专利名称:倍半萜类化合物Trichothec－9－en－4－o1,12,13－epoxy－,acetate,(4β)－(8CI,9CI ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域：
，特别是涉及植物内生真菌防治部分植物真菌病害有效菌株的分离，及其抑菌代谢产物的制备与应用方法。
背景技术：
植物体内都存在大量的内生真菌，内生真菌最早发现于牧草，后来又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔藓、地衣、海藻等植物中被发现。迄今的研究表明，植物内生真菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫等。发挥这些作用是由于内生真菌在植物体内繁殖和生长，并在体内产生有生物活性的次生代谢产物。因此，内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物控制剂，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。近年来植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前微生物源生物化学农药的研究和开发在我国十分活跃，但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发挥，而植物内生真菌即是这样一类有待开发的新兴微生物资源。
枸骨(Ilex cornuta Lindl.et Paxt.)为冬青科常绿植物，主要分布于河南、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建等地。枸骨叶味苦、微涩，性寒，是一种中药，始载于《本草拾遗》。传统中医药理论认为，枸骨叶具有清热养阴，平肝益肾，散风通络等功效；近代药理研究表明，枸骨叶具有抗生育，扩张冠状动脉，抗菌等作用。众所周知，雷公藤具有多种医药作用，从雷公藤中提取的化学成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制及抗生育作用，还有治疗类风湿性关节炎等作用。同样雷公藤也是一种良好的杀虫植物，具有胃毒、拒食、抑制生长发育等杀虫活性。D.Siva Sundara Kumar等从雷公藤中筛选到代谢产物具有抗类风湿作用的内生真菌(Journal of Ethnopharmacology，2004，295-300)，申屠旭萍等从雷公藤中筛选到具有对农作物真菌病害具有抑制作用的内生真菌(雷公藤内生真菌的分离及活性菌株的筛选，浙江农业学报，2006，18(5)308-312)。枸骨作为一种医药植物，已引起研究者广泛兴趣，但它是否也和雷公藤药用植物一样能在防治农作物病虫害中发挥作用，关于这方面的研究还未曾涉足，国内外未见有报道。为了能充分利用天然植物枸骨，发挥其对人类的最大作用，本发明对采自临安天目山的活体枸骨组织进行内生真菌的分离研究，并将所分离到的内生真菌对部分常见植物真菌病害病原菌拮抗活性进行了检测研究，该发明不仅为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株同时也为利用枸骨内生真菌的天然活性物质开发农用抗生素提供理论依据和生产参数。
发明内容
本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一种从枸骨组织内分离筛选出的内生真菌-哈茨木霉菌株L；本发明的另一目的是提供利用该菌株L通过发酵提取其代谢产物制备成防治部分植物真菌病害的微生物农药及其制备方法。
本发明枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L的分离、筛选与鉴定是于2006年5月在浙江临安天目山采集的枸骨茎中，经表面消毒、内生真菌的分离、培养和发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum Rifai)，定名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2006年8月14日，保藏登记号CGMCC No.1780。
枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L，其固体培养特征为菌落在PSA平板上25℃3-4天扩展9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝具隔，分枝。
其形态特征为分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm；分生孢子球形、近球形，单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，壁光滑，直径2.5-3.0μm；厚垣孢子球形、近球形，无色，光滑，直径5.5-7.0μm。
本发明所述的哈茨木霉菌株L，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性成分倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。
本发明目的通过以下技术方案来实现一种防治西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等植物真菌病害微生物农药的制备方法，按以下步骤进行(1)菌种的活化培养将分离保存的枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L菌种移至试管内马铃薯葡萄糖培养基(PDA)斜面上，在28℃±1℃条件下，菌种活化培养96h，至试管斜面长满绿色孢子；(2)种子液培养挑取少量活化培养孢子转接至马铃薯葡萄糖液体培养基，pH自然，每300mL三角瓶装发酵培养液40mL，种子摇床培养温度28℃±1℃，培养时间36h；(3)发酵培养发酵培养液为每1000mL中含有葡萄糖 10g，蔗糖 15g，牛肉膏 10g，蛋白胨 5g，MnCl215mg，CaCO32g，每300mL三角瓶装发酵培养液40mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下按体积百分含量5％～10％的接种量接种，在28℃±2℃条件下，培养4天；(4)发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学方法提取、层析，分离纯化获得倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，该化合物分子式为C17H24O4，结构式见下图； (5)将纯倍半萜类化合物配以农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。
本发明的有益效果一是本发明从枸骨中分离筛选出代谢物产量高、并对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的内生真菌菌株-哈茨木霉菌株L，该菌株L与以往关于哈茨木霉的众多报道存在有以下的不同之处，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一种微生物新菌株；其一，在菌株形态等特征上有明显的不同如发明专利申请《一种哈茨木霉真菌菌株》(公开号CN 1554742A)中哈茨木霉菌落在PSA培养基上形态为羊绒状，菌落老熟时暗绿色，形成明显的突起直达培养皿顶部；分生孢子梗呈树状分枝。而本发明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L在同样的培养基上培养后菌落不形成突起，产孢区为黄绿色，分生孢子单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓。迟玉杰等(对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定.哈尔滨工业大学学报，2002，34(6)784-788)报道的哈茨木霉菌株，孢子颜色为深绿色，平板反正面同色，菌落形态为棉絮状；而本发明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L菌落正面形成黄绿色产孢区，反面无色，正反面颜色完全不同。
其二，在利用哈茨木霉作为生防菌剂的抑制机理与利用方式有所不同以往研究大多是利用哈茨木霉菌株产生几丁质酶，通过几丁质酶降解真菌细胞壁的主要成分几丁质从而达到杀菌的目的。也有的报道是直接利用哈茨木霉孢子并开发成哈茨木霉孢子制剂防治植物真菌病害，目前生产上常用的木霉菌剂多为活分生孢子制剂，已有许多商品化的木霉制剂问世，如以色列开发的哈茨木霉T39可湿性粉剂Trichodex，美国的Topshield(哈茨木霉T22)等。而本发明是通过哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L产生的活性成分倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)来达到抑菌的目的。
二是本发明提供了从枸骨内生真菌-哈茨木霉菌株L的发酵物中提取其代谢产物倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，并进而制备成可防治植物真菌病害的微生物源农药的制备方法；该农药应用于植物真菌病害的防治，其效果较常规化学药剂略优(见试验例表1)，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。
图1为用插片法在400倍显微镜下观察到的哈茨木霉菌株L形态图。
具体实施方式
实施例1(内生真菌哈茨木霉菌株L的分离与筛选)本发明于2006年5月在浙江临安天目山采集的枸骨茎中，经表面消毒、内生真菌的分离、培养和发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的筛选等步骤，从中获得内生真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L，保存。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L抑菌活性测定取其发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌和番茄早疫病菌等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率 测定结果表明哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L代谢产物对黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌和番茄早疫病菌的抑制率分别为53.8％、54.5％、43.8％100％和68％。
实施例2(哈茨木霉菌株L发酵代谢产物的制备方法)按以下步骤进行(1)菌种试管斜面活化培养斜面培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，其组分与含量为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g；先将马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种针挑取少许哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L的菌种，至已灭菌的固体PDA培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃，活化培养96h，至试管斜面长满绿色孢子；(2)种子液培养种子培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，其组分与含量为马铃薯200g、葡萄糖20g；马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖，溶化后补足水至1L，pH自然；每300mL三角瓶装灭菌液体培养基40mL，并接入少许步骤(1)活化培养菌种孢子，置28℃±1℃，摇床培养36h，即为哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L种子液；(3)发酵培养发酵培养基为每1000mL中含有葡萄糖 10g，蔗糖 15g，牛肉膏 10g，蛋白胨 5g，MnCl215mg，CaCO32g，余量为水；每300mL三角瓶装40mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下，按体积百分含量5％～10％的接种量，接入哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)菌株L种子液，28℃±2℃，发酵培养4天；(4)发酵物提取发酵完毕后收集发酵液，采用乙酸乙酯萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，而后上硅胶柱层析，以石油醚和乙酸乙酯(体积比10％～90％)洗脱，分离纯化得倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)。
以下实施例3、4、5中所述的哈茨木霉菌株L代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量百分比。
实施例3(利用哈茨木霉菌株L发酵代谢产物制备成可湿性粉剂)其中白炭黑(上海富奇化工有限公司生产)
农乳0203-B(邢台蓝星助剂厂生产)木质素磺酸钠(上海威呈化工有限公司生产)轻质碳酸钙(上海大宇生化有限公司生产)产品含1.5％倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，加入2％的白炭黑作为吸附剂，并加入1％的农乳0203-B和3％的木质素磺酸钠辅料，最后用轻质碳酸钙补足到100％，混匀后，经气流粉碎制成可湿性粉剂(以下内容中称“产品A”)。
实施例4(利用哈茨木霉菌株L发酵代谢产物制备成微乳剂)。
其中甲醇(上海申兴制药厂生产)农乳601(邢台蓝星助剂厂生产)十二烷基磺酸钠(上海盛众精细化工有限公司生产)尿素(泰林化工集团公司生产)产品含1.5％的倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，用5％的甲醇溶解，并加入2％农乳601和0.5％十二烷基磺酸钠作为分散助剂，加入1％尿素作为防冻剂，最后用水补足到100％，35℃下混匀，经高剪切乳化器乳化分散后制成微乳剂(以下内容中称“产品B”)。
实施例5(利用哈茨木霉菌株L发酵代谢产物制备成乳油)其中乙醇(上海申兴制药厂生产)农乳0204(邢台蓝星助剂厂生产)二甲苯(上海申兴制药厂生产)
产品2％的倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，用4％的乙醇溶解，加入质量5％农乳0204-C作为乳化剂，最后用二甲苯补足到100％，搅拌混匀制成乳油(以下内容中称“产品C”)。
试验例(本发明产品与常规农药防治效果对比试验)将“产品A、B、C”对西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄瓜立枯病、菜豆炭疽病和番茄早疫病等植物病害进行防治试验，以常规化学农药、清水为对照，如表1所示，试制的农用杀菌剂“产品A、B、C”比常规化学农药防治效果略优。
表1产品A、B、C对几种植物真菌病害防效统计表(药效试验均于2006年7月-9月在杭州市郊试验农田进行)
“-”为未试验。
权利要求
1.倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)的制备方法，其特征在于哈茨木霉菌株L经斜面活化培养、种子液培养、发酵培养获得含有Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)的发酵液，向发酵液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，取上层，并在真空条件下浓缩至浸膏，然后进行硅胶柱层析，以体积比10％～90％的石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，分离纯化得倍半萜类化合物Trichothec-9-en-4-ol，12，13-epoxy-，acetate，(4β)-(8CI，9CI)，所述的哈茨木霉菌株L已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.1780。
2.权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的菌种L斜面活化培养步骤为斜面培养基为PDA马铃薯葡萄糖培养基，其组分与含量为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g；马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L；在无菌条件下用接种针挑取少许哈茨木霉菌株L的菌种，至已灭菌的固体PDA培养基试管中，置培养箱内28℃±1℃，活化培养96h，至试管斜面长满绿色孢子；所述的种子液培养为种子培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，其组分与含量为马铃薯200g、葡萄糖20g；马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖，溶化后补足水至1L，pH自然；每300mL三角瓶装灭菌液体培养基40mL，并接入少许活化培养菌种，置28℃±1℃，摇床培养36h，即为哈茨木霉菌株L种子液；所述的发酵培养为发酵培养基为每1000mL中含有葡萄糖10g，蔗糖15g，牛肉膏10g，蛋白胨5g，MnCl215mg，CaCO32g，每300mL三角瓶装40mL发酵培养液，配制后121℃灭菌20min，冷却至40℃，在无菌条件下，按体积百分含量5％～10％的接种量，接入哈茨木霉菌株L种子液，28℃±2℃，发酵培养4天。
专利摘要
本发明公开了枸骨内生真菌哈茨木霉菌株L的活性代谢产物倍半萜类化合物Trichothec－9－en－4－ol，12，13－epoxy－，acetate，(4β)－(8CI，9CI)的制备方法以及在防治植物真菌病害中的应用，属于微生物农药技术领域：
。该发明包括菌种的活化培养，种子培养，发酵培养、及发酵物提取等步骤。本发明首次将枸骨内生真菌发酵代谢产物应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了一个新的途径。
文档编号C12R1/645GKCN101041840SQ200710066846
公开日2007年9月26日 申请日期2007年1月25日
发明者俞晓平, 申屠旭萍, 陈列忠 申请人:中国计量学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan