靶向人肝癌细胞含有抑癌基因的真核表达载体质粒的制作方法

专利名称：靶向人肝癌细胞含有抑癌基因的真核表达载体质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用生物技术和癌症治疗领域，具体涉及一组靶向人肝癌细胞含有抑癌基因的真核表达载体。
背景技术：
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，全球发病率排在第五位，肝癌通常发病隐匿出现临床症状已到中晚期，死亡率高居恶性肿瘤第三位。肝细胞癌(HCC)占成人原发性肝癌的80 %，并且发病率有持续上升趋势，治疗后五年存活率目前只有7 %左右(.El-serag H. B. and Rudolph K.L.Carcinogenesis. Gastroenterology,2007,132 :2557-2576 ； Hernandez-Alcoceba R. et al. , J. World Gastroenterol. 2006,12(38) :6085-6097.)。 现在的治疗方法如外科手术切除和肝移植仅对少数患者有效，因为该病确诊时大多数病人已处于癌症扩散期而且缺少合适的器官供体。不能手术切除的HCC患者采用其他局部治疗方法可能有一定效果，但容易复发长期存活率很低。目前，还没有非常有效的肝癌治疗方法(吴孟超.中国医学科学院学报.2008，3(K4) =363-365. ；Arii S. et al.，Japan. Hepatology,2000, 32:1224-1229 ；Yang G. S. et al. , Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2003,2 :23-27. ；Hemming Α. W. et al. , Minerva Chir，2002，57 :575-585.)。随着对细胞恶变分子机制研究的深入，基因治疗作为一种新兴治疗方法已成为肝癌治疗研究的新热点。促进细胞恶变的基因称为癌基因，而维持细胞稳定、抑制细胞恶变的基因称为抑癌基因。现已证明，由于某些癌基因的激活、和/或抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的改变，可导致细胞增殖分化和凋亡失调，从而引发产生肿瘤。针对肿瘤发生的这种遗传学背景，将外源性治疗基因引入肿瘤细胞或其他体细胞内以纠正某些基因过度活化或补偿某些缺陷的基因，而达到治疗肿瘤的目的，即为肿瘤的基因治疗。目前，肿瘤的基因治疗主要方法包括给予抑癌基因，癌细胞自杀基因，免疫增强基因，肿瘤血管生长抑制基因等等进行治疗(Minguez B. et al. ,Curr Opin Gastroenterol, 2009, 25 (3) :186-194.)。抑癌基因治疗抑癌基因(anti-oncogene, cancer suppressive gene),又称抗癌基因，是正常组织细胞内存在的能抑制细胞转化增殖和肿瘤发生的一类基因，而癌细胞内无此种基因或因突变而失活。研究表明，人类肿瘤几乎一半是由于正常组织的抑癌基因突变失活所致， 抑癌基因失活与肿瘤增殖加速密切相关。因此，可将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤生长或逆转其恶变表型，这种策略已成为肿瘤基因治疗研究中的一种重要模式。 已确定的抑癌基因有DCC、NF-U NF-2、Rb、p53、pl6、VHL等，其中p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。目前在实验性肝癌的基因治疗中研究较多的是野生型P53基因，P53基因失活与肝癌发生和发展密切相关，肝癌患者50%以上有p53基因突变或途径改变致使P53基因功能丧失导致细胞恶变，一些动物实验证明恢复p53基因功能对肝癌治疗有较好效果(Bykov V.J.et al.，Cell Cycle, 2009,8 (16) :2509-2517. http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/pubmed/19633417 ？ itool = EntrezSystem2. PEntrez. Pubmed. Pubmed ResultsPanel. Pubmed RVDocSum&ordinalpos = 5)。野生型p53基因是最常见的一种抑癌基因，它编码分子量为53kDa的蛋白质，可使细胞增殖停止于Gl期并诱导细胞凋亡，当其缺失或发生点突变时，不能表达p53蛋白或产生无抑制活性的P53突变蛋白，从而失去对肿瘤生长的控制。人肝癌组织中常检测到突变的P53基因，特别是乙肝患者较多和常食黄曲霉素污染食物的地区，如中国、南非等国有关人群。某些肝癌含有一个突变的P53等位基因和一个正常等位基因，另外一些肝癌含有一个突变的P53等位基因和缺失一个等位基因，我国肝癌患者肝细胞的p53等位基因缺失率高。p53基因突变多发生在249位密码子的第三个核苷酸(AGG AGT)，动物实验研究证明食物黄曲霉素Bl摄入量与肝细胞p53基因该位点发生突变呈剂量相关性。低分化肝癌细胞的P53突变率高，p53突变不仅丧失了其停止细胞周期和诱导凋亡的作用，而且p53 突变蛋白还有获得性功能，例如可激活PCNA、VEGF, EGFR、IGFl受体，激活C-MYC、MDR基因等。P53突变使化疗药物诱导细胞凋亡的疗效显著降低。p53基因是众多抑癌基因中目前研究得较为深入的一种基因，在多种实验性肿瘤模型中导入功能性P53基因进行治疗均取得比较理想的效果。因此，早在1999年就有学者进行过I期和II期临床试验，用野生型 P53/腺病毒载体经肝动脉注射治疗转移型肝肿瘤。Anderson等用携带野生型p53基因的重组腺病毒载体转染P53基因突变的大鼠肝癌细胞系McA-RH7777细胞，功能性p53蛋白的表达导致肝癌细胞生长受抑制和凋亡。在实验性鼠肝癌实验中，经肝动脉给予携带功能性P53基因的表达载体比静脉给药可导致更有效表达p53蛋白而抑制肿瘤生长(Anderson S. C. et al. ,Clin Cancer Res，1998，4 1649—1659. ；Mitry R. R. etal.，H印atology，2000， 31 :885-889.)。用AFP启动子调控野生型p53蛋白在肝癌细胞中的表达，明显抑制了肿瘤细胞形成集落，并且提高了肿瘤细胞对化疗药物顺钼(cisplatin)的敏感性，表明p53 蛋白的表达水平与顺钼诱发肿瘤细胞凋亡的敏感性呈正相关。2003年，深圳市赛百诺基因技术有限公司成功开发了基因治疗药物一重组人P53腺病毒注射液(商品名今又生 (Gendicine))，这是世界上第一个获得新药证书的基因治疗药物，已应用于临床(Peng Ζ. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16149900 ？ itool = EntrezSystem2. PEntrez. Pubmed. Pubmed ResultsPanel. Pubmed RVDocSum&ordinalpos = 2Hum Gene Ther,2005, 16(9) :1016-1027.)。自杀基因治疗自杀基因指存在于细菌、病毒和真菌中的一类基因，将这类基因转导入肿瘤细胞中可表达其编码的特种酶，将原来无毒或毒性极低的药物前体代谢转变成细胞毒性产物， 而杀死肿瘤细胞。这类前药转换酶的基因称为“自杀基因” (suicide gene)。自杀基因疗法， 又称病毒介导的酶/前药疗法(virus directed enzyme prodrug therapy, VDEPT),是通过基因工程技术构建含自杀基因的表达载体将其导入肿瘤细胞中，使之在特定条件下高效表达相应酶，将前药转变为细胞毒性药物而达到治疗肿瘤目的。已知的自杀基因系统主要有 单纯疱疹病毒I型胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1-TK/GCV)系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷酸(PNP/6-MeP-dR)系统等。 目前研究最多、进展最快的是HSV1-TK/GCV和CD/5-FC两类自杀基因系统，它们在肝癌自杀基因治疗中的研究也最为广泛(Bonini C. et al.，Mol Ther, 2007,15(7) 1248-1252.)。Hsvi-TK/Gcvd mmm^mmmwmm / 丙氧,鸟苷前药)磁胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的功能是催化脱氧胸苷(thymidine，TdR)磷酸化变成一磷酸脱氧胸苷(dTMP)。病毒、细菌、真核细胞及线粒体内均存在TK基因。不同来源的TK 基因结构及其表达的蛋白分子量大小、理化性质和生化功能均不同。常采用单纯疱疹病毒 (HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)的TK基因。哺乳动物细胞TK特异性高，只能催化TdR磷酸化为一磷酸脱氧胸苷。而疱疹病毒的TK还可以催化一些核苷类似物如无环鸟苷(ACV) 和丙氧鸟苷(GCV)等磷酸化。单纯疱疹病毒TK(HSV-TK)分为I型和II型。HSVl-TK基因包含11 个核苷酸，没有内含子，编码376个氨基酸序列，其转录产物mRNA的5’端有107 个核苷酸的非翻译区。HSV2-TK基因也为11 个核苷酸，但HSV2-TK蛋白的理化性质及催化活性与HSVl-TK蛋白有明显差异。HSV2-TK只能催化核苷类似物单磷酸化，而HSVl-TK可使之进一步二磷酸化，在细胞二磷酸脱氧核苷激酶(dNDP-K)的作用下再磷酸化成为三磷酸化合物。因而目前多采用。水痘带状疱疹病毒TK(VZV-TK)能特异性地将6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷 (6-methoxy purine arabino nucleoside, araM) iMM'itMf^ araMP, ^ " ]^! 进一步代谢产生细胞毒性产物araATP而抑制DNA聚合酶合成DNA致使细胞死亡。目前用于TK基因转导治疗肿瘤的前药有两类一类是嘌呤核苷类似物，如无环鸟苷(acyclovir，ACV)和其衍生物丙氧鸟苷(ganciclovir cytovene, GCV)，潘洛昔非 (penciclovir，PCV)，布洛昔非(buciclovir，BCV)及araM等。一些学者的实验研究表明 ACV和GCV等对细胞无毒。另一类是嘧啶核苷类似物，主要包括BVDU，BVDC和IVDU等。第一类嘌呤核苷类似物中，ACV是鸟苷的开环衍生物，1977年合成，原用于治疗 HSV感染(如散发性脑炎、生殖器疱疹、角膜炎)、带状疱疹和EB病毒感染(传染性单核细胞增多症、肝炎)及巨细胞病毒感染。ACV抗病毒机制是在受感染细胞中受HSV-TK作用先产生单磷酸化物，然后被胞内磷酸激酶转化成细胞剧毒性三磷酸化物，而抑制细胞DNA聚合酶的功能，并竞争性地渗入细胞DNA链末端导致DNA合成终止使细胞死亡。实验证明联用TK基因转导肿瘤细胞和ACV具有杀伤肿瘤作用。GCV为ACV的衍生物，1988年上市。临床上用于预防艾滋病人及器官移植病人并发致盲性巨细胞病毒视网膜炎、结膜炎。其抗病毒机理与ACV相同，但对HSVl-TK转导的肿瘤细胞的抑制作用比ACV强10倍。已证明GCV在体外能使含HSV-TK基因的载体转染的小鼠肉瘤细胞失去克隆形成能力，在体内可完全抑制Balb/c小鼠中的肿瘤。近年来多采用GCV 作为治疗药物，积累了较多的经验。第二类嘧啶核苷类似物，它们对正常细胞毒性小，被HSV-TK酶磷酸化产生的产物能强烈抑制胸苷合成酶(thymidine synthase)而阻止细胞DNA的合成，对HSV1-TK基因转导肿瘤细胞的抑制作用比嘌呤核苷类似物强100倍，且代谢稳定、能抵抗胸苷磷酸化酶的水解，。目前此类药物的应用尚处于实验研究阶段，可能是肿瘤TK基因治疗更合适的待选药物。自1995年HSV1-TK/GCV系统首次被引入肝癌的基因治疗显示能以GCV剂量依赖方式诱导杀伤肝癌细胞后，其在体内、外实验中的抗肝癌效力不断得到确证。构建了分别含 CMV,AFP增强子/启动子和TK基因的腺病毒载体Ad. CMVtk和Ad. AFPtk质粒，用其转染人肝癌细胞、非肝癌细胞，和给裸鼠体内肝癌细胞移植瘤注射，同时用GCV处理或治疗。结果显示，采用IX IOi3Pfu滴度的两种质粒均能抑制细胞或肿瘤增殖，Ad. AFPtk只抑制肝癌细胞增殖，而对不增殖的非肝癌细胞无毒性作用。用Ad. CMVtk转染人肝癌细胞，和给裸鼠体内移植瘤注射，同时用GCV处理或治疗，结果相似，肿瘤增殖被完全抑制。除治疗目的外，也将HSV-TK作为报告基因用于PET分析，已经成功用于人体内腺病毒载体对HCC 的转导(Sen L. et al. ,Mol Therap，2005，12 (1) :49-57. ；Yaghoubi S. S. et al.，J Neuc Med，2005，46 (12). 586.)。在不同HCC动物模型中，观察到HSV-TK有较好抗肿瘤效果但目前还没有临床报道。在其他癌症患者施行的临床和临床前研究中提示HSV-TK 可以作为免疫原协助建立全身或者局部抗肿瘤反应，然而需要与其他治疗方法联合使用。 临床前研究中，在与放射性同位素(I"1碘油)联合应用中放射诱导性启动子Egr-I被用于控制HSV-TK的表达。因此，HSV-TK可由内源放射性刺激而表达，两种治疗可以协同发挥抗肿瘤作用。CD/5-FC(朐卩密啶脱/5-氟丨胞』卩密啶)磁某些细菌和真菌含有胞嘧啶脱氨酶(CD)，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶，可将无毒性前药5-FC(5-氟胞嘧啶)转化为高毒性化疗药物5-FU(5-氟尿嘧啶)，5-FU再经细胞内酶作用生成氟尿嘧啶三磷酸(5-FUTP)和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐(5-FdUMP)，二者抑制胸苷酸合成酶而阻止DNA、RNA及蛋白质合成导致细胞死亡。而且5-FU可以经局部扩散进入邻近癌细胞引起比HSV1-TK/GCV系统更广泛的旁观者效应。Kievit等实验显示酵母菌的胞嘧啶脱氨酶(yCD)比细菌CD(bCD)的作用更强，应用于原发和转移性肝癌动物模型有较好效果。 他们的研究发现WD对5-FC的Km值比I^D低22倍，用含y⑶基因的表达载体转导的人结肠癌细胞(HI^9/y⑶)比用含b⑶基因的表达载体转导的癌细胞(HI^9/b⑶)对 5-FC更敏感，在荷瘤裸鼠实验中，联用5-FC治疗，13只裸鼠注射HI^9/y⑶后有6只没产生肿瘤，而注射 HI^9/bCD 的裸鼠均产生肿瘤(Kievit E. et al. ,Cancer Research, 1999,59 1417-1421)。许多实验证明了 CD/5-FC系统对肝癌的抑制效果。构建的含不同启动子(CAG启动子或AFP启动子)和⑶基因的复制缺陷型腺病毒载体AdexICAG⑶和AdexIAFP⑶，体外分别转染AFP阳性的H印G2肝癌细胞和AFP阴性SMMC-7721肝癌细胞，同时用5-FC处理。发现，AdexlCAG⑶载体在转染效率不足10%时即可有效抑制二种肿瘤细胞的增殖， 而AdexlAFPCD载体转染只使AFP阳性肝癌细胞对5-FC治疗敏感；同时进行的动物体内实验结果一致。另外，比较了 HSV1-TK/GCV系统与⑶/5-FC系统杀伤肝癌细胞的效果，结果发现这两个系统对肝癌的治疗均有效，但CD/5-FC系统对体外肝癌细胞增殖抑制较强， 而 HSV1-TK/GCV 系统对体内肿瘤效果更好(Kuriyama S. et al.，Scand J Gastroenterol, 1999,34(10) :1033-1041 ；Zhang Μ. et al.，Cancer Res 2003 ；63 :658-663.)。PNP/氟达拉滨基因系统近年来发现嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)可将无毒性前药6-甲基嘌呤脱氧核糖(6MPDR)转变成毒性6-甲基嘌呤(6MP)而强烈杀伤肿瘤细胞。荷瘤鼠用6MPDR治疗4天后活肿瘤细胞减少了 19.8%，杀伤力比⑶基因更强，延长了
7荷瘤鼠生存期，30%荷瘤鼠得以治愈。结果分析认为PNP基因靶向肿瘤好、转导效率高表达强，对肝癌的基因治疗极有潜力和应用价值。免疫基因治疗抗原特异性T细胞的有效活化和增殖需要抗原递呈细胞(APC)提供双信号或三信号APC的MHC分子递呈抗原表位肽给T细胞受体(TCR)为第一信号，APC表面的共刺激分子向T细胞提供第二信号，APC分泌的细胞因子提供第三信号。目前研究主要集中在细胞因子和共刺激分子二类。共刺激分子主要有B7、ICAM-U LFA-3、VCAM-I等，将人类HLA-B7 基因用DNA脂质体复合物作为载体导入肿瘤部位，对晚期HLA-B7阴性肿瘤患者取得了良好效果。而提高肿瘤细胞周围某些细胞因子的浓度可直接杀伤肿瘤细胞，另一些细胞因子可以诱导和增强机体的抗肿瘤免疫反应。目前采用的抗肿瘤细胞因子有四类白介素(IL)， 干扰素(IFN- α、β、γ )，肿瘤坏死因子(TNF- α β )和集落刺激因子(CSF)。 He-P等用含IL-2基因的pcDNA3质粒载体治疗鼠原发性肝癌一周后肿瘤完全消失。用含干扰素调控因子I(IRF-I)基因的质粒转染肝癌细胞诱导IFN-β分泌，能上调肝癌细胞表面MHC I 类和II类分子表达，增强免疫细胞对肝癌细胞的识别而抑制肿瘤生长(Matar P，et al.， http://www.ncbi.nlm.nih.Rov/pubmed/19272130 ？ itool = EntrezSystem2. PEntrez. Pubmed. Pubmed ResultsPanel. Pubmed RVDocSum&ordinalpos = 20.丁 Biomed Sci,2009, 16 :30.)。抗血管生成基因治疗正常情况下机体各器官血管生成和抗血管生成之间保持平衡，维持着血管生成所需要的量和速度。给予促血管生成因子和抗血管生成抑制剂可改变血管生成的平衡。研究表明至少有15种不同的促血管生成蛋白质，其中VEGF和bFGF与实体瘤血管生成关系最为密切。目前抗血管生成的基因治疗主要集中针对VEGF和bFGF两种介质。血管生成介质刺激新生血管生长的能力受体内血管生成内源性抑制剂的干扰，后者由肿瘤细胞或肿瘤内及其周围的间质细胞分泌，主要包括血小板反应素(TSP-I)、血小板因子(PF4)、可溶性flt-1、 angiostatin和血管内皮抑素(endostatin)。血管内皮细胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGR5)家族是生理性血管生长的主要调节因子，也是肿瘤血管生成的主要刺激因子。通过干预血管生成因子作用能使动物的肿瘤退化，如用VEGF单抗、可溶性FGF受体中和已释放的血管生成因子，或通过减少FGF结合蛋白可阻止细胞周围基质释放活性bFGF。 在小鼠肝癌模型中，用重组pcDNA;3B质粒载体导入反义HIF，封闭缺氧诱导因子基因，导致其下游VEGF表达显著下调，治疗组小鼠1周后肿瘤快速萎缩，而对照组小鼠肿瘤在14-17 天从0. Icm生长到1cm。血管生成抑制剂阻止肿瘤血管生成的机理是(1)抑制血管内皮细胞的增殖和迁移；( 抑制血管基底膜和细胞周围基质的降解和更新，从而抑制血管生成和重建。目前常用的作用最强的血管生成抑制剂有Angiostatin和Endostatin，是实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。在裸鼠动物模型中，用逆转录病毒载体导入人Endostatin 基因治疗植入性人肝癌，治疗组裸鼠在注射肿瘤细胞后16天才形成肿瘤，第22天肿瘤体积仅为26. 8mm3 ；而对照组12天形成肿瘤，22天肿瘤生长至498. 0mm3。在体外Endostatin同样显著抑制了血管内皮细胞的生长。在大鼠原位和转移性肝癌模型中，用腺相关病毒载体通过门静脉注射治疗导入Angiostatin基因，2个月后肝细胞中的Angiostatin浓度达到最高峰，原位癌治疗组的肿瘤比对照组减少68% -72%，转移癌治疗组的肿瘤减少71-72%。反复给予血管生成抑制剂不产生耐药性(.Ruegg C. ,Mutter N. Bull Cancer, 2007,94 (9) 753-762.)。联合基因治疗联用抗血管生成基因Angiostatin和B7-1治疗EL-4肿瘤，发现单用Angiostatin 只能轻微抑制肿瘤生长，单用B7-1也只能根除直径小于0. Icm的肿瘤，而两者联用能根除直径O.km的肿瘤。联用IL-2基因与HSK-TK基因治疗鼠肝癌，疗效明显好于单用IL-2基因或单用 HSK-TK 基因(Thomas Μ. · J Gastroenterol. 2009 ；44Suppl 19 :136-41.)。随着对肿瘤病理机制研究的不断深入为基因疗法提供了理论依据，大大促进了人们对肿瘤基因疗法的探索研究。目前单基因疗法的研究虽然各自取得了一定效果，但强度不够理想，每种基因疗法均有其自身特点和适用范围，必须结合每种肿瘤的病理才能充分发挥优点。合适的双基因或多基因联合疗法，可能增强疗效，作用互补，克服各自的不足，是未来发展的方向，也是本发明探索的途径。相信借助各种类型的载体，通过不同的介导方式递送治疗基因到肿瘤组织及肿瘤血管，利用各种特异性调控元件提高癌症治疗基因的转染效率，提高其靶向癌细胞的表达，趋利避害、综合治疗肿瘤可能会收到更好的效果。本发明选择人抑癌基因hp53，酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因；及人肝癌组织特异性hAFP启动子；以不含CpG基序的pCpG mcs G2类质粒为基础，构建了包含一种、二种或三种癌症治疗基因的多个真核表达载体；分别用它们转染宿主肝癌细胞系， 配合应用相应的前药，显示能抑制肝癌细胞增殖或杀死肝癌细胞。发明_既述因此，本发明的第一个目的是提供一组含有人肝癌组织特异性启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体。本发明第二个目的是提供二种含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体。本发明的第三个目的是提供一种含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体。本发明的第四个目的是提供构建上述真核表达载体的方法。本发明的第一个方面，提供一组含有人肝癌组织特异性启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述单个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53，或酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。本发明第二个方面，提供二种含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述二种癌症治疗基因是人抑癌基因hp53和酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或人抑癌基因hp53和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。本发明构建的含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体，包含这二个癌症治疗基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，和这二个癌症治疗基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的二种蛋白质，而不是表达融合蛋白。本发明第三个方面，提供一种含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述三个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。本发明构建的含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体，包含这三个癌症治疗基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，和这三个癌症治疗基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的三种蛋白质，而不是表达融合蛋白。本发明第四个方面，提供构建上述真核表达载体的方法，其中各癌症治疗基因之前的人肝癌组织特异性hAFP启动子采用其各自的优化特异性引物进行PCR扩增而制备 ’然后用基因重组技术将各癌症治疗基因先分别与自己的启动子连接起来，再一起插入表达载体CpG-mcsG2中，而不是按常规依次插入。本发明的构建上述真核表达载体的方法包括如下步骤(1)构建各癌症治疗基因之前的人肝癌组织特异性hAFP启动子，其中用序列表中的特异性引物1和2，进行PCR扩增制备人抑癌基因hp53前的启动子；用序列表中的优化特异性引物3和4，进行PCR扩增制备酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD前的启动子；用序列表中的优化特异性引物5和6，进行PCR扩增制备单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 HSK-tk-ACpG前的启动子；(2)将人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSK-tk- Δ CpG用基因重组技术分别与hAFP启动子连接起来，并使其一侧含有Not I和Fba I酶切位点；(3)将分别与hAFP启动子连接的一个、或二个、或三个癌症治疗基因一起插入表达载体CpG-mcSG2中，而不采取常规的顺序插入连接方法。发明详述目前癌症基因治疗的基本方法是采用含有癌症治疗基因的表达载体转染或转化宿主癌细胞，在癌细胞中表达癌症治疗蛋白，配合应用相应的前药，达到抑制或杀伤癌细胞，治疗癌症的目的。然而所用的表达载体(即质粒)大多数来源于细菌(如大肠杆菌) 或病毒，它们通常含有非甲基化的胞苷-鸟苷二核苷酸CpG基序。含CpG基序的DNA或其片段对哺乳动物和人体具有免疫刺激活性，可导致机体产生对该表达载体所表达蛋白质的免疫反应，从而可能显著降低甚至抵消基因治疗的效果，或产生不良毒性。为避免这种风险，本发明以不含非甲基化的胞苷-鸟苷二核苷酸CpG基序(即CpG中的C是甲基化的) 的表达载体pCpG-mcSG2类型质粒为基础，构建了含各种抑癌或杀癌基因的重组表达载体。 用pCpG-mcs G2类质粒为基础构建含治疗基因的表达载体报导很少，难度大。一般的大肠杆菌基础质粒DNA中都含CpG基序，而不含CpG基序的pCpG-mcs G2质粒只能选择性地在 GT115大肠杆菌中生长并复制。本发明在用含甲基化的pCpG-mcs G2质粒骨架构建临床用治疗基因的过程中，尤其是构建含两个以上治疗基因的不含CpG基序表达载体质粒时，常需要采用一些对含甲基化CpG基序的质粒无效的稀有内切酶，如限制性核酸内切酶1 ! I。 为解决这一技术难题，本发明采用基因工程方法先将治疗基因hp53基因与hAFPforyCD启动子DNA序列连接起来，再插入表达载体pCpG-mcs G2中这种“组合连接”方法，而不采取常规的顺序插入连接方法。并使其一侧含有Not I和!^ba I酶切位点，然后再一起插入表达载体pCpG-mcs G2中。另外，该方案同时也避免了由于甲基化问题导致的不含CpG基序的表达载体被大多数大肠杆菌菌株所排斥，扩大了用于复制基因的大肠杆菌菌株的选择范围。尤其是在构建两个以上治疗基因的不含CpG基序表达载体质粒时，内切酶的选择范围受到很大限制，如果大肠杆菌菌株的选择再因为甲基化原因而受到限制，不含CpG基序表达载体治疗基因的质粒就会因此而不能构建和制备。本发明最后筛选出GT115大肠杆菌菌株可以用来复制含hp53、y⑶和TK 一、二、三个不同治疗基因和一、二、三个启动序列的不含 CpG基序的表达载体pCpG-mcs G2质粒。本发明的目的是治疗肝癌，特别是人肝癌；构建的含癌症治疗基因的表达载体递送目标最终是人体内的肝癌，包括手术切除后少量残留的或微转移的肝癌细胞。因此要求该表达载体具有肝癌细胞特异性，或称为靶向肝癌细胞，以避免被其它体内正常组织或细胞摄入后在其中表达相应蛋白可能产生的难以预料的不良作用。对此，目前基因治疗的策略通常是在癌症治疗基因之前安置肝癌组织或细胞特异性启动子，以便这种表达载体被肝癌细胞摄入后只在肝癌细胞中表达而发挥作用。为此我们采用了人肝癌细胞的特异性hAFP 启动子，将其操作性连接在癌症治疗基因的上游。与不同癌症治疗基因操作性相连的hAFP 启动子的DNA序列长度略有不同但均含274bp的序列，因此构建它们进行聚合酶链反应扩增时需视所选癌症治疗基因的不同采用不同的特异性引物(见实施例1)。在构建含三个治疗基因的质粒时，在三个不同的治疗基因前我们采用了三个相同的启动子，这有助于获得三种治疗基因转导效率的一致，并使三种治疗基因都只靶向性地在肝癌细胞中转导。我们发现，采用三个相同的启动子并没有导致三个不同治疗基因的转导发生相互干扰，三个治疗基因质粒与单个治疗基因质粒中各个基因在肝癌细胞中的转导效率之间没有明显差别。 对三个不同治疗基因之前的启动子，即使在构建质粒中因设置酶切位点的增加或改变导致启动子的长短有所改变，但仍可用相同的引物对进行PCR扩增作鉴定。治疗体内残留和微转移肝癌细胞还需解决表达载体递送途径和方法问题，以下实施例所述的脂质转染胺方法不能用于体内。今后我们将采用本发明人的另一项发明“微电场网技术”(沈路一，美国专利 W0/2007/120557，2007 年 10 月 25 日。kn L. ,United States Patent :W0/2007/120557, 2007/10/25)来体内递送这种表达载体，使其只进入肝癌细胞并表达功能性hp53、yCD、TK蛋白，配合给予相应的前药，达到靶向治疗肝癌的目的。如本文背景技术中所述，目前单基因癌症治疗方法虽有一定效果但不够满意，适当组合的双基因或多基因治疗方法可能是发展方向也是本发明的构思。我们选择了抑癌基因hp53、癌细胞自杀基因y⑶和HSV-TK的各种组合，将它们共同构建在同一个表达载体中， 而不是在不同的表达载体中，目的是让它们被摄入同一个癌细胞并在其中分别表达，而非表达成融合蛋白，可在它们各自不同的作用途径中发挥抑癌协同作用，预计这比被不同癌细胞摄入在不同癌细胞中表达而难以发挥协同作用要好，我们的实施例结果证明了这点。 本文所用的术语“CpG基序”指非甲基化胞苷-鸟苷组成的二核苷酸CpG。含CpG 基序的寡聚脱氧核苷酸(ODN)或DNA片段是上世纪90年代以来发现和研究的一类具有免疫佐剂性能的核酸序列片段，大多数细菌(包括大肠杆菌)和病毒DNA富含这类序列，而脊椎动物以上的高等哺乳动物和人类DNA中含量少且胞嘧啶(C)为甲基化而没有免疫佐剂作
11用。含CpG的ODN或DNA片段可激活哺乳动物宿主防御机制，诱导增强的先天性和获得性免疫应答。宿主的树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原递呈细胞(APC)具有Toll样-9受体(TLR-9)可识别/结合此CpG基序。CpG ODN或DNA片段视其侧接序列的不同，有的具有免疫增强作用，有的为免疫抑制作用；免疫增强又分为增强体液免疫，或增强细胞免疫和 CTL 反应(Krieg，Α. Μ.，Annual Review of Immunology. 2002,20 :709-760)。本文所用的术语“基因”、“目的蛋白基因”与“癌症治疗基因”含义相同，可互换使用，指天然或重组的携带用于治疗癌症的蛋白质氨基酸序列信息密码子的DNA序列，通常为脱氧核糖核酸DNA双链序列。这种基因可包含在人工构建的重组表达载体中。本文所用的术语“载体”与“质粒”含义相同，可互换使用。载体可分为用于保存或扩增特定克隆基因的中间载体(如本文中的PMD18-T)和在宿主细胞中表达目的蛋白的表达载体；又分为在大肠杆菌等原核生物细胞中表达目的蛋白的原核表达载体和在酵母菌、 哺乳动物和人等真核生物细胞中表达目的蛋白的真核表达载体。“重组真核表达载体”指用基因工程方法人工构建的能在真核细胞中表达内源或外源目的蛋白的载体，这种真核表达载体可以是 JW4303、pcDNA3. UpVAXUpORF 或 pCpG-mcs G2 类型质粒。本文所用的术语“转染”或“转化”指宿主细胞经物理或化学方法，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质转染胺(LipofectamindOOO)或DEAE-葡聚糖介导的转染、DNA粒子轰击和显微注射等处理，使细胞摄入外源加入的携带基因的表达载体，或通过生物学媒介，如逆转录病毒载体、腺病毒载体、受体介导的DNA摄取等将携带基因的表达载体递送入宿主细胞中。这些载体进入宿主细胞后可作为游离体形式存在于胞质中，或整合入细胞染色体中，在适当条件下该细胞可瞬时表达或长期表达载体所携带的基因编码的蛋白质或功能性RNA。 这种宿主细胞就叫做被载体转染或转化的细胞。本文所用的术语“转录”指在真核生物宿主细胞中通过RNA聚合酶将目的基因转录产生携带该基因信息mRNA的过程，即DNA转录产生相应的mRNA。本文所用的术语“表达”、“目的蛋白基因表达”、“基因表达”含义相同，可互换使用，指目的基因的DNA序列转录产生携带该基因信息的mRNA和mRNA在核糖体中被翻译产生目的蛋白二者，即转录产生mRNA和翻译产生目的蛋白都叫做表达。本文包括这二种含义。本文所用的术语“启动子”指能启动和导致其下游基因转录产生mRNA的DNA序列。 启动子可以是天然基因的启动子或人工修饰的启动子。不同的启动子可指导基因在不同发育阶段或不同类型的组织或细胞中转录，或对不同环境或生理条件反应时的基因表达。启动子通常分为“组成型启动子”、“可诱导启动子”或“可调控启动子”；按组织和细胞划分可分为“细胞特异性启动子”、“组织特异性启动子”、“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”等。可表达的天然细胞结构蛋白基因上游都有与其相配的启动子，不同的基因DNA 片段可以有不同或相同的启动子。用于表达本发明癌症治疗基因的启动子是肝癌细胞组织特异性hAFP启动子，可使其下游的治疗基因只在肝癌细胞中表达，对其他组织或细胞无效因而无害。本文所用的术语“宿主”指哺乳动物和人。“宿主细胞”指癌细胞，特别是肝癌细胞， 尤其是人肝癌细胞。除了上述专门的定义外，本文所用的其他所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域技术人员所熟悉的意义相同。本文所用术语目的仅是描述，而非限制本发明。本发明第一方面，提供三种含有人肝癌组织特异性hAFP启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述单个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53，或酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或不含CpG基序的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。这一组含有人肝癌组织特异性启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒，该类质粒需用GT115大肠杆菌培养产生。所述含有人肝癌组织特异性启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体是质粒序列表中序列1所示的AP质粒，质粒序列表中序列2所示的AY质粒，和质粒序列表中序列3所示的 AT质粒。本发明第二方面，提供二种含有人肝癌组织特异性hAFP启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述二个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53和酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或人抑癌基因hp53和不含CpG基序的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 HSV-tk-Δ CpG 基因。这二种含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒，该类质粒需用GT115大肠杆菌培养产生。所述含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体是质粒序列表中序列4所示的APAY质粒，和质粒序列表中序列5所示的APAT质粒。本发明构建的含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组APAY质粒和APAT质粒，包含二个癌症治疗基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，和二个癌症治疗基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的二种蛋白质，而不是表达为融合蛋白。本发明第三方面，提供一种含有人肝癌组织特异性hAFP启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述三个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和不含CpG基序的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。这种含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒，该类质粒需用GT115大肠杆菌培养产生。所述重组真核表达载体是质粒序列表中序列6所示的APAYAT质粒。本发明构建的含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组APAYAT 质粒，包含三个癌症治疗基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，和三个癌症治疗基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的三种蛋白质，而不是表达为融合蛋白。本发明第四方面，提供构建上述真核表达载体的方法，其中，各癌症治疗基因之前的人肝癌组织特异性hAFP启动子采用其各自的优化特异性引物进行PCR扩增而制备；然后采用基因重组技术将各癌症治疗基因先分别与hAFPfory⑶启动子连接起来，，并使其一侧含有Not I和!^ba I酶切位点，再一起插入表达载体CpG-mcSG2中的“组合连接”方法，而不采取常规的顺序插入连接方法。本发明的构建上述真核表达载体的方法具体包括如下步骤(1)构建各癌症治疗基因之前的人肝癌组织特异性hAFPfory⑶启动子，其中用序列表中的特异性引物1和2，进行PCR扩增制备人抑癌基因hp53前的启动子；用序列表中的优化特异性引物3和4，进行PCR扩增制备酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD前的启动子；用序列表中的优化特异性引物5和6，进行PCR扩增制备单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 HSK-tk-ACpG前的启动子；(2)将人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSK-tk- Δ CpG用基因重组技术分别与各自的hAFPfory⑶启动子连接起来，并使其一侧含有Not I和!^ba I酶切位点；(3)分别将与hAFPfory⑶启动子连接的一个、或二个、或三个癌症治疗基因一起插入表达载体CpG-mcSG2中，而不采取常规的hAFP启动子与癌症治疗基因顺序插入方法。本发明构建的这些重组真核表达载体是哺乳动物表达载体，可用于转染或转化哺乳动物或人的肝癌细胞，在肝癌宿主细胞中表达上述癌症治疗蛋白质，配合应用相应的前药，达到抑制肝癌细胞增殖，杀死肝癌细胞，治疗肝癌的目的。附图简要说明

图1是AP质粒示意图。图2是AP质粒阳性菌落PCR扩增片段琼脂糖电泳检测结果。图3是AY质粒示意图。图4-1是AY质粒阳性菌落PCR扩增片段AFP的琼脂糖电泳检测结果；图4_2是AY 质粒阳性菌落PCR扩增片段yCD的琼脂糖电泳检测结果。图5是AT质粒示意图。图6是AT质粒阳性菌落PCR扩增片段琼脂糖电泳检测结果。图7是质粒APAY示意图。图8-1是APAY质粒阳性菌落PCR扩增片段AFP的琼脂糖电泳检测结果；图8_2是 APAY质粒阳性菌落PCR扩增片段yCD的琼脂糖电泳检测结果；图8_3是APAY质粒阳性菌落PCR扩增片段hp53的琼脂糖电泳检测结果。图9是APAT质粒示意图。图10-1是APAT质粒阳性菌落PCR扩增片段AFP的琼脂糖电泳检测结果；图10-2 是APAT质粒阳性菌落PCR扩增片段hp53和HSV_tk’的琼脂糖电泳检测结果。图11是APAYAT质粒示意图。图12-1是APAYAT质粒阳性菌落PCR扩增片段AFP的琼脂糖电泳检测结果；图 12-2是APAYAT质粒阳性菌落PCR扩增片段hp53和yCD的琼脂糖电泳检测结果；图12_3是 APAYAT质粒阳性菌落PCR扩增片段HSV-tk’的琼脂糖电泳检测结果。图13是质粒组成示意图。图14是培养的人肝癌h印G2细胞株照片。图15是培养的人宫颈癌HeLa细胞株照片。图16是不同剂量APAYAT质粒转染h印G2细胞后hp53、yCD和HSV_tk三种基因表达的mRNA的半定量RT-PCR分析(琼脂糖电泳条带)。β -actin(肌动蛋白)基因作内对照。从左至右泳道 1、2、3、4、5 分别为 0. 001μ g、0. 01 μ g、0. 1μ g、ly g 禾口 IOgAPAYAT 质粒转染细胞，泳道6为空载体pCpG转染细胞，泳道7为转染试剂Lipofectamine 2000处理细胞，泳道8为未转染细胞。图17-1是不同剂量APAYAT载体转染转染h印G2细胞后hp53基因的表达情况；图17-2是不同剂量APAYAT载体转染转染hep G2细胞后y⑶基因的表达情况；图17_3是不同剂量APAYAT载体转染转染h印G2细胞后HSV-tk’基因的表达情况。图中，pCpG = 空质粒，Iipo = Iipofectamine 2000，none =未转染细胞。图18是APAYAT质粒转染h印G2细胞后1、2、3、6、9天hp53、yCD和HSV-tk基因表达的mRNA比较。图中，β -actin基因作内对照，control =空质粒pCpG。图19-1是APAYAT载体转染转染h印G2细胞后不同时间hp53基因的表达情况； 图19-2是APAYAT载体转染转染hep G2细胞后不同时间y⑶基因的表达情况；图19_3是 APAYAT载体转染转染h印G2细胞后不同时间HSV-tk’基因表达mRNA的情况。图中，pCpG =空质粒。图20是蛋白浓度测定标准曲线。X轴为蛋白浓度yg/mL，Y轴为吸光值。图21是不同剂量APAYAT转染h印G2细胞产生的hp53蛋白的Western印染分析。上面一行:1、2、3、4 禾口 5 分别为 0. 005μ g、0. 05 μ g、0. 5 μ g、5 μ g 禾口 50μ gAPAYAT 转染 hep G2细胞产生的hp53蛋白条带；6为5yg空质粒pCpG。下面一行同样剂量APAYAT转染h印G2细胞产生的α -Tubulin =对照α -微管蛋白。图22是APAYAT (简写为PYT)转染加不同前药处理的hepG2细胞的增殖活性分析 (MTT 法)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中采用的构建重组真核表达载体的基因工程分子克隆方法、分子生物学实验方法、聚合酶链式反应(PCR)、酶切、连接、转化、琼脂糖凝胶电泳、质粒抽提、阳性菌落选择、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、细胞培养和蛋白质纯化方法、 MTT方法等是本领域技术人员所熟知的，并可参照卢圣栋主编“现代分子生物学实验技术”， (第二版，中国协和医科大学出版社，1999年12月，北京)；和J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)， Freshney(1994)《动物细胞培养，基本技术手册》(Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique)，第3版，纽约韦利-李斯出版社(Wiley-Liss) ;J Ε.科林根等著，李慎涛等译《精编蛋白质科学实验指南》(科学出版社，北京)中有关章节所述程序，或按照试剂盒制造厂商所建议的程序实施，在本说明书中不作详细描述。虽然可采用与本文所述方法相似或相等的任何方法和材料实施或检验本发明，但本文所述的是较佳的材料和方法。 本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均属于本申请书的权利要求范围内。一.主要实验材料和仪器1.质粒、菌株和细胞株真核表达载体pCpG-mcSG2 (哺乳动物表达载体)、pDRIVE_hAFP (含人肝癌特异性启动子序列hATP)、p0RF-hp53 (含人抑癌基因hp53)、pORF-Fcy (含酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因y⑶)、pORF-TK- Δ CpG (含无CpG基序的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷酸激酶TK自杀基因)质粒购自美国hvitrogen公司。GTl 15大肠杆菌购自美国hvitrogen公司，DH5 α感受态细胞购自天根生化科技
15(北京)有限公司，2163无甲基化菌株为加拿大!^rmentas公司赠送。人肝癌细胞株h印G2购自中科院细胞库，人宫颈癌细胞株HeLa购自欧洲ECACC 细胞库。h印G2细胞用添加了 10%胎牛血清的DMEM培养液培养，HeLa细胞用添加了 10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，培养条件37°C和5% C02。2主要仪器设备MG96G型PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；LF杂交炉宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机和TDL-5M台式大容量低速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；UV-2102PC分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；平板摇床，上海苏坤实业有限公司；Tanon-1600数码凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司；蛋白电泳设备美国Thermo公司；PE Victor III多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司。3试剂、酶与药品pMD18-T Simple Vector试剂盒、Taq II DNA聚合酶、PrimeSTARDNA聚合酶、T4DNA 连接酶、DNA分子量标准DL2000、购自宝生物工程(大连)有限公司，购买时附带赠送相应的缓冲液和dNTP ；各种核酸限制性内切酶、蛋白分子量标准品(10-170kDa)、DNA分子量标准品，购自加拿大i^rmentas公司，附带赠送相应的缓冲液；一步法RNAPCR试剂盒购自Takara公司；DNA片段胶回收(小量)试剂盒、质粒提取(小量)试剂盒、总RNA (小量)抽提试剂盒购自Axygen公司；质粒提取(大量)试剂盒购自QIAGEN公司；Lipofectamine 2000试剂盒购自Invitrogen公司；蛋白定量检测试剂盒购自Thermo公司；无菌DMEM培养基、RPMI-1640培养基和胎牛血清、化学发光底物SuperSignal West Pico购自Hiermo公司；蛋白酶抑制剂cocktail试剂盒购自德国Roche Diagnostics 公司；硝酸纤维素膜购自美国GE公司；X-光胶片购浙江海门市碧云天生物技术研究所；鼠抗人P53单克隆抗体、鼠抗人α-微管蛋白单克隆抗体购自美国Santa CruzBiotechnology, Inc.公司；抗-小鼠IgG辣根过氧化物酶标记(第二)抗体购自美国Cell Signaling公司；DEPC(焦碳酸二乙酯)原液购自美国Research Product International Corp.公司；5-FC、GCV、博莱霉素(Zeocin)购自美国 Invivogen 公司；除非特别声明，Tris碱、SDS、EDTA、β -巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、氨苄青霉素 (Amp)、卡那霉素(Km)、甘油、溴酚蓝等生化试剂和常规化学试剂购自国药集团上海化学试剂有限公司；显影液、定影液购上海冠龙照相器材公司；实施例中所有用于PCR的引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由英潍捷(上海) 贸易有限公司完成。二 .实施例构建重组质粒和转化感受态大肠杆菌细胞所用主要方法1.聚合酶链式反应(PCR)目的DNA片段扩增PCR
权利要求
1.一组含有人肝癌组织特异性启动子和单个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述单个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53，或酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。
2.如权利要求1所述的重组真核表达载体，其中所述真核表达载体是不含CpG基序的 PCpGmcs G2类型质粒，该类质粒需用GTl 15大肠杆菌培养产生。
3.如权利要求1所述的重组真核表达载体，其中所述真核表达载体是序列表中序列1 所示的AP质粒，序列表中序列2所示的AY质粒，或序列表中序列3所示的AT质粒。
4.一种含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述二种癌症治疗基因是人抑癌基因hp53和酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD。
5.如权利要求4所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒，该类质粒需用GT 115大肠杆菌培养产生。
6.如权利要求4所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是序列表中序列4所示的APAY质粒。
7.如权利要求4所述的重组真核表达载体，其中所述人抑癌基因hp53和酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD之前分别有各自的一个hAFP启动子，所述人抑癌基因hp53和酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的二种蛋白质，而不是表达融合蛋白。
8.一种含有人肝癌组织特异性启动子和二个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述二种癌症治疗基因是人抑癌基因hp53和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG 基因。
9.如权利要求8所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒，该类质粒需用GT 115大肠杆菌培养产生。
10.如权利要求8所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是序列表中序列5所示的APAT质粒。
11.如权利要求8所述的重组真核表达载体，其中所述人抑癌基因hp53和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，所述人抑癌基因hp53和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾，从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的二种蛋白质，而不是表达融合蛋白。
12.—种含有人肝癌组织特异性启动子和三个癌症治疗基因的重组真核表达载体，所述人肝癌组织特异性启动子是hAFP启动子，所述三个癌症治疗基因是人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因。
13.如权利要求12所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是不含CpG基序的 pCpGmcsG2类型质粒，该类质粒需用GTl 15大肠杆菌培养产生。
14.如权利要求12所述的重组真核表达载体，所述真核表达载体是序列表中序列6所示的APAYAT质粒。
15.如权利要求12所述的重组真核表达载体，其中所述人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因之前分别有各自的一个hAFP启动子，所述人抑癌基因 hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk- Δ CpG基因之后分别有各自的一个聚腺苷酸尾， 从而可在转染的宿主细胞中分别表达相应的三种蛋白质，而不是表达融合蛋白。
16.权利要求1、4、8和12所述重组真核表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤(1)构建各癌症治疗基因之前的人肝癌组织特异性hAFP启动子，其中用序列表中的特异性引物1和2，进行PCR扩增制备人抑癌基因hp53前的启动子；用序列表中的优化特异性引物3和4，进行PCR扩增制备酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD前的启动子；用序列表中的优化特异性引物5和6，进行PCR扩增制备单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSK-tk- Δ CpG 前的启动子；(2)将人抑癌基因hp53、酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSK-tk- Δ CpG用基因重组技术分别与各自的hAFP启动子连接起来，并使其一侧含有 Not I和Fba I酶切位点；(3)分别将与hAFP启动子连接的一个、或二个、或三个癌症治疗基因一起插入表达载体CpG-mcSG2中，而不采取常规的hAFP启动子与癌症治疗基因顺序插入方法。
全文摘要
本发明提供一组含有人肝癌组织特异性hAFP启动子和单个或二个或三个肝癌治疗基因的重组真核表达载体，所述肝癌症治疗基因是人抑癌基因hp53，或酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因yCD，或不含非甲基化胞苷-鸟苷二核苷酸基序CpG的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV-tk-ΔCpG基因。所述真核表达载体是不含CpG基序的pCpG mcs G2类型质粒。所述重组真核表达载体包括质粒AP、质粒AY、质粒AT、质粒APAY、质粒APAT和质粒APAYAT，分别由序列表的序列1-序列6表示。本发明还提供这些重组真核表达载体的制备方法。
文档编号C12N15/64GK102344933SQ20111013161
公开日2012年2月8日 申请日期2011年5月20日 优先权日2010年5月21日
发明者沈路一 申请人:圣太科医疗科技(上海)有限公司