专利名称：:一种流感病毒的培养方法一种流感病毒的培养方法发明领域本发明涉及一种流感病毒的培养方法，具体涉及一种用细胞培养技术培养流感病毒的方法，属于流感病毒疫苗生产领域。
背景技术：
：目前，包括高致病性禽流感病毒在内，流感疫苗的生产还主要靠鸡胚培养技术，学者们一直在探讨用细胞培养技术生产流感疫苗，但一直没有找到合适的细胞。某些细胞能够用于疫苗生产，如中国专利公开号C歸53172，公开日2005.08.10，名称为"用于病毒培养的棉鼠肺细胞"的发明专利公开了棉鼠细胞系，棉鼠细胞用于生长、繁殖、或培养生物体、病原体或病毒诸如PRRSV以及由此产生的生物体、病原体或病毒的用途。但是其却不能用于流感病毒的培养。到目前为止，人们仅发现了原代猴肾细胞(PMK)和细胞系MDCK、Vero、A549、HEK等少数几种细胞能够用于培养流感病毒。H1N1型等低致病性流感病毒更是只能首选在MDCK细胞系上培养。但是，这些细胞或细胞系，有的如猴肾原代细胞获取代价太高，有的如细胞系可能有癌变性质，不适合用于疫苗尤其是人用疫苗的生产。即便这些细胞或细胞系能够用于疫苗生产，其培养所得的流感病毒毒价往往较低，通过直接血凝法测定，一般只能达到25左右，尚不足以达到生产优质疫苗的毒价水平。另外，流感病毒尤其是H1N1等型流感病毒，在进行培养前必须进行预处理，目前预处理的方法主要是将病毒溶解于含有胰蛋白酶的溶液中再接种。添加胰蛋白酶等酶类制剂对鸡胚培养流感病毒的继续生长可能没有影响，但在用细胞培养流感病毒，尤其是用贴壁生长的细胞培养流感病毒时，其流感病毒的凝血效价始终不高。因此寻找高效、低成本、安全的培养流感病毒用细胞源以及与其配套的培养技术成为目前流感疫苗生产领域中主攻方向之一。
发明内容本发明的目的是寻找更高效、更适用于流感疫苗生产的，流感病毒培养用新细胞源及其培养技术，提出了一种更高效价，无癌变危险的流感病毒培养方法。本发明的目的是通过以下方式实现的一种流感病毒的培养方法，即用山羊胎儿肾细胞培养作为流感病毒培养的细胞源，具体操作步骤如下-A、选取怀孕2月龄以上的母山羊，在无菌条件下采用剖腹手术将羊胎儿连同胎膜一起取出，剥离胎膜，取出羊胎儿放入盛有无菌PBS溶液的培养皿中，洗涤2—3次，用手术器械剖开羊胎儿腹腔，取出肾脏，按照组织细胞原代培养方法，将羊胎儿肾组织制备培养成原代细胞；B、对采用鸡胚培养的流感病毒进行预处理；C、将预处理后的流感病毒接种于由羊胎儿肾组织培养成的原代细胞中，先按每个细胞瓶培养流感病毒所需培养基总量的1/4加入经预处理后的病毒液，37'C下，培养2-3小时后补足培养基，继续培养48-72小时，收集细胞培养液并在1500-2000转/分下离心10-20分钟取上清，得到含流感病毒的上清液。本发明所述步骤B中采用细胞冻融提取物对鸡胚培养的流感病毒进行预处理，所述细胞冻融提取物是动物成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞的冻融提取物，其制备和预处理方法如下A.细胞冻融物的制备无菌环境下，将培养好的动物成纤维细胞或小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞除去培养液，经两次冻融，让细胞充分破裂，成为细胞冻融碎片，培养瓶中按照每个100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打细胞培养面，将细胞冻融碎片吹入溶液中，将溶液吸入离心管内，经2500-3000转/分离心，取上清，经0.22微米过滤膜过滤除菌，即成细胞冻融提取物；B.流感病毒的预处理先将准备接种的鸡胚培养的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接种细胞所需浓度的病毒液，然后将该病毒液与上述冻融提取物按l:l比例混合，静置5-IO分钟，再进行接种。与现有技术相比本发明具有以下明显的优点1、用直接血凝法测定本发明技术所培养的H1N1型流感病毒，其毒价可达到28以上，山羊胎儿肾原代细胞传代到第七代后依然可以用于流感病毒培养，此时培养的H1N1型流感病毒的毒价也可以达到26以上。用原代细胞培养的流感病毒，其毒价显著高于用现行技术培养的流感病毒。2、所用细胞为原代细胞，用于疫苗生产不存在癌变物质危险性。43、所用细胞来源较广，获取成本较低，与一般的山羊屠宰加工企业联系即可。4、流感病毒的预处理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶对产毒细胞的影响。图1是本发明中未接种H1N1型流感病毒时山羊胎儿肾细胞的显微图片；图2是本发明接种H1N1型流感病毒24小时后山羊胎儿肾细胞的显微图片；图3是本发明接种H1N1型流感病毒病变后山羊胎儿肾细胞的显微图片；具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述一种流感病毒的培养方法，即用山羊胎儿肾细胞培养作为流感病毒培养的细胞源，具体操作步骤如下A、选取怀孕2月龄以上的母山羊，在无菌条件下采用剖腹手术将羊胎儿连同胎膜一起取出，剥离胎膜，取出羊胎儿放入盛有无菌PBS溶液的培养皿中，洗涤2—3次，用手术器械剖开羊胎儿腹腔，取出肾脏，按照组织细胞原代培养方法，将羊胎儿肾组织制备培养成原代细胞；B、对采用鸡胚培养的流感病毒进行预处理；C、将预处理后的流感病毒接种于由羊胎儿肾组织培养成的原代细胞中，先按每个细胞瓶培养流感病毒所需培养基总量的1/4加入经预处理后的病毒液，37'C下，培养2-3小时后补足培养基，继续培养48-72小时，收集细胞培养液并在1500-2000转/分下离心10-20分钟取上清，得到含流感病毒的上清液。本发明所述步骤B中采用细胞冻融提取物对鸡胚培养的流感病毒进行预处理，所述细胞冻融提取物是动物成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞的冻融提取物，其制备和预处理方法如下A.细胞冻融物的制备无菌环境下，将培养好的动物成纤维细胞或小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞除去培养液，经两次冻融，让细胞充分破裂，成为细胞冻融碎片，培养瓶中按照每个100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打细胞培养面，将细胞冻融碎片吹入溶液中，将溶液吸入离心管内，经2500-3000转/分离心，取上清，经0.22微米过滤膜过滤除菌，即成细胞冻融提取物B.流感病毒的预处理先将准备接种的鸡胚培养的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接种细胞所需浓度的病毒液，然后将该病毒液与上述冻融提取物按l:l比例混合，静置5-10分钟，再进行接种。按本发明方法培养H1N1型流感病毒并与MDCK细胞作对比试验，其结果如下1.MDCK和山羊胎儿肾细胞培养H1N1型流感病毒后其培养液的血凝效价检测结果见表一<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.参见图1、图2、图3，山羊胎儿肾细胞培养H1N1型流感病毒的病变过程，从上述照片中看出当H1N1型流感病毒接种于山羊胎儿肾细胞(GH)细胞上。24小时后几乎全部的易感细胞都出现病变，即肿胀变大、空泡样变化，并大量崩解成碎片脱落，脱落部分无细胞形态。其中的非易感细胞则继续生长并且可以继续传代。这与MDCK细胞的网络样病变差别明显。3.将在100ml细胞培养瓶中培养48小时、且已长满瓶的上皮养分化细胞，弃去上清，-30'C下冻融2次，每瓶加2mlPBS反复吹打，离心取上清，0.22um过滤，冻存备用。进行细胞冻融物及胰蛋白酶对流感病毒培养的对比试验，其检测结果见表二表二、预处理物对流感病毒培养的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1、一种流感病毒的培养方法，其特征是用山羊胎儿肾细胞培养作为流感病毒培养的细胞源，具体操作步骤如下A、选取怀孕2月龄以上的母山羊，在无菌条件下采用剖腹手术将羊胎儿连同胎膜一起取出，剥离胎膜，取出羊胎儿放入盛有无菌PBS溶液的培养皿中，洗涤2-3次，用手术器械剖开羊胎儿腹腔，取出肾脏，按照组织细胞原代培养方法，将羊胎儿肾组织制备培养成原代细胞；B、对采用鸡胚培养的流感病毒进行预处理；C、将预处理后的流感病毒接种于由羊胎儿肾组织培养成的原代细胞中，先按每个细胞瓶培养流感病毒所需培养基总量的1/4加入经预处理后的病毒液，37℃下，培养2-3小时后补足培养基，继续培养48-72小时，收集细胞培养液并在1500-2000转/分下离心10-20分钟取上清，得到含流感病毒的上清液。2、根据权利要求1所述的一种培养流感病毒的新方法，其特征在于所述步骤B中采用细胞冻融提取物对鸡胚培养的流感病毒进行预处理，所述细胞冻融提取物是动物成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞的冻融提取物，其制备和预处理方法如下A.细胞冻融物的制备无菌环境下，将培养好的动物成纤维细胞或小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞除去培养液，经两次冻融，让细胞充分破裂，成为细胞冻融碎片，培养瓶中按照每个100毫升瓶中加入3-5毫升的比例加入PBS溶液，吹打细胞培养面，将细胞冻融碎片吹入溶液中，将溶液吸入离心管内，经2500-3000转/分离心，取上清，经0.22微米过滤膜过滤除菌，即成细胞冻融提取物；B.流感病毒的预处理先将准备接种的鸡胚培养的流感病毒，用PBS溶液配成10倍于接种细胞所需浓度的病毒液，然后将该病毒液与上述冻融提取物按l:l比例混合，静置5-10分钟，再进行接种。专利摘要一种流感病毒的培养方法，用山羊胎儿肾细胞培养作为流感病毒培养的细胞源。采用细胞冻融提取物对鸡胚培养的流感病毒进行预处理，所述细胞冻融提取物是动物成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞的上皮样分化细胞的冻融提取物。本发明培养的流感病毒其毒价显著高于用现行技术培养的流感病毒。所用细胞为原代细胞，用于疫苗生产不存在癌变物质危险性；所用细胞来源较广，获取成本较低；流感病毒的预处理不用胰蛋白酶，避免了胰蛋白酶对产毒细胞的影响。文档编号C12N7/00GKCN101260385SQ200810047297公开日2008年9月10日申请日期2008年4月11日发明者高其双,黄海军申请人:武汉市畜牧兽医科学研究所导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan