一种多基因干扰的shRNA质粒表达载体及其构建方法与应用的制作方法

专利名称:一种多基因干扰的shRNA质粒表达载体及其构建方法与应用的制作方法
一种多基因干扰的shRNA质粒表达载体及其构建方法与应用一、 技术领域：
本发明涉及基因药物领域中基于多基因干扰的shRNA质粒表达载体 pSilencer-U6/Hl- (shRNA) n及其构建方法与应用。二、 背景技术RNA干扰(RNAi)是指利用双链RNA(double-stranded RNA， dsRNA)特异诱发与其序列同源 的mRNA降解，导致相应耙基因表达被特异抑制的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silence, PTGS)现象。RNA干扰发现于1998年线虫(C e7eg朋s)遗传分析。1999年人们 在植物中检测到21-25nt RNA片段为植物RNAi所必需，被称为小分子干扰RNA (short or sail interfering RNA，siRNA)，其作用机制在随后的果蝇研究中被阐明，成果很快应用于抗病毒、 抗肿瘤和基因功能研究。2001-2003年RNAi技术连续三年被评为当年世界十大科学成就，其中， 2001年列在世界十大科学成就第二位，2002年列为世界十大科学成就第一位。2003年美国 Fortune (财富)杂志将其与基因重组技术、单克隆抗体技术并称为生物制药业三大"金矿"。 短短时间里其研究与应用已取得令人鼓舞成果。2006年RNAi技术成果获得诺贝尔生理学或医 学奖。RNAi之所以能引起生物医学界几乎所有研究空前瞩目，是因为siRNA具有强大的抑制靶 基因表达效应和高度序列特异性。与抑制基因表达的传统工具，如反义寡核苷酸、核酶等比 较，siRNA沉默基因的效率高达数十倍到数千倍。不仅如此，siRNA本身还是一种极具前景的 基因耙向药物，可广泛用于诸如癌症、病毒性疾病等治疗。目前，第一个siRNA药物--针对 VEGF基因的siRNA已获得美国食品药品管理局(FM)批准开始进行一期临床试验。RNA干扰的具体过程是由外源或转基因、病毒感染等方式引入的dsRNA，在细胞内被RNA 酶Dicer以ATP依赖的方式，切割为长21-23核苷酸(nt) 、 3'端有2个核苷酸突出的双链 RNA，即小分子千扰RNA(small interfering RNA, si RNA) 。 siRNA同核酸酶等蛋白结合形成 RNA诱导基因沉默复合物(RNA induced silencing co即lex， RISC) 。 RISC在ATP的作用下将 双链siRNA打开成单链，与靶基因表达的mRNA的互补位置特异性结合，诱发靶基因mRNA降 解，从而在RNA水平上抑制靶基因表达。RNAi应用研究需要制备19-23nt的siRNA。 siRNA制备可采用化学合成法，也可采用载 体表达法在细胞内转录出靶序列的shRNA，由shRNA在体内自发生成相应siRNA来实现靶基 因干扰。体外合成siRNA直接用于靶基因抑制虽然方便快捷，但不稳定，易被RNase降解， 产生的基因干扰效应时间短， 一般只能维持一周左右时间，且RNA合成价格昂贵，操作亦不 如DNA方便，因此其推广受到局限。载体表达法表达shRNA/siRNA的基本原理是含有哺乳 类RNA聚合酶m启动子U6或HI的载体，其启动子在细胞内RNA聚合酶III的特异识别下能启 动转录出一种短RNA，当转录遇到连续的4 6个T时，转录则终止。转录出的短RNA其两端shRNA)。这种小发夹RNA在体内会很快被Dicer酶剪切成为siRNA，从而起到RNA干扰作用。 这种方法操作简便，成本低，与化学合成siRNA相比，DNA载体在体内更稳定，对耙基因的 表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究，介导的哺乳细胞特定基因表达抑制率可 达95%以上；经过合适的抗药性筛选，还能获得shRNA稳定整合于细胞基因组的永久干扰性 细胞克隆，获得特定基因表达被长期抑制的细胞，进而可从表型上进一步研究基因功能，因 此近来发展十分迅速。目前，shRNA载体表达法所用载体分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒作载体虽然载 体用量少，转染效率高，但临床应用会产生耐药性，且其临床安全性一直倍受关注；非病毒 载体相对安全，但转染效率低，载体用量大。Alan J Bridge等发现，足够量的shRNA表达 载体也可促发细胞干扰素效应，即使是普通质粒转染哺乳动物细胞，只要达到一定的用量， 也可引起细胞干扰素效应，因此，载体用量有一定限度，这尤其是在某些需要同时抑制两个 或多个基因实验时载体用量受到的限制就更大。RNA干扰具有高度特异性， 一个siRNA只能针对一个靶基因进行干扰。构建能同时编码 多个shRNA的载体用以同时实现两个以上靶基因干扰，无疑会大大增强对靶基因表达的抑制 效果。但目前shRNA载体表达法要想做到在一个载体上同时实现针对多个相同或不同靶基因 的shRNA表达则异常困难， 一般都只能做到在细胞内一个载体只表达一个耙基因shRNA。有助于shRNA载体表达法上述问题解决的改进方案目前已有文献报道。 一是中国专利公 开号CN1611606A披露的方案该方案以pUC18质粒为初始载体，将U6启动子反向插入pUC18 质粒多克隆位点的EcoRI和BamHI之间，得到pUC18-U6-MCS;同时，体外合成带有BamHI和 Xbal酶切位点的正义链与反义链DNA，并退火得到各编码"shRNA(如shRNAl、 shRNA2、 shRNA3、 shRNA4， shRNA5或更多)+136终止信号"的双链DNA。之后将合成的各"shRNA+U6终止信号" 双链DNA定向逐一插入到经BamHI和Xbal酶切后的pUC18-U6-MCS质粒从而构建出编码多个 shRNA的表达载体。该方案优点是构建能同时表达多个shRNA的表达载体毋需在初始载体 上引入另外的多克隆位点序列(MCS)，而是直接利用初始载体pUC18的MCS。该方案的缺点 是多个shRNA表达载体构建前需要采用复杂分子生物学手段先分离制备U6启动子；载体构 建时，分离获得的U6启动子还需用酶促手段进一步分别定向连接到每一合成的"shRNA+U6 终止信号"双链DNA结构上，该操作如果涉及表达shRNA越多，则这一定向连接就更为烦琐。中国专利公开号CN1710079A披露的另一方案是先设计并合成两组多克隆位点序列，将 合成的两组多克隆位点序列引入到商品化载体pSilencer3.0-Hl (Ambion公司)的shRNA转 录单位两侧，使两组多克隆位点序列与pSilencer3. 0-H1的shRNA转录单位、质粒pUC19基 本序列进行有序组合，先构建出可在两组多克隆位点序列之间串接多个shRNA转录单位的基 础载体；然后利用位于基础载体转录单位前后的多克隆位点序列中的同尾酶酶切位点和多克 隆位点序列中的一个酶切位点，将含有多个靶基因干扰序列的shRNA转录单位(Hl启动子+ 连接在该启动子下游的shRNA编码区序列合称为一个shRNA转录单位)串联在基础载体的两 个MCS之间，由此构建出能够同时表达多个shRNA的质粒载体。该方案省去了分离制备启动 子的繁杂步骤，直接使用携有启动子H1的商品化载体pSilencer3.0-Hl作初始载体而设计构 建编码多个shRNA的表达载体。该公开号专利披露方案的不足之处是:所用启动子只是Hl启 动子，其选作构建目标载体的商品化初始载体也仅限于pSilencer3.0-Hl。事实上，生命科学研究中，除H1启动子外，还有启动RNA转录其功能更为强大的启动子U6。由此，不难得 出，CN1710079A公开号专利披露方案所构建的表达载体转染细胞后所获得的shRNA/siRNA表 达量不如U6启动子载体强效，由此进而产生的靶基因表达抑制效果也不如U6启动子载体强 效。为解决上述问题，本发明公开一种新的基于多基因干扰的质粒表达载体方案。载体构建 过程中涉及在初始载体shRNA转录单位两侧设计引入两组有别于CN1710079A公开号专利的新 的多克隆位点序列，且U6和Hl两种启动子均可用来构建多基因shRNA表达载体 pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n。该载体转染细胞后，启动子U6或Hl可启动载体上的靶基因干 扰序列转录出多个针对靶基因序列的相应shRNA，这些shRNA在细胞内会很快加工成多个相 应的siRNA并同时发挥其对相应靶基因mRNA的降解作用。该表达载体为质粒型载体，可通过 大肠杆菌高密度发酵制备纯化，并制成供疾病治疗用的多基因RNAi药物或制剂。本发明构建的多基因shRNA质粒表达载体及其构建方法与CN1611606A和CN1710079A 公开号专利明显不同CN1611606A公开号专利披露方案构建目标载体不需要另外合成MCS序列，初始载体选用 的是普通质粒pUC18。本发明所构建的目标载体需要特异设计合成两组MCS序列，且初始载 体为商品化载体pSilencer2. 0-U6和pSilencer3. 0-H1。与CN1710079A公开号专利披露方案相比，本发明有三方面不同(1)设计并引入在初 始载体shRNA转录单位两侧的两组MCS位点序列不同。本发明所设计的两组MCS中，MCS,含 有KpnI、 Xbal、 EcoRV、 EcoRI四个酶切位点，长21bp; MCS2含有HindEI、 Spel、 EcoRV、 Pstl 四个酶切位点，长20bp。其中同尾酶为XbaI和SpeI。 CN1710079A公开号专利披露的两组多 克隆位点序列中，KSEE (相当于本发明中的MCS,)含有KpnI、 Sall、 EcoRV、 EcoRI四个酶切 位点，长23bp; HXEP (相当于本发明中的MCS》含有HindIII、 Xhol、 EcoRV、 Pstl四个酶切 位点，长19bp。其中同尾酶为SalI和XhoI。 (2)所用启动子不同。本发明所用启动子除了 Hl外还包括功效强于Hl的启动子U6，而CN1710079A公开号专利披露方案所用的启动子仅为 Hl。 (3)所利用的商业化初始载体有所不同。本发明所利用的商业化初始载体包括 pSilencer2. 0-U6和pSilencer3. 0-H1两种，而CN1710079A公开号专利披露方案所利用的商 业化初始载体仅限于pSilencer3. O-Hl。三、
发明内容
本发明涉及一种可用于同时表达多个shRNA的质粒载体pSi lencer-U6/H1- (shRNA) n及其 构建方法和应用。所述载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n由两组多克隆位点序列(MCS)、多 个耙基因shRNA转录单位和质粒序列组成，载体shRNA转录单位中的启动子为哺乳动物RNA 聚合酶m启动子U6或Hl。载体的两组多克隆位点序列之间可串联多个不同或相同耙基因序 列的shRNA转录单位。载体转染细胞或动物后，其上的多个shRNA转录单位可多次表达一个 靶基因，或表达一个靶基因的多个不同位点，或表达不同靶基因，因而可特异抑制两个或多 个靶基因表达。本发明的技术方案是先在初始载体pSilencer2. 0-U6或pSilencer3. 0-H1 (购自Ambion 公司)(图1和图2)的shRNA转录单位两侧设计并引入两组多克隆位点序列(MCS)，使两组多克隆位点序列与shRNA转录单位、质粒序列进行有序组合，构建出可在两组多克隆位点 序列(MCSi和MCs)之间串联多个shRNA转录单位的基础载体pSilencer-U6/H1-2MCS;之后， 利用位于基础载体pSilencer-U6/Hl-2MCS转录单位前后的多克隆位点中的两个同尾酶酶切 位点(Xbal和Spel)和多克隆位点中的一个酶切位点(Pstl),将含有多个靶基因序列的 shRNA转录单位(U6或Hl启动子+连接在该启动子下游的shRNA编码区序列合称为一个shRNA 转录单位)串联在基础载体pSilencer-U6/Hl-2MCS的两个MCS (MCSi和MCs)之间，由此构建 出能够同时表达多个shRNA的质粒载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n(n表示shRNA转录单位 数，n=l， 2，…，n)。多个shRNA转录单位可以设计成针对一个靶基因的同一位点，也可以 设计成针对一个靶基因的不同位点，还可以设计成针对不同靶基因，从而实现对一个或多个 靶基因的有效特异抑制。本发明构建的能同时表达多个shRNA的质粒表达载体 pSilencer-U6/H1-(shRNA)n可方便用于基因功能研究和疾病基因治疗药物的研究与开发。本发明所述的能同时表达多个shRNA的质粒表达载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n的构建 步骤如下1 、基础载体pSilencer-U6/Hl-2MCS构建(1) 位于初始载体shRNA转录单位两侧的多克隆位点序列设计两组多克隆位点的单链序列设计为MCS!(共21bp):
5，-MTTGGTACCTCTAGATATCG-3， (1)3，-CCATGGAGATCTATAGCTTM-5， (2)MCS2 (共20bp):
5，-AGCTTACTAGTGATATCTGC-3' (3)3'-ATGATCACTATAGACGTCGA-5， (4)(2) 人工合成两组多克隆位点单链序列委托生物技术公司完成。(3) 两组多克隆位点单链序列退火形成双链MCS,和MCS2多克隆位点单链序列加无RNase水溶解至lug/ul。成对的两组多克隆位点单链序列(即 (1)和(2) ， (3)和(4))各2ul加入46ul DNA退火缓冲液(IO mM Tris-HCl pH7. 5, lOOmM NaCl, lmM EDTA， pH8.0)至总体积50ul， 95°C孵育5分钟、37 。C孵育1小时，使其 分别退火成为双链MCSt和MCS2。退火形成的双链MCS!上含有KpnI、 Xbal、 EcoRV、 EcoRI四 个酶切位点，MCS2上含有Hindm、 Spel、 EcoRV、 Pstl四个酶切位点。其中Xbal和Spel为 一对同尾酶。两组多克隆位点序列中，除EcoRI (MCS》和Hindm (MCS2)夕卜，其余各限制酶 酶切位点在初始载体pSilencer2. 0-U6和pSilencer3. 0-Hl中均不存在。MCSi的两末端具有 凸出的EcoRI粘性末端5'-MTT，可用于连接初始载体shRNA转录单位的EcoRI切点端和质粒 pUC19的EcoRI切点端；MCS2的两末端具有凸出的Hindm粘性末端5，-AGCT，可用于连接初始 载体shRNA转录单位的HindHI切点端和质粒pUC19的HindHI切点端。退火形成的双链MCSi 和MCS厂20 。C保存备用。(4) 各个片断连接构成基础载体pSacencer-U6/Hl-2MCS①用EcoRI+HindlII双酶切初始载体回收小片段，得到shRNA转录单位片段。该shRNA转 录单位片段的两末端分别带有凸出的EcoRI粘性末端5'-MTT (其对应凹端3'-TTAA可与MCSl 凸出的EcoRI粘性末端5'-AATT互补连接)和HindIII粘性末端5'-AGCT (其对应凹端3，-TCGA 可与MCS2凸出的HindlII粘性末端5，-AGCT互补连接)；②用EcoRI+HindlII双酶切质粒pUC19 回收大片段，回收得到的质粒pUC19大片段其两末端分别带有凸出的EcoRI粘性末端5'-AATT (其对应凹端3'-TTAA可与MCS,凸出的EcoRI粘性末端5'-AATT互补连接)和HindIII粘性末 端5'-AGCT (其对应凹端3，TCGA可与MCS2凸出的HindlII粘性末端5'-AGCT互补连接)。③将 回收得到的初始载体shRNA转录单位片段和质粒pUC19大片段与MCSi、 MCS2混合进行连接反 应，即可将上述四种片段实现首尾连接，之后测序鉴定片断连接正确性，即得到基础载体 pSilcencer-U6/H1-2MCS (图3和图4)。该基础载体可方便将多个shRNA转录单位同时串联 形成pSilencer-U6/H1- (shRNA) n 。2、可同时表达多个shRNA的质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n构建利用位于基础载体pSilcencer-U6/Hl-2MCS转录单位前后的多克隆位点序列中的两个同 尾酶酶切位点(Xbal和Spel)和多克隆位点序列中的一个酶切位点(Pstl)，可进行多个 shRNA转录单位组合，从而构建出表达多个shRNA的质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n (图6)。操作为构建的基础载体pSilcencer-U6/Hl-2MCS用Xbal+Pstl酶切回收小片断， 再用Spel+Pstl酶切回收大片断，将两个回收片断进行连接即可实现将两个shRNA转录单位 串联。转录单位串联后的XbaI、 Spel、 Pstl三个酶切位点其相对位置维持不变，可继续用于 串联更多的shRNA转录单位。构建好的pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n质粒表达载体的每一串联 转录单位分别由一个启动子(U6或H1)和一个特异shRNA编码序列组成，多个转录单位首尾 串联在同一质粒表达载体的两个多克隆位点序列(即MCSi和MCS2)之间(图6)。同时测序 鉴定其正确性。四、 发明目的本发明的第一个目的是提供一种可用于同时表达多个靶基因shRNA的质粒载体 pSilencer-U6/H1-(shRNA)n。本发明的第二个目的是提供所述多基因shRNA质粒表达载体的构建方法。 本发明的第三个目的是说明所述多基因shRNA质粒表达载体在制备疾病基因治疗药物中 的应用。本发明的再一个目的是提供两组新的多克隆位点序列并说明该两组多克隆位点序列在构 建多基因shRNA质粒表达载体中的应用。五、 本发明有益效果本发明公开的多基因shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/H1-(shRNA) n具有如下优点(1)同一载体可实现多个耙基因表达抑制。所构建载体pSilencer-U6/H1-(shRNA) n在 细胞内能持续转录合成针对多个靶基因的相应shRNA，这些shRNA在细胞内能很快加工成为 多个相应的siRNA并同时发挥其对相应耙基因的mRNA降解作用。8(2)抑制靶基因表达效果稳定，操作方便。本发明所构建的多基因shRNA质粒表达载体 为DNA载体，它能在细胞内持续合成shRNA/siRNA并发挥对靶基因表达的特异抑制作用。而 体外人工合成的siRNA易被RNase降解，产生的基因干扰效应只能维持一周左右时间，且RNA 合成价格昂贵，难推广，操作亦不如DNA方便。(3)为质粒型载体。质粒型载体较之病毒型载体其临床使用更安全，不易产生耐药性。 而且，质粒型载体在制成RNAi药物或制剂时可通过大肠杆菌规模化发酵制备，操作简便，成 本低廉。六、
图l、 pSilencer3.0-Hl初始载体结构图。载体购自Ambion公司，其上带有启动子H1， 其中，位于EcoRI和HindIII之间的"H1 Promoter+siRNA"为一个shRNA转录单位。图2、 pSilencer2.0-U6初始载体结构图。载体购自Ambion公司，其上带有启动子U6， 其中位于EcoRI和Hindin之间的"U6 Promoter+siRNA"为一个shRNA转录单位。图3、 pSilcencer-H1-2MCS质粒载体构建流程图，其中MCS!含酶切位点Kpnl、 Xbal、 EcoRV、 EcoRI， MCS2含酶切位点HindHI、 Spel、 EcoRV、 Pstl， Xbal和Spel为一对同尾酶， Xbal、 Spel和Pst I三个酶切位点相对位置维持不变，是进行shRNA转录单位串联的关键酶。图4、 pSilcencer-U6-2MCS质粒载体构建流程图。其中MCS!含酶切位点Kpnl、 Xbal、 EcoRV、 EcoRI， MCS2含酶切位点Hindin、 Spel、 EcoRV、 Pstl, Xbal和Spel为一对同尾酶， Xbal、 Spel和Pst I三个酶切位点相对位置维持不变，是进行shRNA转录单位串联的关键酶。图5、单基因质粒载体pSilencer-U6/H1-(shRNA),构建流程图。位于启动子Hl后的shRNA 靶序列结构由"BaraHI-靶序列正义链-9bp loop环序列-靶序列反义链-6个T-HindIII"短双 链DNA组成，载体导入细胞后能持续稳定转录出靶序列小发夹RNA (shRNA)，该shRNA在细 胞内能自发生成siRNA并发挥其对靶基因mRNA的特异降解作用。其中N表示A、 T、 C、 G四 种碱基中的任何一种，正义链(Sense)和反义链(Antisense)的碱基反向互补。图6、 pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n质粒表达载体结构图。其中n表示shRNA转录单位 数，n=l， 2，…，n; P拟粗代表H6或Hl启动子(promoter); 0ri为载体复制起始点；Aampicillin 为氨苄青霉素筛选标记。七具体实施方式
下面实施例进一步说明本发明所述多基因shRNA质粒表达载体 pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n的构建过程与应用，其中实施例2和实施例3以艾滋病毒(HIV) 复制相关基因e肌、gag、 pol、 vif为例进行具体说明。特别需要指出的是，本发明说明书所 举实施例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实施例夕卜，还可以有其它实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案, 均落在本发明要求的保护范围中。实施例1:基于多基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n构建为在单一载体上实现多个shRNA转录单位串联，需先在初始载体pSilencer2.0-U6或pSilencer3.0-Hl (购自Ambion公司)的shRNA转录单位两侧设计并引入两组多克隆位点序 列(MCS)，使两组多克隆位点序列与shRNA转录单位、质粒序列进行有序组合，构建出可在 两组多克隆位点序列(MCS,和MCs)之间串接多个shRNA转录单位的基础载体 pSilencer-U6/H1-2MCS。之后在pSilencer-U6/Hl-2MCS载体的两个MCS之间串联上多个耙基 因干扰的shRNA转录单位的编码序列。1 、 pSilcencer-U6/Hl-2MCS基础质粒载体构建(1 )位于初始载体shRNA转录单位两侧的多克隆位点序列设计两组多克隆位点的单链序列设计为MCS!(共21bp):
5，-MTTGGTACCTCTAGATATCG-3， (1)3，-CCATGGAGATCTATAGCTTAA-5， (2)MCS2 (共20bp):
5，-AGCTTACTAGTGATATCTGC-3' (3)3，-ATGATCACTATAGACGTCGA-5， (4)(2) 人工合成两组多克隆位点单链序列委托生物技术公司合成上述两组多克隆位点单链序列。(3) 两组多克隆位点单链序列退火形成双链MCSJ卩MCS2操作为多克隆位点单链序列加无RNase水溶解至lug/ul。成对的两组多克隆位点单链 序列(即(1)和(2) ， (3)和(4))各2ul加入46ulDNA退火缓冲液(10mMTris-HClpH7.5， lOOmM NaCl， ImM EDTA, pH8.0)至总体积50ul， 95°C孵育5分钟、37 °C孵育1小时，使其 分别退火成为双链MCS,和MCS2。双链MCSi和MCS厂20 °C保存备用。退火形成的两组双链MCS序列具有如下特点①双链MCS!上含有Kpnl、 Xbal、 EcoRV、 EcoRI四个酶切位点，MCSs上含有HindUI、 Spel、 EcoRV、 Pstl四个酶切位点。②MCSt中的 Xbal和MCS2中的Spel为一对同尾酶，用于后续构建多基因shRNA质粒表达载体 pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n。③两组多克隆位点序列中，除EcoRI (MCS》和HindIII (MCS2) 夕卜，其余各限制酶酶切位点(包括同尾酶Xbal和Spel)在初始载体pSilencer2.0_U6和 pSilencer3. 0-HI中均不存在。④MCS,的两末端具有凸出的EcoRI粘性末端5'-MTT，可用于 后续连接初始载体shRNA转录单位的EcoRI切点端和质粒pUC19的EcoRI切点端；MCS2的两 末端具有凸出的HindIII粘性末端5'-AGCT，可用于后续连接初始载体shRNA转录单位的Hind HI切点端和质粒pUC19的Hindm切点端。(4) 各个片断连接构成基础载体pSilcencer-U6/Hl-2MCS①用EcoRI+HindlII双酶切初始载体回收小片段，得到shRNA转录单位片段。该shRNA转 录单位片段的两末端分别带有凸出的EcoRI粘性末端5'-MTT (其对应凹端3'-TTAA可与MCS, 凸出的EcoRI粘性末端5'-MTT互补连接)和HindIII粘性末端5，-AGCT (其对应凹端3，-TCGA 可与MCS2凸出的HindlII粘性末端5'-AGCT互补连接)；②用EcoRI+HindlH双酶切质粒pUC19 回收大片段，回收得到的质粒pUC19大片段其两末端分别带有凸出的EcoRI粘性末端5，-MTT(其对应凹端3'-TTAA可与MCS,凸出的EcoRI粘性末端5'-AATT互补连接)和HindIII粘性末 端5'-AGCT (其对应凹端3'-TCGA可与MCS2凸出的HindlII粘性末端5'-AGCT互补连接)。③将 回收得到的初始载体shRNA转录单位片段和质粒pUC19大片段与MCSh MCS2混合进行连接反 应，即可将上述四种片段实现首尾连接，之后测序鉴定片断连接正确性，即得到基础载体 pSilcencer-U6/H1-2MCS (图3和图4)。该基础载体可方便将多个shRNA转录单位同时串联 形成pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n。2、多基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n构建(n=1 、 2、 3…)上述构建的基础载体pSilcencer-U6/Hl-2MCS中，两组MCS中的Xbal和Spel为一对同 尾酶。同尾酶能产生相同粘性末端，酶切产物用连接酶连接后其连接产物不能再被原同尾酶 识别切开。本发明利用同尾酶XbaI和SpeI能产生相同粘性末端，用连接酶连接后其产物不 再被识别切开的原理，将多个shRNA转录单位同时串联在基础载体pSilcencer-U6/H1-2MCS 的两个MCS之间，由此构建出多基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/H卜(shRNA)n。 Xbal识别的位点是T I CTAGA， Spel识别的位点是A { CTAGT， 二者的酶切产物均含相同的粘 性末端CTAG，可用连接酶进行连接，连接完成后序列为TCTAGT，这一序列均不能再被同尾酶 Xbal和Spel识别切割。构建好的基础载体pSilcencer-U6/H1-2MCS用Xbal+Pstl酶切回收 小片断，再用Spel+Pstl酶切回收大片断，将两个回收片断进行连接即可实现将两个shRNA 转录单位串联。转录单位串联后的Xbal、 Spel、 Pstl三个酶切位点其相对位置维持不变，是 进行shRNA转录单位串联的关键酶，可继续用于串联更多的shRNA转录单位。构建好的 pSilencer-U6/H1-(shRNA)n表达载体的每一串联转录单位分别由一个启动子(U6或Hl)和 一个特异shRNA编码序列组成，多个转录单位首尾串联在同一质粒表达载体的两个多克隆位 点(即MCSi和MCS》之间。测序鉴定其正确性。(1 )单基因shRNA表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNAh构建根据Tuschl双链RNA设计原则，借助计算机辅助分析各靶基因(如X、 Y、 Z、…)序列 及其二级结构，确定特异性shRNA靶序列，并通过GenBank BLAST检索确保所选序列与其它 非相关序列无同源性。合成靶序列的shRNA特异性寡核苷酸DNA片段，包括"BamHI-靶序列 正义链-9bp loop环序列-靶序列反义链-6个T-Hindm"。合成片段退火后形成的双链DNA 的5'端有BamHI酶切位点的粘性末端，3'端有Hind!II酶切位点的粘性末端，可直接用于连接 到pSilcencer-U6/Hl-2MCS载体的启动子(U6或Hl)下游。操作为将pSilcencer-U6/H1-2MCS 载体用BamHI和HindIII双酶切，回收大片断。将回收的质粒大片断与shRNA耙序列的DNA片 段(即"BamHI-靶序列正义链-9bp lo叩环序列-靶序列反义链-6个T-Hindlll")退火后形成 的短双链DNA连接、筛选、测序鉴定，即可得到单基因干扰质粒表达载体 pSilencer-U6/Hl-(shRNA)！(图5所示)。按相同方法可制备获得针对不同单基因(如X、 Y、 Z、 ) shRNA序列的各相应shRNA质 粒表达载体。(2)双基因shRNA表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)2构建将pSilencer-U6/H1-(shRNA),用Xbal+Pstl酶切回收小片断，再用Spel+Pstl酶切用上述相同方法制备获得的另一单基因表达载体，并回收大片断，两个回收的片断经连接、转化、 筛选，即可得到双基因shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)2。(3) 三基因以上的shRNA表达载体pSHencer-U6/Hl-(shRNA)n构建将pSilencer-U6/Hl-(shRNA)2用Xbal+Pstl酶切回收小片断，再用Spel+Pstl酶切载体 pSilencer-U6/Hl-(shRNA),并回收大片断，两个回收的片断经连接、转化、筛选，即可得到 三基因shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)3。类似方法可制备获得含三个以上基于特异基因序列的shRNA质粒表达载体pSilencer -U6/Hl-(shRNA)n (图6)。这些串联在一个载体内的shRNA转录单位可以为不同耙基因，也 可为同一基因不同位点或/和同一基因多个相同位点。上述获得的pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n导入细胞后可分别转录合成针对各耙基因的 shRNA，这些shRNA由19nt RNA正义链、9nt回折片段(loop)、和19nt RNA反义链序列构 成，它们在细胞内能很快加工成针对各靶基因的siRNA，并各自发挥其对靶基因表达的特异 抑制作用。用相同方法可制备阴性对照质粒pSilencer-U6/Hl-(shRNA)negati,e。对照质粒中的shRNA 序列经Blast分析不针对任何基因的mRNA。(4) 测序鉴定各shRNA表达载体正确性构建好的多基因shRNA表达载体委托生物公司测序，引物为M13士，双向测序结果正确， 证明构建完成。实施例2:基于HIV多基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)n构建1、 pSilcencer-U6/Hl-HIV-2MCS基础质粒载体构建 方法按实施例l。2、 shRNA靶序列的选择与设计HIV-1 env 、 gag、 pol、 vif基因shRNA耙序列的选择，主要遵循Tushl原则并参考其 它一些标准。选定耙序列后进行Blast检索，使该靶序列与其它基因不具有同源性。靶序列确定后，按照规则(见ThijnR. Brummelkamp， et al. Science, 2002, 296: 550-553) 合成各靶序列的shRNA模板DNA。各shRNA模板DNA包括正义、反义两条互补的短DNA单链, 其基本单位为BamH I位点、靶序列正义链、9bp的环序列、靶序列反义链、6个T、 Hindm位点。(1) mv-lenv① 耙mRNA序列(19nt): 5'-l)CAGUUUAUGGGAUCAAAG-3,② shRNA模板DNA序列为5'- l GATCCCTCAGTTTATGGGATCAAAGTTCAAGAGACTTTGATCCCATAAACTGATTTTTTGGAAA-3' (Sense)3'-GGAGTC腿ACCCTAGTTTC歸TCTCTGAAACTAGGGTATTTGACT腿AACCTTTTCGA 4 -5' (Antisense) (BamHI :G 4 GATCC; HindIII: A 4 AGCTT)(2) HIV-1 gag① 耙mRNA序列(19nt): 5 ，-GAUUGUACUGAGAGACAGG-3 ，② shRNA模板DNA序列为5'- I GATCCCGATTGTACTGAGAGACAGGTTCMGAGACCTGTCTCTCAGTACAATCTTTTTTCGAAA-3' (Sense)3' -GGCTAACATGACTCTCTGTCCAAGTTCTCTGGACAGAGAGTCATGmGAAAAMCCTTTTCGA I -5' (Antisense) (Banm :G GATCC; HindlH: A 1 AGCTT)(3) HIV-1 pol① 耙mRNA序列(19nt): 5 ，-AUGGACAGUACAGCCUAUA-3 ，② shRNA模板DNA序列为5'- J GATCCCATGGACAGTACAGCCTATATTCAAGAGATATAGGCTGTACTCTCCATTTnTTGGAAA-3' (Sense)3'-GGTACCTCTCATGTCGGATATMGTTCTCTATATCCGACATCACAGGTAAAAAAACCTTTTCGA * -5' (Antisense) (BamHI:G I GATCC; HindIII:A 4 AGCTT)(4) HIV-lvif① 耙mRNA序列(19nt): 5 '"GUUCAGMGUACACAUCCC-3'② shRNA模板DNA序列为5'-1 GATCCCGTTCAGAAGTACACATCCCTTCAAGAGAGCCATGTGTACTTCTGAACTT^TTGGAM-3, (Sense)3'-GGCMGTCTTCATGTGTAGGGAAGTTCTCTCCCTACACATGAAGACTTGAAAAAACCTTTTCGA * -5' (Antisense) (BamHI:G I GATCC; Hindffl:A 4 AGCTT)(5) negative (阴性对照)其shRNA序列不针对任何特定基因的mRNA。上述序列送生物技术公司合成。序列中划线部分为相应靶mRNA序列的DNA序列或其互补 序列，转录成RNA后会在此处形成小发夹RNA (shRNA)的双链部分。3、 HIV多基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)n的构建 (n=1、 2、 3…)(1) HIV单基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)1构建合成片段退火后形成的双链DNA的5'端有BamHI酶切位点的粘性末端，3'端有HindIII酶 切位点的粘性末端，可直接用于连接到pSilcencer-U6/H1-HIV-2MCS基础载体的启动子(U6 或HI)下游。操作为将质粒pSilcencer-U6/H1-HIV-2MCS用内切酶BamHI和HindIII双酶切， 回收大片断。将回收的质粒大片断与shRNA靶序列的DNA片段(即"BamHI-靶序列正义链-9bp loop环序列-靶序列反义链-6个T-Hindm")退火后形成的短双链DNA连接、筛选、测序鉴 定，即可得到针对HIV-1 env、 gag、 pol、 vif单基因干扰的shRNA质粒表达载体 pSilencerU6/Hl-HIV-(shRNA),。以env为靶点的shRNA质粒表达载体命名为pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)T;以gag为靶点的shRNA质粒表达载体命名为pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)";以pol为耙点的 shRNA质粒表达载体命名为pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA) T;以vif为耙点的shRNA质粒表 达载体命名为pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)广。相同方法可制备阴性对照质粒，命名为pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)/native,其中的 shRNA序列经Blast分析不针对任何基因的mRNA。(2) HIV双基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-mV-(shRNA)2构建将pSilencerU6/Hl-HIV-(shRNA) l用Xbal+Pstl酶切回收小片断，再用Spel+Pstl酶切用 上述相同方法制备获得的另一单基因shRNA质粒表达载体，并回收大片断，两个回收的片断 经连接、转化、筛选，即可得到双基因干扰的shRNA质粒表达载体 pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA) 2。各双基因shRNA质粒表达载体命名如下以env+gag为耙点的shRNA质粒表达载体命名 为pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)广+柳；以env+pol为靶点的shRNA质粒表达载体命名为 pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA),,1;以env+vif为靶点的shRNA质粒表达载体命名为以gag+pol为靶点的shRNA质粒表达载体命名为 以gag+vif为靶点的shRNA质粒表达载体命名为 以pol+vif为靶点的shRNA质粒表达载体命名为 以相同靶基因序列为靶点的shRNA质粒表达载体分别命 名为 pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)/ ' 、 pSilencer_U6/Hl-HIV-(shRNA) 22柳 、 pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)22p"、 pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)pSi lencer-U6/H1-HIV- (shRNA) 2en'+vif pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA) 2鹏,1 pSi lencer-U6/H1-HIV- (shRNA) 2柳+'" pSilencer-U6/Hl-HIV- (shRNA) 2po'+vif相同方法可制备基于双基因干扰的阴性对照质粒，命名为pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA) /nega"'e，其上的shRNA序列经Blast分析不针对任何基因的mRNA。(3) HIV三基因以上shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)n构建将pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)2用Xbal+Pstl酶切回收小片断，再用Spel+Pstl酶切 载体pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA),并回收大片断，两个回收的片断经连接、转化、筛选， 即可得到HIV三基因干扰的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)3。类似方法可制备获得三基因以上shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)n。 这些串联在一个载体内的shRNA转录单位可以为不同耙基因，也可为同一基因不同位点或/ 和同一基因多个相同位点。各三基因以上shRNA质粒表达载体(包括其阴性对照载体)的命名同上。对照质粒中的 shRNA序列经Blast分析不针对任何基因的mRNA。(4) 测序鉴定各shRNA表达载体正确性构建好的质粒表达载体委托生物技术公司测序，引物为M13土，双向测序结果正确，证 明构建完成。上述获得的pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA) n导入细胞后可分别转录合成针对 HIV-1 erw、gag、pol、vif基因的shRNA,这些shRNA由19nt RNA正义链、9nt回折片段(loop)、和19nt RNA反义链序列构成，它们在细胞内能很快加工成针对HIV-1 env、 gag、 pol、 vif 基因的siRNA，并各自发挥对相应靶基因表达的特异抑制作用。实施例3: HIV多基因干扰的shRNA质粒表达载体在制备艾滋病治疗药物中的应用上述构建的shRNA质粒表达载体pSilencer-U6/H1-HIV-(shRNA)n转化大肠杆菌，利用 大肠杆菌进行高密度发酵(发酵罐中)，离心收集菌体，按常规质粒提取方法抽提纯化 pSilencer-U6/Hl-HIV-(shRNA)n质粒，测定OD咖质粒浓度，测序鉴定产物正确性。取纯品质 粒配制成针剂或制成口服胶囊，可用于艾滋病毒感染者和艾滋病人治疗。质粒表达载体在肌 体细胞内可分别转录合成针对HIV-1 env、 gag、 pol、 vif基因的相应shRNA，这些shRNA在 细胞内能很快加工成为多个相应的siRNA并同时发挥其对HIV相应耙基因的mRNA降解，从而 抑制HIV多个基因表达，杀死艾滋病病毒。
权利要求
1. 一种可用于同时表达多个shRNA的载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n，由两组多克隆位点序列(MCS)、多个shRNA转录单位和质粒序列组成，两组多克隆位点序列之间可串联多个shRNA转录单位，多个shRNA转录单位可用于多次表达一个靶基因，或表达一个靶基因的多个不同位点，或表达不同靶基因，其特征在于所述载体的两组多克隆位点序列为
MCS1(共21bp)5’-AATTGGTACCTCTAGATATCG-3’
3’-CCATGGAGATCTATAGCTTAA-5’；
MCS2(共20bp)5’-AGCTTACTAGTGATATCTGC-3’
3’-ATGATCACTATAGACGTCGA-5’。
2、 权利要求
1所述载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n，其特征在于所述载体的每个shRNA 转录单位包含一个哺乳动物启动子U6或Hl、以及连接在启动子U6或Hl之后的靶基因shRNA 编码序列。
3、 权利要求
1或2所述载体的shRNA转录单位，其特征在于位于转录单位启动子U6 或Hl之后的耙基因shRNA编码序列如下(1) 为任何疾病基因靶序列，序列结构通式为5'-1 GATCCCNNNN酬NNNNNNNNNN丽TCAAGAGA酬NNNN誦NNNN,匿TTTTTGGAAA-3 (Sense)3' -GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGTTCTCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAMCCTTTTCGA I -5' (Antisense) (BamHI:G4GATCC; Hin孤:A "GCTT)其中划线部分的N为A、 T、 C、 G四种碱基中的任何一种，正义链(Sense)和反义链 (Antisense)的碱基反向互补；(2) 包括① HIV-1 env5'-1 GATCCCTCAGTTTATGGGATCAAAGTTCMGAGACTTTGATCCCATAAACTGATTTTTTGGAAA-3' (Sense)3' ~GGAGTCAAATACCCTAGTTTCMGTTCTCTGAAACTAGGGTATTTGACTAAAAAACCTTTTCGA I -5' (Ant isense) (BanHI :G 4 GATCC; Hi週:A 1AGCTT)② HIV-l gag5'-1 GATCCCGATTGTACTGAGAGACAGGTTCAAGAGACCTGTCTCTCAGTACAATCTTTTTTGGAAA-3' (Sense)3' ~GGCTAACATGACTCTCTGTCCAAGTTaCTGGACAGAGAGTCATGTTAGAAAMACCTTTTCGA i 一5， (Antisense) (BamHI:G 4 GATCC; HindIII:A i AGCTT)③ HIV-1 pol5'-备GATCCCATGGACAGTACAGCCTATATTCAAGAGATATAGGCTGTACTGTCCATTTTTTTGGAAA-3' (Sense)3' ~GGTACCTGTCATGTCGGATATAAGTTCTCTATATCCGACATGACAGGTAAAAAAACCTTTTCGA4 -5' (Antisense) (BamHI :G 4 GATCC; HindIH:A I AGCTT) HIV-1 vif5'-1 GATCCCGTTCAGAAGTACACATCCCTTCMGAGAGGGATGTGTACTTCTGAACTTTTTTGGAAA-3' (Sense)3' -GGCMGTCTTCATGTGTAGGGAAGTTCTCTCCCTACACATGMGACTTGAAAAMCCTnTCGA 4 -5' (Antisense) (B函G I GATCC; Hi週:A I AGCTT)
4、 权利要求
1所述载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n,其特征在于所述载体为任何类 型的质粒载体。
5、 一种可用于同时表达多个shRNA的载体的构建方法，其特征在于在shRNA转录单位 两侧设计并引入两组多克隆位点序列(MCS)，使两组多克隆位点序列与shRNA转录单位、质 粒序列进行有序组合从而构建出可在两组多克隆位点序列之间串接多个shRNA转录单位的基 础载体pSilencer-U6/H1-2MCS;之后，利用位于基础载体shRNA转录单位前后的多克隆位点 中的同尾酶酶切位点和多克隆位点中的一个酶切位点进行多个shRNA转录单位组合从而构建 出能同时表达多个shRNA的载体pSilencer-U6/Hl-(shRNA) n。
6、 一种可用于同时表达多个shRNA的载体在制备疾病基因治疗药物中的应用。
7、 一种如权利要求
1所述多克隆位点序列在构建任何shRNA表达载体中的应用。
专利摘要
本发明公开一种可同时用于表达多个shRNA的质粒载体pSilencer-U6/H1-(shRNA)n及其构建方法与应用。所述载体由两组多克隆位点序列(MCS)、多个靶基因shRNA转录单位和质粒序列组成。载体的两组多克隆位点序列之间可串联多个不同或相同靶基因的shRNA转录单位，转染细胞或动物后，其上的多个shRNA转录单位可多次表达一个靶基因，或表达一个靶基因的多个不同位点，或表达不同靶基因，因而可特异抑制两个或多个靶基因的表达。所述载体可方便用于基因功能研究和疾病基因治疗药物的研究与开发。
文档编号A61K48/00GKCN101245352SQ200710048473
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月13日
发明者敏 顾, 灵 马, 马义才 申请人:马义才导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan