCMV相关的诊断、治疗或预防的目的而使用并给予个体。这些组合物可以作为hCMV特异性的被动免疫的方式来给药，其提供治疗化合物，该治疗化合物能通过以hCMV病毒为靶标来抑制接受治疗的患者体内该病毒的増殖，并且潜在地阻止病毒感染在人群中的爆发。
根据特异性的应用，该组合物应该长期或短期提供化合物给人类受治疗者(尤其是怀孕妇女或任何其他的感染了 hCMV或被认为由于接触hCMV感染个体而具有hCMV风险的个体)。基于此目的，可以单剂量或多剂量和/或使用合适的装置，通过不同的途径来进行给药:肌肉、静脉、皮下、局部、黏膜，通过喷雾器或吸入器，作为滴眼液，以生物不能降解或可降解的基质材料，或使用微粒药物递送系统。尤其是，该组合物可以进行局部或眼部给药，其提供了使hCMV存在于粘膜和眼部中的有效的方法。此外，当被局部施用于伤ロ(Streit M et al, 2006)、角膜(Brereton H et al., 2005)或阴道(Castle P et al., 2002)时，抗体和抗体片段是有效的。
本发明的药物组合物应该为受治疗者提供在治疗或预防上有效剂量的化合物，以使该化合物的活性发挥足够长的时间。理想的效果是通过控制hCMV的感染、激活和/或再感染，以及通过至少减少ー些hCMV感染的临床表现，如视网膜炎或肺炎，来改善hCMV患者的病况(Landolfo S et al.，2003)。例如，根据给药的途径、给药剂数和个体的状态，该组合物可以约0.005mg/Kg体重到约50mg/Kg体重的有效量给药。
在具有诊断用途的组合物的情况中，或当体内给予受治疗者时，至少在给药之后
1、2、5、10、24或更多小时之后，使用在临床和研究实验室普遍使用的用于检测生物样品中的病毒的技术来检测化合物(例如，ELISA或其它的血清学检测)。使用本发明的蛋白可以进行hCMV的检测，取代或结合已知的已经建立的用于监控免疫活性和免疫低下宿主的危险人群中的慢性或急性hCMV感染的方法和规程，其中存在体外产生的数据和临床状态之间的相互关系(Gilbert G, 2002 ；Gerna G and Lilleri D,2006 ；Lazzarotto T et al,2007)。
治疗、预防或诊断hCMV、或hCMV相关疾病的方法可以包含以上所确定的蛋白或核酸的给药。该方法还可以进 ー步包含给药不同的hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白(IVIg)制剂和/或抗病毒化合物。
临床发展和应用应该基于抗体的药物代谢动力学和药效学(Lobo E et al.，
2004；Arizono H et al., 1994)、临床前期和临床安全数据(Tabrizi M and Riskos L,2007)并遵守用于治疗和人的体内诊断的单克隆抗体的生产和质量控制的国际标准(Harris R et al.2004)。
本发明的蛋白还可以用于制备检测、治疗、抑制、预防和/或减轻被确定为hCMV相关或与hCMV有关的疾病的其它更广泛分布的疾病(如心血管疾病和自身免疫疾病，或某些类型的癌症)的组合物。在这些情况下，hCMV被认为是可能的辅助因子，因为该病毒与细胞/免疫学炎症过程(通过刺激Fe受体、细胞黏附分子、趋化因子和细胞因子的表达)、自身免疫活性(例如，在动脉粥样硬化、心瓣手术后的再狭窄)、以及导致细胞凋亡、分化和迁移(例如在血管中和活跃増殖的细胞中)的抗原呈递途径(通过MHC类I和II的表达)的改变有关是公知的(Cinatl J et al,2004 ；Soderberg-NaucIer C,2006b)。
此外，还发现hCMV感染与细胞代谢的改变(Munger J et al.，2007)、阻遏(或抑制，depression) (Phillips A et al., 2007)或血栓形成事件的危险因素(Fridlender Zet al.,2007)有夫。还在癌症患者(Sandherr M et al.，2006 ；Han X，2007)或患有结缔组织炎症的患者(Yoda Y et al.，2006)，以及总体说来在接受如皮质固醇类的免疫抑制治疗(Yamashita M et al.，2006)或化学疗法或其它的抗体免疫抑制治疗方案(O' Brien Set al.,2006 ；Scheinberg P et al.，2007)的患者中发现了 hCMV的激活和相关的并发症。
通过以下的实施例来描述本发明，这些实施例不应以任何方式被解释为限制本发明。
实施例
实施例1:分泌中和hCMV感染性的人单克隆抗体的细胞培养物的产生
材料与方法
血清中具有中和hCMV的IgG抗体的人供体的选择
根据PCT/EP2005/056871中和以下总结的文献中概述的来进行hCMV特异性检测。
根据基于人胚肺成纤维细胞(HELF细胞)和hCMV AD 169病毒株(ATCC的hCMV实验室病毒株，编号为VR-538)的hCMV微量中和试验来检测hCMV中和抗体。
还可以使用作为从怀孕妇女的宫颈拭子回收的临床分离物的后代的促内皮功能的(endotheliotropic) hCMV VR1814 病韋株(Revello M et al., 2001)和人胳浄脉内皮细胞(HUVEC)来进行hCMV微量中和试验。通过脐带静脉的酶处理和在添加了 2%胎牛血清(FBS)、人重组血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(hEGF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、氢化可的松、抗坏血酸、肝磷脂、庆大霉素和两性霉素B(姆一种均为Iii g/ml)的内皮细胞生长培养基(EGM-2, Cambrex BioScience)中进行培养来获得这些细胞。以传代培养2-6代的细胞进行实验。
用于研究使用临床和实验室病毒株的hCMV感染和复制的HELF和HUVEC细胞的使用已经在许多文章中进行了描述(GernaG et al.,2002) 在这种情况中，细胞被放置于IOOu I生长培养基中的96孔板的平底孔上(2.0-2.5 X IO4/孔)，该培养基含有具有10%胎牛血清(FCS)、ImM丙酮酸钠(NaP)和GPS (2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 U g/ml链霉素)的最低基本培养基(MEM ;Gibco-BRL)。细胞在37°C培养24小时。
将50 ill的含抗体样品(人血清、细胞培养物上清液或指定浓度的蛋白A-纯化的天然或重组IgG)与实验室病毒株hCMV AD169 [在50iU具有5% FCS的MEM中500个空斑形成単位(Pfu);混合物的总体积是IOOiU] —起在37°C孵育I小吋。然后将抗体制备物与病毒的混合物加入到ffiLF细胞单层(用于hCMV AD 169和AL-1病毒株)或HUVEC细胞单层(用于hCMV VR 1814)中，并且孵育I小吋。从细胞单层中弃除生长培养基，并且用抗体-病毒混合物置換。然后在2000g将板离心30分钟，并且于37°C下在5% CO2中孵育90分钟。添加生长培养基(100 u I)，培养物再在孵育器中保持72小吋。
以间接免疫过氧化物酶染色，通过染色hCMV中间早期抗原(IEA，IE1+IE2)来测量B细胞上清液对hCMV感染性的作用。细胞单层用丙酮/甲醇溶液(储存在_20°C )固定I分钟，然后以PBS清洗。将细胞在具有I % H2O2的PBS的0.1 % Triton X-100中在冰上透化5分钟，然后用PBS清洗。在室温下黑暗中，用含有50%甲醇和0.6% H2O2的PBS封闭内生过氧化物酶30分钟，然后用PBS洗涤。在室温下用10分钟的时间内加入50 u I 的蛋白封闭剂(UltraTech HRP 500-600 Test ；Streptavidin-Biotin UniversalDetectionSystem ；PN頂2391)，然后用PBS洗掉。在室温下，在60分钟内将鼠抗hCMVIEA(克隆E13 ；Argene Biosoft ；ref.1ト003)加入到孔中。在清洗之后，细胞与50 U I的生物素标记的抗人IgGニ抗(UltraTech HRP 500-600 Test ;抗生蛋白链菌素-生物素通用检测系统(Streptavidin-Biotin Universal Detection System) ；PN IM2391)或过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Ultratech HRP) 一起孵育10分钟。在20°C，在黑暗中，在30-45分钟内加入0.1% H2O2中的DAB底物(Merck ；n0.1.02924.0001)，通过用PBS稀释来停止反应。在显微镜下计数IEA-阳性的核。[0101]将仅培养基或者含有不相关的IgG抗体的细胞培养物上清液作为阴性对照。通过从125 V- g/ml开始的梯度稀释，WAhCMV血清反应阳性患者的血清中纯化的人IgG的市售制剂(Cytotect ；Biotest)被用作阳性对照。与阴性对照孔进行比较，将大于等于40%的IEA-阳性细胞的抑制定义为阳性。
使用Reed-Milnch法计算的50%抑制终点被认为是中和滴定量(NT):
NT =交叉抗体稀释[> 50%抑制]X [(大于50% -50%的抑制％ ) / (大于50%的抑制％ -小于50 %的抑制％ )]。
根据血清中结合hCMV糖蛋白gB或gH区域的IgG的存在选择人供体
根据PCT/EP2005/056871或制造商的说明进行hCMV-特异性结合试验，并且通过CMV特异性的市售IgG抗体混合物(Cytotect ;Biotest)来进行确证。在市售的结合hCMV病毒蛋白的人IgG特异性的ELISA(BEIA-CMV IgG Quant ;Bouty，编号为21465)和同样市售的 gB(AD2)hCMV IgG ELISA(CG3 antigen Biotest AG，编号为 807035 ;图 1A)中测试血清。
简言之，将覆盖有失活的hCMV蛋白混合物(来自实验室病毒株AD169)的可破碎的碎片(strip)放置到微孔板中，并且和稀释到1: 81的B细胞上清液(IOiU的上清液加入到800 ii I的BEIA系统的样品稀释液中)一同孵育,板在室温下孵育30分钟。在一轮清洗之后，加入预先稀释的标记了辣根过氧化物酶(IOOiU)的单克隆抗人IgG抗体，并且板在室温下再孵育30分钟。在第二轮清洗之后，加入预先稀释的底物-TMB溶液(100 u I)，并且板在室温下孵育15分钟。使用终止溶液(100 U I/孔)使反应停止,在450/620纳米处测量双着色(bichromatism)的光密度。
永生化人B细胞培养物的产生
从急性hCMV感染(CMV7)复原的患者获得外周血单核细胞(PBMC)，选择这些患者是因为hCMV中和抗体存在于其血清中。随后CMV7患者的PBMC要进行的EBV永生化过程是根据PCT/EP2005/056871的教导进行的。简单来说，以常规的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficol 1/Hypaque)密度梯度离心来从外周血纯化PBMC。根据生产商说明的VarioMACS技术(Miltenyi Biotec Inc.)以抗人⑶22涂覆的微珠从新鲜的PBMC (> 90%的纯度)分离CD-22 阳性细胞。以 CpG2006 (Coley, I u g/ml)和 IL-2 (Roche, 200U/ml)的组合来刺激纯化细胞。在4天的刺激之后，用新鲜的培养基(RPM1-1640)来清洗细胞，根据生产商说明，通过使用VarioMACS技术(Miltenyi Biotec Inc.)，用涂覆有抗人IgG的微珠将B细胞高度富集于IgG阳性细胞中。
在37°C和5% CO2中，将选择的和经刺激的细胞悬浮保持在24孔板中的添加了10% (v/v)热失活FCS (胎牛血清)、ImM丙酮酸钠、IOOii g/ml链霉素和100U/ml青霉素的RPML-1640细胞培养基中。使用B95.8细胞上清液(I: lv/v，16小时)来进行EBV永生化。[0110]在该过程的结尾，用新鮮的培养基(加入了 10%胎牛血清的RPMI 1640)清洗永生化细胞，并且将其以1.5 X IO6细胞/ml的密度在具有饲养层(feeder layer)(放射性的异源PBMC以5X IO5细胞/孔接种)而没有CpG2006(没有PCT/EP2006/069780中所描述的用于从CMV5供体获得的PBMC开始的方法的CPG2006)的24孔板中培养3周。
分泌hCMV中和抗体的永生人B细胞的次培养物的选择
在暴露于EBV 15天之后，通过以上所描述的基于AD169/HELF的微量中和试验在扩大的多克隆细胞培养物中证实hCMV中和活性。然后，细胞以20细胞/孔接种在添加了 10% FCS和非必要氨基酸(NEAA，从100X的市售母液稀释到IX ；EuroClone)并且没有CpG2006和IL-2的100 u I IMDM中的放射性的(30Gy)异源PBMC (50，000/孔)上。产生了总共4224的次培养物，2周后，添加50 Ul相同的培养基。再培养1_2周之后，使用基于HELF细胞和hCMV病毒株AD 169的hCMV微量中和试验来平行测试呈现正在生长的细胞培养物的上清液和收集的细胞。
使用以上描述的用于检测人IgG结合到gB hCMV包膜糖蛋白区域或总hCMV蛋白的ELSA来检测表现出hCMV中和活性的细胞培养物上清液。
或者产生作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白的gB-或gH抗原。在gB (Ag)-GST抗原的情况下，hCMV病毒株C 194的gB免疫优势区被融合到GST (BioDesign，Cat.N0.Rl 8102 ;GS_4B琼脂糖亲和纯化，lmg/ml)。在gH (Ag)-GST抗原的情况中，hCMV病毒株VRl 814的gH糖蛋白片段通过PCR被克隆，融合到GST基因，在E.coli中产生，并且在GST亲和カ的基础上从细菌细胞裂解物中纯化。重组gH (Ag)-GST抗原相当于hCMV病毒株VR1814的gH氨基末端区(氨基酸16-144 ;图1B)与GST的符合读框的融合。GST単独被用作阴性对照。
通过在96孔板中应用具有小改变的普通ELISA方法进行这些ELISA。简单来说，抗原在PBS中稀释到g/ml，50iil这样的蛋白溶液(含有IOOng细菌表达的融合蛋白)被用于包被EIA聚苯こ烯板(Nunc ；Cat N0.469949)。于4°C进行ELISA板的包被过夜，然后，在去除蛋白溶液之后，用150 ill的Wash缓冲液(含有0.05%的TWeen20的PBS)将板清洗4次。然后通过于37°C在每个孔中分入100 ill含有I %的牛奶的PBS来进行抑制非特异性结合处理达I小吋。在用150 ill的Wash缓冲液进行4轮清洗之后，以每孔50 U I的细胞培养物的上清液在37°C孵育2小吋，使用50 u I/孔的细胞培养基作为阴性对照。在四轮清洗之后，50 Ul的ニ抗[标记了辣根过氧化物酶的羊抗人IgG (Fe特异性)抗体；在wash缓冲液中稀释到I: 30,000 ;Sigma，Cat.N0.AO 170]分散到每个孔中，在室温下将板孵育I小吋。在再进行四轮清洗之后，通过室温下在每个孔中添加50 Ul的底物-TMB (3，3'，5，5'四甲基联苯胺；Sigma，Cat.N0.T0440)来进行酶反应再达30分钟。通过在每个孔中加入100 ill的终止溶液(IN硫酸)来终止显色反应，并且在450nm处读取光密度。
益果
人PBMC是从在血清中表现出显著的hCMV中和滴定量(以1: 105稀释的50%的中和)，以及在基于结合到糖蛋白B的AD2区的ELISA(以1: 64稀释的阳性样品被认为是对以1/4或更高程度稀 释的IgG抗gB的存在阳性)表现出强烈反应性的hCMV患者(CMV7)获得，糖蛋白B被认为最适合诱导血清中和抗体的hCMV抗原之一(Qadri I et al，1992;KropffB et al.，1993)，并且被克隆到CG3抗原之中(图1A)。此外，CMV7血清在另外ー个使用总hCMV病毒蛋白的ELISA中是阳性的，其中測量到了 74AU/ml的活性(当结果是至少10AU/ml时，样品被认为是对于抗-hCMVIgG的存在是阳性的)。
使用PCT/EP2005/056871 和 PCT/EP2006/069780 中公开的 EBV 永生化的方法，CMV7患者的B细胞被用于产生高度富集分泌IgG的B细胞的永生化的多克隆细胞培养物。与后一文献相比，公开了从另外的供体(CMV5)选择抗hCMV抗体，在没有CpG2006的情况下从原始大量的多克隆永生化细胞群体制备次培养物，并且首先选择，并且仅在选择结合于所选择的hCMV抗原之后，选择上清液通过微量中和试验来中和存在的hCMV感染性的抗体。
hCMV微量中和试验只应用于次培养物，其在培养3周时证明生长旺盛具有多簇细胞。首先在hCMV中和试验中筛选了 324孔中的上清液，发现其中的20个上清液至少降低40%的hCMV AD 169感染性。当鉴定这些孔中的hCMV结合活性时，只发现了两个对gB为阳性(为CG3抗原或gB (Ag) -GST融合蛋白)，对于gH不呈阳性(作为gH(Ag) -GST融合蛋白；图1B)，18个孔对任何一个都不呈阳性(图2)。
由于起始接种在每个孔的细胞数量少(20细胞/孔)，每个表现hCMV中和活性的次培养物都可能产生单克隆抗体(也就是由单一特异性永生化细胞克隆产生的多个细胞分泌的)，尤其是假设被期望生长和分泌hCMV中和IgG的永生化多克隆细胞群体中的低频率细胞。设计进一歩的实验活性以验证这个设想。
实施例2:26A1抗体的鉴定
材料和方法
26A1次培养物的扩培和鉴定
来自原始的次培养26A1的细胞在頂DM培养基(添加了 10% FCS和NEAA)中的放射异源PBMC上扩培(expand)，在这个扩培步骤的过程中使用如实施例1中所描述的hCMV微量中和试验证实hCMV中和活性至少两次(见表I)。
根据制造商的使用说明，使用市售定量人IgG ELISA试剂盒(Immunotek ;编号为0801182 ；Zeptometrix Corp.)来确定在24、48和72小时由26A1次培养物分泌的抗体数量。使用市售化验(PeliClass人IgG亚类ELISA组合试剂盒(PeliClass humanIgGsubclass ELISA comb1-kit);编号为 #RDI_M1551cib, RDI Divison ofFitzgeraldIndustries Intl.)来确定26A1抗体的亚类。
通过在添加了 5 % FCS的頂DM中的放射异源PBMC上将96孔板中的I个孔中含有的细胞I X IO5)接种到48孔板的一个孔中对细胞培养物进行逐步扩培。在5-7天之后，在添加了 5% FCS的IMDM中的没有饲养层的24孔板中的一个孔中对细胞进行扩培。然后，将细胞(5 X105/ml)置于添加了 2.5%的FCS的50%頂DM和50 %的杂种瘤-SFM(Gibco，编号为12045-084)中的没有饲养层的6孔板中。在这样的条件下，培养细胞至少一周。然后清洗指数生长的细胞，并且以5X IO5至106/ml的浓度在T75瓶的杂种瘤-SFM中进行培养。收集细胞培养物的上清液，在蛋白A柱上定量和纯化IgG，以PBS缓冲液透析并且过滤(0.2 ii M)。
26A1次培养物分泌的抗体的鉴定
实施例1中描述了 BEIA_CMV、gB和gH的ELISA试验(图1和图2)。根据文献进行 HSV 试验(Laquerre S et al, 1998)。
使用hCMV AD 160病毒株进行hCMV空斑减数试验。简单来说，病毒被稀释到IOOOPFU/反应。等量(0.1ml)的病毒和每种抗体或细胞培养物上清液混合，并且在37°C下孵育I小吋。混合物被添加到ffiLF单细胞层(在24孔板中)并且使其在37°C吸收I小吋。去除掉抗体-病毒混合物，将I %甲基纤维素覆盖层-MEM-2% FCS加入到被感染的细胞。在感染后10或12天对空斑进行计数作为感染性的測量值。
以免疫荧光在未感染的HELF或HUVEC细胞上检测26A1细胞培养物上清液。简言之，将细胞(7X 104/ml)接种到添加了 10% FCS的MEM中的24孔板中的胶质包被的玻璃盖玻片上，然后生长到半汇合(sem1-cofluence)的状态。然后用温热的PBS清洗细胞两次，并且在50%丙酮/50%甲醇的预冷(_20°C)的混合物中于室温(RT)下固定I分钟，然后用PBS清洗。固定的细胞用PBS中的0.2% TritonX-1OO在冰上透化20分钟，用PBS清洗，并且在室温下用封闭液(添加了 2% FCS的PBS)孵育15分钟。或者，固定细胞不被透化从而确定抗体识别细胞表面组成的能力。在这种情况下，以PBS清洗固定的细胞，在室温下用封闭液(添加了 2% FCS的PBS)孵育15分钟，并且在37°C下与26A1细胞培养物上清液(80 u I) 一起孵育2小吋。然后用温热的PBS清洗细胞(3次)，并且和80 ill的FITC标记的兔抗人IgG(ab' ) 2 ( Jackson ImmunoResearch) 一起孵育，人IgG染色示踪为绿色。在添加了 0.05% Tween 80的PBS中将ニ抗稀释到1: 50，并且于37°C在黑暗中将其加入到细胞中。然后，用温热的PBS清洗细胞(3次)，碘化丙啶染色计数(在PBS中的浓度0.25 Ug/ml ;Sigma)。使用封固剂(Vector Laboratories)将盖玻片封固在显微镜载玻片上。用Olympus Fluoview-1X70倒置共聚焦激光扫描显微镜进行图像记录。
26A1 IgG DNA/蛋白质序列的鉴定和重组表达
根据Fusion Antibodies Ltd建立的技术,从最初的26A1细胞培养物的扩大得到的细胞培养物等分试样被用于26A1抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的测序。冷冻细胞球(至少含有50，000个细胞)被用于提取总RNA。通过用寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT))引物的反转录获得对应的cDNA。建立使用IgG特异性引物的混合物的PCR反应来扩增VH区，以Igk/入引物的混合物来扩增VL区。使用Eco RI限制性内切位点将两个扩增反应的PCR产物克隆到测序载体(pCR2.1 ；Invitrogen)中并且被用于转化T0P10 E.coli细胞。
挑出从两个转化获得的至少10个所选菌落，并且通过测序进行分析。得到的DNA序列进行比对，并且翻译成产生VH 26A1 (分别为SEQ ID N0.:4和SEQ ID N0.:5)和VL26A1 (分别为SEQ IDN0.:9和SEQ ID N0.:10)共有DNA和蛋白质序列的蛋白质序列。VH26A1和VL 26A1蛋白质序列进行比较,并且和与公众领域的数据库(使用GenomeQuest、GeneSeq和EBI数据库)中的序列进行比对。通过IMGT数据库(Giudicelli V et al, 2004)预测表现 VH26A1(SEQ ID N0.:5、7 和 8)和 VL 26A1 (SEQ ID N0.:11、12 和 13)蛋白质序列特征的⑶R。
通过将共有26A1重链和轻链可变区序列克隆到同一表达载体(已经含有了对应的恒定区(对于人IgG重链和人Ig入链))和能够使两条抗体链都表达的双启动子载体中，在真核细胞中表达重组人26A1单克隆抗体。载体中的重组人26A1单克隆抗体的完整序列通过DNA测序来证实，并且被用于瞬时转染CHO DG44细胞，该CHO DG44细胞适合于在无血清悬浮培养基中生长并且在125ml搅拌瓶中以IX IO6细胞/ml接种(Derouazi M et al,2006)。用300 ii g的表达载体和900 u g的线性25kDa聚(こ烯亚胺)的混合物来进行转染。在收获培养基之前，细胞在搅拌瓶中于37°C在5% CO2中孵育6天。根据制造商的标准程序，使用Akta基本层析单元上的蛋白G柱来进行重组抗体的纯化。
结果
在含有生长的和分泌IgG的细胞的次培养物中，其中几种的细胞培养物上清液含有中和hCMV感染的抗体，但是通过ELISA测试未表现出对特异性重组抗原gB和gH的显著结合(图1和2)。尤其是，分泌IgG的26A1次培养物显示更强的和更可复制的hCMV中和活性，选择其进行更详细的细胞和生物鉴定。
使用含有hCMV蛋白(BEIA-CMV)混合物的ELISA来证实26A1次培养物的上清液中存在的IgG与hCMV的结合。同时，该上清液表现出对两种人宿主细胞系统中的不同hCMV病毒株的hCMV的显著中和活性(如表I所示)。当该上清液被用于HSV-特异性中和试验吋，则不能观察到该活性。
此外，扩大26A1次培养物，并且进ー步以10个细胞/孔进行亚克隆，从而在hCMV中和人IgGl的表达方面证实其单克隆性。事实上，在显示细胞生长的孔中，在基于原始AD169的实验中都表现出了 50%至98%的中和活性，证实了从原始26A1次培养物获得的结果。
原始26A1次培养物中的细胞被用于扩大IgG的生产，逐渐产生更多的培养物，从其中纯化IgG并且在hCMV试验中进行测试。通过逐步扩大26A1培养物并且去除在细胞培养过程中生长的某些需要(如饲养层、胎牛血清)来获得更多的培养物。使用这种方法，证实了从原始26A1次培养物产生的扩大的培养物以大约16ii g/ml/106细胞的浓度分泌IgGl。这些扩大的培养物显示了即使没有饲养层，在4天的加倍时间，并且在超过2个月的培养中保持hCMV中和活性。
以通过亲和层析从大規模细胞培养物纯化的IgG的形式，用26A1抗体重复进行hCMV中和试验。使用hCMV病毒株和人靶细胞的不同组合的两种实验，在剂量反应实验中测试26A1 IgG从而评价达到50 %的hCMV感染性抑制所需要的浓度(抑制浓度50或IC50)。结果显示蛋白A纯化的26A1 IgG的潜在中和活性既不是细胞型的也不是病毒株特异性的，并且定量评价为大约I U g/ml的设定的IC50值，并且在两个实验中中和效果都达到100%(图 3)。
将蛋白A纯化的天然26A1 IgG的抗HUVEC细胞的临床分离物的中和活性与市售的抗hCMV的超免疫IgG(IVIg) (Cytotect, Biotest)制剂进行比较时，26A1的IC50值比市售制剂所需的IC50值要低25倍，证明26A1抗体的较强的中和活性。
为了排除由于结合到细胞表面分子而在26A1次培养物的上清液中存在的中和活性，以未感染的HELF或HUVEC细胞在免疫荧光法中检测上清液。该试验显示由26A1培养物产生的IgGl不结合到未感染的人细胞。当相同的上清液在抗相关hCMV抗原的ELISA中进行试验时，该抗体不结合到这样的蛋白(图4)，显示了 26A1可能识别hCMV包膜上另外ー个未确定的诱导中和抗体产生的抗原。
通过将26A1来源的细胞培养物获得的IgG特异性PCR产物测序，进ー步证实该26A1来源的细胞培养物中分泌的hCMV中和抗体的单克隆性。使用来自26A1次培养物的细胞，制备细胞球用于RNA提取和反转录。然后分别使用人IgG重链和轻链可变区的特异性引物，将得到的cDNA用于扩增VH和VL序列。然后将PCR产物克隆到用于转化细菌细胞的质粒中。随机选择细菌转化子，并且用于克隆的PCR产物的测序。所有的克隆都显示了相同的DNA序列，除了可能由于PCR引起的错误造成微小差別，从而可以确定人26A1单克隆抗体的重链(图5)和轻链(图6)的可变区的共有序列和CDR。
编码26A1抗体的VH和VL区的序列可以再克隆到用于作为抗体片段的26A1可变区的正确表达(Fab或ScFv)的表达载体或到具有特异性同种型和亚类的完整人重组抗体中(例如，IgA、IgGl或IgG4)。在合适的试验中测试这些重组抗体来证实特异性的hCMV中和活性。
通过将编码重链(图7)和轻链(图8)的DNA克隆到合适的表达载体中(该载体已被用于在瞬时表达实验中转染CHO细胞)来在真核细胞中产生作为重组人IgGl的重组人26A1单克隆抗体。该重组人26A1单克隆抗体从细胞培养物上清夜通过亲和纯化，并且在不同的hCMV中和试验中进行检测。以AD169/HELF细胞系统，在微量中和试验和空斑减数实验中进行测试。重组人26A1单克隆抗体能以与蛋白A纯化的天然21A1抗体相比的方式有效地中和hCMV感染，计算的IC50值大概是I U g/ml (图9)。基于hCMV病毒株不同的组合和目标细胞同样在中和和空斑减数试验中进行测试，所有的都证实了天然的和重组的人26A1单克隆抗体可比较的功效(图10)。
因此，26A1抗体，无论是以天然或重组的人单克隆抗体的形式，都是可被用于hCMV感染和hCMV相关疾病的临床处理的抗体。
表I
权利要求
1.ー种抗体，由重链和轻链构成，其中，所述重链由SEQ ID N0.:15表示，所述轻链由SEQ ID N0.:17 表示。
2.根据权利要求
1所述的抗体，其中，所述抗体是人重组抗体。
3.根据权利要求
1至2中任一项所述的抗体，其中，所述抗体结合并中和人巨细胞病毒(hCMV)。
4.一种编码前述权利要求
中任一项所述的抗体的核酸。
5.根据权利要求
4所述的核酸，其中，所述核酸的序列由SEQID N0.:14和SEQ IDN0.:16的序列组成。
6.—种包含权利要求
4或5所述的核酸的载体。
7.ー种包含权利要求
4或5所述的核酸的原核或真核宿主细胞。
8.根据权利要求
7所述的宿主细胞，其中，所述细胞分泌权利要求
1至3中任一项所述的抗体。
9.权利要求
4或5所述的核酸用于产生权利要求
1至3中任一项所述的抗体的应用。
10.权利要求
7或8所述的宿主细胞用于产生权利要求
1至3中任一项所述的抗体的应用。
11.权利要求
1至3中任一项所述的抗体用于制备检测、治疗、抑制、预防和/或减轻hCMV感染或hCMV相关疾病的组合物的应用。
12.一种用于hCMV感染或hCMV相关疾病的治疗、预防或诊断的组合物，包含权利要求
1至3中任一项所述的抗体，或权利要求
4或5所述的核酸。
13.根据权利要求
12所述的组合物，其中，所述组合物用于眼部或局部给药。
14.根据权利要求
12或13所述的组合物，还包含不同的hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白制剂和/或抗病毒化合物。
15.权利要求
1至3中任一项所述的抗体在制造用于治疗、预防或诊断hCMV感染或hCMV相关疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求
15所述的应用，所述药物包含不同的hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白制剂和/或抗病毒化合物。
17.权利要求
4或5所述的核酸在制造用于治疗、预防或诊断hCMV感染或hCMV相关疾病的药物中的应用。
18.根据权利要求
17所述的应用，所述药物包含不同的hCMV中和抗体、静脉免疫球蛋白制剂和/或抗病毒化合物。
专利摘要
本发明提供了新型抗体序列，其与人巨细胞病毒(hCMV)结合并中和hCMV感染。该新型序列能够用于hCMV感染的医学处理，尤其是用于制备用于预防或治疗hCMV感染的的药物组合物。
文档编号C12N5/071GKCN101627115SQ200780051422
公开日2013年5月29日 申请日期2007年12月17日
发明者阿达·富纳罗, 乔治·格里包多, 桑托·兰多尔福 申请人:里博瓦克斯生物工艺有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),