专利名称：蜘蛛丝基因的棉纤维细胞表达载体质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组与表达调控，即将蜘蛛的丝蛋白基因与棉花纤维细胞表达的调控元件重组，构建成蛛丝的棉纤维细胞表达载体质粒。蜘蛛共含七种特化的腺体，Aciniform腺体分泌包裹猎物用的蛛丝；Cylindriform腺体分泌附着于卵表面的蛛丝；Pyriform腺体分泌附着及连接用丝；Major Ampullate腺体分泌拖丝及蛛网骨架结构用丝；Minor Ampullate分泌蛛网辐射状部分用丝，Flagiform腺体分泌俘获猎物用粘丝，Aggregate腺体分泌其它附着成分。其中拖丝(Draline silk)和粘丝(Flagiform silk)由于其特殊的强度与韧性，具有非常诱人的应用前景。
蛛丝蛋白的基因相当大，其mRNA约为15kb，而基因组DNA约为30kb左右。整个蛛丝蛋白的基因由13个外显子组成，其中3-12外显子的序列基本相同，为编码含有GPGGXn，GGX及Spacer区的高度重复序列；1-2外显子编码信号肽，作用于腺体细胞到腔内的分泌过程；13外显子除编码3-12所编码的重复序列外，还编码一段非常保守的C端序列。蛛丝蛋白在二级结构上形成β片层，并彼此平行形成空间上类似弹簧的结构，通过水桥连接从而形成弹性非常高的网状结构。
由于其广泛的应用前景，蛛丝的基因工程产业化研究受到高度的重视，至今利用的生物反应器有大肠杆菌、甲醇酵母、家蚕、山羊与小鼠的乳腺细胞，烟草与马铃薯等。但产量、溶解性及加工工艺等问题阻滞了该领域的发展与产业化。
棉花纤维是由胚珠外珠被表皮细胞在受精前后经分化突起、伸长和细胞壁增厚而形成的。其形成过程可分为4个时期，即细胞分化与伸长启动期、细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。至今已分离出10余个纤维细胞内特异表达基因的启动子，如纤维发育早期的E6、初生壁合成至次生壁合成前期H6S、Rac13，纤维伸长期的LTP、ACP、Expansin、CAP和Annexin，纤维发育后期的FbL2A。这些启动子可以调控它们的下游基因在棉花纤维细胞中表达。
本发明是将纤维细胞特异表达的启动子与蜘蛛丝基因进行基因重组，构建成蜘蛛丝在棉花纤维细胞内特异表达的重组质粒。将该质粒转化棉花，转基因棉花的纤维细胞中将含有蜘蛛丝蛋白，从而改变棉花纤维的强度与韧性。
本发明包括以下几种技术1.棉花总DNA的提取和检测2.棉花纤维特异启动元件的克隆；3.棉花纤维特异启动元件GUS表达载体的构建；4.棉花纤维特异启动元件调控下蜘蛛丝基因的植物表达载体pBinTLADF3的构建；附面说明
图1.pBITLADF3载体构建流程示意图从pBlueADF3上切下蜘蛛丝基因ADF3片段，经过两步中间载体pUC19和pGEM-7Zf，将一端的XhoI酶切位点置换为SacI，然后连入载体pPTL221，最终得到载体pBITLADF3。
实施例1棉花总DNA的提取(1)取新陆早7号棉花种子，经无菌处理接种在培养基上，待其长出叶片。
(2)称取4克新鲜叶片作为植物材料，在液氮中研成粉末，装入50ml离心管中，加入20ml冰浴的提取缓冲液，混合均匀。
(3)2,700g离心20分钟，取上清加入8ml裂解缓冲液，充分涡旋混合均匀，65℃温浴20-30分钟。
(4)加入10ml氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，12000rpm离心5分钟，取上相转入一新离心管中。如此重复数次，直至分界面澄清为止。
(5)吸取上相到另一新Eppendof管中，加入2/3体积冰冷的异丙醇(约5.6ml)，室温静置20-30分钟。
(6)6000rpm离心10分钟，收集沉淀物。
(7)加入1ml 70％乙醇温和振荡冲洗2～3次，吹干。
(8)加入500μl TE 65℃温浴10-30分钟，重悬沉淀。
(9)重悬沉淀后，10,000g离心5分钟沉淀多糖。然后将上清转移到新的1.5ml Eppendorf管。
(10)溶解于TE的DNA可保存几周至数月。
(11)紫外检测结果浓度为300ng/ul，A260/A280的比值为1.89，凝胶电泳结果DNA大于20KB。
实施例2棉花纤维特异启动元件的克隆(1)LTP12引物上游引物 5′-GC GGT ACC AAA CAA TTA AGT ATT GAT ACC AGA-3′下游引物 5′-GG CTT AAG GAC ATT GAG CTA GCC ATA(2)PCR扩增高保真PCR反应体系如下无菌ddH2O 70.5μl；10×ExBuf(Mg2+free)10μl；dNTP Mixer 8μl；Mg2+6μl；ExTaq DNA Polymerase 0.5μl；引物12μl；引物22μl；模板(棉花总DNA)1μl。反应程序预变性94℃ 3分钟-(94℃40秒-58℃ 60秒-72℃ 60秒)X30个循环-72℃ 10分钟。
(3)反应完成后，取20μl样品经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下用一次性刀片小心切下位于800bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化后溶于20μl ddH2O中，-20℃保存。
(4)将扩增片段连接到pGEM-T载体上，进行序列分析。
实施例3棉花纤维特异启动元件GUS表达载体(pPTL221)的构建(1)取7μl PCR回收产物与1μl pGEMT载体连接，转化DH5α，测序鉴定得pGEMTPTL12。
(2)将pGEMTPTL12以PstI酶切补平后再以HindIII酶切，所得片段连接至经HindIII，BamHI双酶切BamHI补平的pBI101.3载体片段，转化鉴定，即得pPTL101。
(3)阳性克隆以HindIII、SmaI双酶切鉴定大小，pTL12大小为0.8KB左右。
(4)将pGEMTPTL12以SphI、PstI酶切所得LTP12启动子片段连接至SphI、PstI酶切的pUC19载体片段，得pUCPTL12。蓝白斑筛选阳性克隆经SphI，PstI双酶切鉴定，可见一条0.8kb左右条带，即LTP12启动子。
(5)pUCPTL12经SphI、XbaI双酶切所得LTP12启动子片段与SphI、XbaI双酶切pBI221载体片段连接，即得pPTL221。由于pBI221上35S启动子的大小与LTP12相近，鉴定中利用了pBI221上的另外一个位点PstI，因LTP12下游有一个PstI位点，鉴定中以PstI单酶切结果得大小为0.8kb左右条带，说明LTP12正确插入。pPTL221经PstI单酶切后，可见一条0.8kb左右条带，即LTP12启动子。
实施例4棉花纤维特异启动元件调控下ADF3的植物表达载体的构建pBINTLADF3(1)pBlueADF3以EcoRI、XhoI酶切所得ADF3片段连接至EcoRI、SalI酶切的pUC19载体片段得pUCADF3。经EcoRI，HindIII酶切鉴定得2kb左右条带，为ADF3。
(2)将pUCADF3以EcoRI、HindIII酶切所得ADF3片段连接至EcoRI、HindIII酶切的pGEM7Zf载体片段得pGEMADF3，蓝白斑筛选所得阳性克隆经EcoRI，SacI双酶切鉴定，可见一条2.0kb左右条带，即ADF3。
(3)将pBlueADF3以EcoRI酶切补平后再以SacI酶切所得ADF3片段连接至PstI补平的pPTL221经PstI，SacI酶切所得载体片段得pBITLADF3。阳性克隆经Smal，SacI双酶切并以pBI221酶切产物为对照，结果pBI221双酶切产物可见1条2.0kb左右条带为GUS片段；pBITL221双酶切产物明显变大，并且未切下2.0kb左右条带，说明ADF3已经成功插入。
(4)将pBITLADF3以EcoRI，KpnI酶切后所得pLTP12-ADF3-NOSt片段连接至pBIN19经EcoRI，KpnI酶切所得载体片段，转化筛选，得pBINTLADF3。经EcoRI，KpnI酶切鉴定得3.1kb大小片段，说明pLTP12-ADF3-NOSt成功插入。
权利要求
1.一种载体质粒，含有在棉花纤维细胞表达的启动子、蜘蛛丝蛋白基因、终止子和筛选标记基因，其特征在于将蜘蛛丝蛋白的基因重组到棉花纤维细胞表达的载体上。该质粒的转基因棉花纤维将含有蜘蛛丝蛋白。
2.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于含有高度重复序列的蜘蛛丝蛋白基因，其表达产物包括拖丝(Dragline silk)和粘丝(Flagiform silk)。蛛丝蛋白的重复部分由GPGGX/GPGQQ；GGX；poly-Ala/poly-Gly-Ala和Spacer区组成。
3.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞伸长期LTP、ACP、Expansin、CAP、Annexin的启动子。它们能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞伸长期表达。
4.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞发育后期FbL2A的启动子，它能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞次生壁增厚期表达。
5.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于蜘蛛丝基因的5’端组装纤维细胞初生壁合成至次生壁合成前期H6S、Rac13的启动子，它能使蜘蛛丝基因在棉花纤维细胞伸长启动期表达。
6.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于蜘蛛丝基因的3’端组装了增强表达能力的nos终止子。
7.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于该质粒组装NPTII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡那霉素筛选。
8.根据权利要求1所述的载体质粒，其特征在于该质粒组装Bar基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用除草剂Bastar筛选。
全文摘要
将蜘蛛丝基因与棉花纤维细胞特异表达的启动子重组,构建成棉纤维特异表达蛛丝蛋白的载体质粒。将该质粒导入棉花后,可在棉纤维中表达蛛丝蛋白,从而改良棉花纤维特性。
文档编号C12N15/82GK1380418SQ0210040
公开日2002年11月20日 申请日期2002年1月24日 优先权日2002年1月24日
发明者王义琴, 李文彬, 牛恒尧, 张利明, 孙勇如 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所