专利名称：呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明是涉及多种呼吸道病毒诊断用的引物和探针。特别地，本发明是一种能同 时进行呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒四种病毒诊断的引物和探针。
背景技术：
急性呼吸道感染90%以上是由病毒引起的，其中以呼吸道病毒最常见，如甲型流 感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒呼吸道合胞病毒(RSV)以及腺病毒等，多种病毒具有感 染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点。呼吸道病毒感染常可导致较高的发病率和死亡 率，尤其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒发生各种变异，常突然暴发，病情凶险， 病死率高，并且近年来新的致病性病毒还在不断地被发现，如人类偏肺病毒、SARS病毒、高 致病性禽流感病毒等，给临床诊断和治疗及疾病的监控带来很大困难，如1997年在香港肆 虐的禽流感以及2003年SARS的暴发。这些都提示我们即时与准确的鉴别诊断，快速识别 病原体，对预防疾病的传播和患者的诊断治疗至关重要。同时，鉴别诊断对于制定策略与计 划来应对像SARS暴发一样的公共卫生危机也有非常重大的意义。因此针对多种呼吸道病 毒感染病原的同时，快速检测技术的建立将大大推进呼吸系统感染疾病的诊断与治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时对呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感 病毒进行诊断的引物和探针。基于上述目的，本发明采用以下技术方案。检测和鉴定不同病毒的引物和配套探针可以混合使用，不会相互干扰检测和鉴定 的结果。用于检测多种呼吸道病毒的引物和探针序列分别包括(1)合胞病毒引物和探针上游引物RSV F GCAAATATGGAAACATACGTGAACA下游引物RSV R GCACCCATATTGTffAGTGATGCA探针RSV Probe CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ(2)腺病毒引物和探针上游引物 AdV F GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT下游引物AdV R :GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC探针AdV Probe TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 1(3)副流感病毒引物和探针上游引物PIV-1F :GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT下游引物PIV-1R GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA探针PI V-lProbe :TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRA上游引物PIV-2F GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA
3
下游引物PIV-2R :ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC探针PIV-2Probe :CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAFAM_TAMRA(4)流感病毒引物和探针上游引物IfB F :AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA下游引物I fB R CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA探针IfB Probe CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC JOE-TAMRA上游引物IfA F :AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA下游引物I fA R CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC探针IfA Probe TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB本发明的具体原理是利用一对靶核酸序列的特异性引物和探针，采用一步法实时 荧光定量RT-PCR试剂盒，通过PCR技术实现靶核酸序列片断的扩增。所使用的探针为两端 分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发 出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合 在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量 的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存 在。本发明将多重PCR与Taqman荧光探针技术结合起来，即在一次检测过程中，可对 多种可能引发急性呼吸道感染的病原体进行同时检测，达到快速诊断、指导治疗的目的，从 而克服常规PCR的局限性，解决了临床上的检测通量的瓶颈问题，缩短工作时间，减少原料 耗损，并且具有敏感性、特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度更高等特点。荧光探针 定量PCR检测技术巧妙地利用了 PCR技术的DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术 的敏感性及定量分析的优点。同时克服了传统PCR技术易污染、假阳性率高且不能定量的 缺点，成为目前最先进的检测技术。
具体实施例方式1.引物和探针的设计通过分别对所有已知的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感 病毒和流感病毒的基因序列进行比较分析，选择高度保守的区段，设计多对引物和探针，引 物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下(1)合胞病毒引物和探针上游引物RSV F GCAAATATGGAAACATACGTGAACA下游引物RSV R GCACCCATATTGTffAGTGATGCA探针RSV Probe CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ(2)腺病毒引物和探针上游引物AdV F :GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT下游引物AdV R :GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC探针AdV Probe TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 1(3)副流感病毒引物和探针上游引物PIV-1F :GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT
下游引物 PIV-1R GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA
4
探针PI V-lProbe :TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRA上游引物PIV-2F GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA下游引物PIV-2R :ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC探针PIV-2Probe :CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAFAM_TAMRA(4)流感病毒引物和探针上游引物IfB F :AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA下游引物I fB R CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA探针IfBProbe CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC JOE-TAMRA上游引物IfA F :AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA
下游引物 I fA R CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC探针IfAProbe TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB2.反应体系的优化利用灭活的呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病 毒作为待检样品，用Trizol试剂抽提病毒基因组RNA，分装后贮存于_80°C。2. 1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将呼吸道合胞病毒、腺 病毒、副流感病毒和流感病毒引物浓度分别从0. 1 u mol/1至1. 6 y mol/1作倍比连续稀释， 通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0. 2 y mol/1。2. 2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将呼吸道合胞病毒、腺 病毒、副流感病毒和流感病毒探针浓度分别从0. 1 u mol/1至0. 5 y mol/1作倍比连续稀释， 通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0. 16 u mol/1。利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的呼吸道合胞病毒、腺 病毒、副流感病毒和流感病毒实时荧光RT-PCR反应体系为25 yl。按照一步法荧光定量 RT-PCR试剂盒说明进行反应液的配置。3.仪器检测通道的选择选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说 明书进行设置。4. PCR反应条件如下42°C 30min 进行逆转录反应；95°C 3min, 1 个循环；94°C 10s, 55°C 40s, 40 个循环， 在55°C40s阶段收集荧光。5.检测结果分析如果待检样本中含有呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒，则显示阳 性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，如果待检样本中没有呼吸道合胞病毒、 腺病毒、副流感病毒和流感病毒，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和 探针具有良好的特异性和灵敏度。本发明的优点在于(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，说明其灵敏
度良好。(2)本发明提供的引物和探针对不含呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感 病毒的样本没有检测信号，说明其特异性强。(3)由于本发明是针对呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒基因序列进行比对分析，选取高度保守部位进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的出现。诊断呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的引物和探针序列合胞病毒引物和探针RSV F GCAAATATGGAAACATACGTGAACARSV R GCACCCATATTGTWAGTGATGCARSV Probe CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ腺病毒引物和探针AdV F GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTAdV R GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCAdV Probe TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 1副流感病毒引物和探针PIV-1F GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATTPIV-1R GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAAPI V-lProbe TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRAPIV-2F GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGAPIV-2R ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAACPIV-2Probe CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA FAM-TAMRA流感病毒引物和探针IfB F AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAAIfB R CCAGCAATAGCTCCGAAGAAAIfBProbe CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC JOE-TAMRAIfA F AAGACCAATCCTGTCACCTCTGAIfA R CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCIfA Probe TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB
权利要求
一种用于检测和鉴定四种呼吸道常见病毒的引物序列，四种呼吸道常见病毒包括呼吸道胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒，引物序列包括下面6个序列(1)一种用于检测和鉴定呼吸道合胞病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物RSV F序列为5’GCAAATATGGAAACATACGTGAACA 3’，下游引物RSV R序列为5’GCACCCATATTGTWAGTGATGCA 3’；(2)一种用于检测和鉴定腺病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物AdV F序列为5’GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT 3’，下游引物AdV R序列为5’GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC 3’；(3)一种用于检测和鉴定副流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物PIV-1F序列为5’GTTGTCAATGTCTTAATTCGTATCAATAATT 3’，下游引物PIV-1R序列为5’GTAGCCTMCCTTCGGCACCTAA 3’；(4)一种用于检测和鉴定副流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物PIV-2F序列为5’GCATTTCCAATCTTCAGGACTATGA 3’，下游引物PIV-2R序列为5’ACCTCCTGGTATAGCAGTGACTGAAC 3’；(5)一种用于检测和鉴定流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物IfAF序列为5’AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA 3’，下游引物IfA R序列为5’CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC3’；(6)一种用于检测和鉴定流感病毒的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物IfB F序列为5’AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAA 3’，下游引物IfB R序列为5’CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA 3’。
2.一种用于检测和鉴定四种呼吸道常见病毒的探针序列，四种呼吸道常见病毒包括呼 吸道胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒，探针序列包括下面6个序列(1)一种用于检测和鉴定呼吸道合胞病毒的探针序列，其特征在于所述的探针RSV Probe 序列为 5，CTTCACGAAGGCTCCACATACACAGCWG FAM-BHQ 3，；(2)一种用于检测和鉴定呼腺病毒的探针序列，其特征在于所述的探针AdV Probe序 列为 5’ TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA HEX-BHQ 13，；(3)一种用于检测和鉴定副流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针PIV-IProbe 序列为 5’ TAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAA FAM-TAMRA 3’ ；(4)一种用于检测和鉴定副流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针PIV-2Probe 序列为 5’ CCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAA FAM-TAMRA 3’ ；(5)一种用于检测和鉴定流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针IfA Probe序 列为 5’ TTTGTGTTCACGCTCACCGT FAM-MGB 3’ ；(6)一种用于检测和鉴定流感病毒的探针序列，其特征在于所述的探针IfB Probe序 列为 5，CACCCATATTGGGCAATTTCCTATGGC J0E-TAMRA 3，。
3.6种引物(包括RSV引物、AdV引物、PIV-I引物、PIV-2引物、IfA引物和IfB引物) 和6种探针(包括RSV探针、AdV探针、PIV-I探针、PIV-2探针、IfA探针和IfB探针)可 以混合用来同时进行多种呼吸道病毒的检测和鉴定，主要是呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感 病毒和副流感病毒四种常见呼吸道病毒，而且不会相互影响检测结果。
全文摘要
本发明是涉及多种呼吸道病毒——呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒检测引物和探针。特别地，本发明是一种能同时进行呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒四种病毒检测的引物和探针。本发明的引物和探针分别包括呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒和流感病毒的上游引物、下游引物和探针。
文档编号C12Q1/70GK101812532SQ20091002442
公开日2010年8月25日 申请日期2009年2月24日 优先权日2009年2月24日
发明者李杨霞, 符芳芳, 谢茜 申请人:江苏默乐生物科技有限公司