专利名称：一种淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Δrmp及突变方法
技术领域：
本发明涉及医学微生物学领域，具体涉及一种淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突变方法。
背景技术：
淋病奈瑟菌(Afei^eria卯/^rrAoeae)的天然宿主是人类，感染后导致性传播疾病淋病，可引起一系列病变，包括局部感染(如尿道炎、副睾炎、宫颈炎，输卵管炎等)和全身播散性感染。输卵管、盆腔等部位的病变可导致不孕症或宫外孕等严重后遗症。淋病患者还大大增加了艾滋病的发病机会。淋病发病率高，全球每年新发病例约6200万。越来越严重的淋病奈瑟菌耐药性现象给淋病治疗带来了越来越大的困难。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重点方向之一。淋病奈瑟菌疫苗研制历经艰难，二十世纪七十年代全细胞疫苗的人体试验遭遇失败，研究的重点开始转向亚单位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一个被纯化的淋病奈瑟菌亚单位成分，尽管纯化后的菌毛能够刺激机体产生较高滴度的抗体，但是由于菌毛表面一些表位变异程度高，这些抗体并不具有显著的免疫保护作用。同样由于高度变异的原因，另一类重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持续表达在淋病奈瑟菌表面的I型外膜蛋白，具有免疫原性强、抗原相对保守等特点。90年代初期曾用覆盖多数血清型的porin疫苗进行动物免疫实验，效果并不十分理想。分析其原因，发现从淋病奈瑟菌细胞中提取的porin疫苗中污染了大量Rmp蛋白，后者是很好的免疫原，其免疫原性比porin高，能刺激机体产生补体结合抗体，但这些抗体不但没有抗菌作用，相反能对porin抗体的抗菌活性产生拮抗作用，甚至能增强淋病奈瑟菌的感染性。随着基因工程技术的迅速发展，用基因工程技术表达淋病奈瑟菌抗原成为研制淋病疫苗的重要方向。人们已经成功表达了多种淋病奈瑟菌抗原，如Porin、NspA、TbpA、TbpB,LOS等，用蛋白质相关技术进行纯化和复性，配合一定佐剂免疫小鼠，发现在小鼠体内均可以诱导产生特异性保护抗体。从目前的淋病奈瑟菌疫苗的研究现状分析，用单一一种抗原的淋病奈瑟菌疫苗完全预防淋病奈瑟菌感染是非常困难的。尽管这种疫苗可以产生一定的保护力，但是，如果这种接种只是使淋病奈瑟菌感染转为无症状型，感染者因而不就医，那反而会增加淋病奈瑟菌的传播。因此，含有更多甚至全部淋病奈瑟菌保护性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候选。
发明内容
野生型淋病奈瑟菌中含有免疫阻遏基因r /7，该基因的产物蛋白Rmp可诱导机体产生对抗保护性抗体的有害抗体。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种突变r /7，以及一种淋病奈瑟菌免疫阻遏基因突变方法，从而避免有害抗体产生的有效方法，解决了研制淋病奈瑟菌全细胞疫苗的瓶颈问题。
本发明所述的突变免疫阻遏基因Lrmp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。本发明所述的突变免疫阻遏基因Krmp通过以下方法获得是以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，PCR扩增卿基因，并连接到T载体pMD19中，以连接产物pMD19_r /7为模板，扩增包含^刚基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和r刚基因上游侧翼区的线性DNA片段，与相同酶切处理的卡那霉素抗性基因Kanr连接，得到的突变基因Krmp0本发明所述突变方法，包括步骤如下
(1>刚基因的克隆以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列为引物通过PCR扩增出序列如SEQ ID NO. 3所示的淋病奈瑟菌基因；
(2)r /7上下游两侧侧翼区的扩增以上述(1)中扩增的基因与pMD19-T载体的连接产物pMD19_r /7为模板，扩增包含基因两侧侧翼区的线性片段；扩增包含基因两侧侧翼区线性片段的正反向引物序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID N0. 5所示，扩增得到序列如SEQ ID N0. 6所示的包含基因两侧侧翼区的线性片段；
(3)以质粒pET18a(+)为模板，扩增Kanr基因序列
其中引物序列为SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 8所示，经PCR扩增得到的Kanr基因序列如 SEQ ID N0. 9 所示；
(4)r /7基因的插入突变
将步骤(2)得到的携带基因两侧侧翼区线性片段用ΙΛ/Ι和损ο I双酶切处理；步骤(3)得到的Kanr基因扩增产物用同样的双酶切消化；二者分别回收纯化后用T4连接酶进行连接；连接产物pMD19Ar /7中载体骨架之外即为淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Ar / ，其序列如SEQ ID NO. 10所示。将上述突变基因Lrmp克隆至自杀质粒pGMB151，电转化法将重组自杀质粒转入淋病奈瑟菌细胞。自杀质粒带有的基因可诱导细菌脱去质粒并与野生型发生同源重组，从而得到突变株。目前淋病奈瑟菌疫苗研制中采用单一抗原或2种抗原组合作为疫苗，含有的抗原数量有限，而淋病奈瑟菌是一种含有数千种蛋白的细菌，有限数量抗原做成的疫苗很难刺激机体产生足够的免疫保护。本发明提供的方法，因突变株不能表达淋病奈瑟菌免疫阻遏基因，解除了淋病奈瑟菌诱导机体产生有害抗体的可能性，因而可以制备只刺激机体产生有利抗体的全细胞疫苗，为淋病新型疫苗的研制带来新的突破。
图1是基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析。图2是包含rmp基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和基因上游侧翼区线性DNA片段琼脂糖凝胶电泳分析。图3是包含nnp基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和基因上游侧翼区线性DNA片段的结构示意图。图4.是Kanr基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。图5是淋病奈瑟菌突变株的PCR筛选，其中1为阴性对照；2_3为kmp已经进入细胞但尚未取代正常基因的菌株，可同时扩增出和基因；4为野生菌株，只能扩增出基因；5为突变菌株，只能扩增出kttip基因。
图6是淋病奈瑟菌突变株的Western blotting鉴定，其中1为野生菌株，仍表达Rmp蛋白；2为突变菌株，不表达Rmp蛋白。
具体实施例方式用PCR将淋病奈瑟菌基因组中的扩增出来，将该基因的中间一段用来自pET28a的Kanr抗性基因替换，得到被插入失活的突变基因Δγ /7，后者连接到自杀载体中，携带的重组自杀载体放在大肠杆菌中，大肠杆菌与淋病奈瑟菌共孵育，使自杀载体转化进野生型淋病奈瑟菌菌株中，然后筛选和鉴定同源重组后野生被Δγ /7替换的突变株。实施例一
i-)rmp基因的克隆及其两侧侧翼区的扩增
l、r /7基因的克隆
以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，
以 F 5’CGGGATCCATGACCAAACAGCTGAAATTAAG 3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 1)禾口 R :5，CCCGGATCCTTAGTGTTGGTGATGATTGCGT 3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 2)的序列为引物通过 PCR扩增出淋病奈瑟菌基因组中的了刚基因(图1)，扩增产物经测序，序列如SEQ ID N0.3所示SEQ ID NO. 3中，第沈7-466部分为将被Kanr抗性基因替换(而使插入失活)的部分，两端划线大写字母部分为ife H I识别位点。2. 上下游两侧侧翼区的扩增
将上述基因扩增产物与T载体pMD-19T连接，并以连接产物为模板扩增包含基因两侧侧翼区的一个线性片段，该线性片段的琼脂糖凝胶电泳分析图2，该线性片段的的结构示意图如图3。扩增包含基因两侧侧翼区线性片段的正反向引物分别为
F 5' TGCCTCGAGTAGTGGCAAACAACCTGGTC 3，{Xho I) (SEQ ID NO. 4)R 5' GTCACGCGTTTATCTACTCA ACATATTGAGGAGCCTGC 3，(Mlu I) (SEQ ID NO. 5)，其中TTATCTACTCA为终止序列。扩增得到的包含pMD-19载体和基因两侧侧翼区的线性片段的序列如SEQ IDN0. 6所示(前端为损ο I识别位点；第2584968bp部分为pMD_19骨架；末端为MJu I识别位点；其中7-257bp部分为基因下游侧翼区，2969_32^bp部分为基因上游侧翼区)。(二)以质粒pET_28a⑴为模板扩增Kanr基因序列引物序列为
F 5' TCGACGCGTGCTCAGTGGAACGAAAACTC ？, ‘ (. Mlu I) (SEQ ID N0. 7)R :5’ GCGCTCGAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT 3，(Jho I) (SEQ ID N0. 8)经PCR扩增得到的Kanr基因扩增产物(图4)与pMD_19T连接后，使该载体获得了卡那霉素抗性，表明扩增的DNA片段有活性；产物经测序，序列如SEQ ID N0. 9所示(两端分别为Mlu I和炀ο I识别位点)。(三)基因的插入突变
将SEQ ID NO. 6 基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和基因上游侧翼区的线性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分别用ΙΛ/ I和损ο I双酶切，并回收纯化；二者用Τ4连接酶进行连接，获得的环形DNA片段中即含有^刚基因中间部分被有活性的Kanr基因替换的突变基因Ar / 和ρΜΡ_19载体骨架，命名为pMD19 Ar / ，其中Krmp序列如SEQ ID NO. 10所示。
实施例二
将包含突变基因Lrmp的重组载体pMD19 Lrmp和自杀载体pGMB151 (Χ. X Huang,L. V. Phung, S. Dejsirilert, et al. , "Cloning and characterization of thegene encoding the z66 antigen of Salmonella enterica serovar Typhi,，，FEMSMicrobiology Letters, 2006, 234( 2) : 239 - 246)分别用汉警 H I 酶消化，回收纯化后二者用T4连接酶连接，获得的连接产物通过电转化导入宿主大肠杆菌SPTO72 λ pir,携带重组自杀载体的大肠杆菌与野生型淋病奈瑟菌共孵育。传代过程中大肠杆菌死亡裂解，释放的重组自杀载体进入淋病奈瑟菌，并与淋病奈瑟菌野生型发生同源重组，使野生rmp被突变的krmp取代，同时丢失自杀载体框架。表现为突变菌株具有kana抗性，但丧失了载体上的amp及sm抗性。提取传代后分离的淋病奈瑟菌菌落，提取基因组DNA作模板，觅rmp引物进行PCR，筛选出只扩增出的菌株，即为突变株，(图5)；用Westernblotting鉴定表明该突变株中Rmp蛋白表达缺失(图6)。
权利要求
1.一种淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Ar /7，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
2.一种淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Δ^τ〃/7的突变方法，其特征在于，是以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，PCR扩增卿基因，并连接到T载体pMD19中，以连接产物pMD19r /7为模板，扩增包含r刚基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和r刚基因上游侧翼区的线性DNA片段，与相同酶切处理的卡那霉素抗性基因Kanr连接，得到的突变基因Nrmp。
3.根据权利要求2所述的突变方法，其特征在于，步骤如下(1>刚基因的克隆以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列为引物通过PCR扩增出序列如SEQ ID NO. 3所示的淋病奈瑟菌基因；(2)r /7上下游两侧侧翼区的扩增以上述(1)中扩增的基因与pMD19-T载体的连接产物pMD19_r /7为模板，扩增包含基因两侧侧翼区的线性片段；扩增包含基因两侧侧翼区线性片段的正反向引物序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示，扩增得到序列如SEQ ID NO. 6所示的包含基因两侧侧翼区的线性片段；(3)以质粒pET18a(+)为模板，扩增Kanr基因序列其中引物序列为SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示，经PCR扩增得到的Kanr基因序列如 SEQ ID NO. 9 所示；(4)r /7基因的插入突变将步骤(2)得到的携带基因两侧侧翼区线性片段用i/Ζ I和损ο I双酶切处理；步骤(3)得到的Kanr基因扩增产物用同样的双酶切消化；二者分别回收纯化后用T4连接酶进行连接；连接产物pMD19Ar /7中载体骨架之外即为淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Ar / ，其序列如SEQ ID NO. 10所示。
全文摘要
本发明涉及医学微生物学领域，具体涉及一种淋病奈瑟菌免疫阻遏基因Δrmp及突变方法。所述淋病奈瑟菌免疫阻遏突变基因Δrmp，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。该突变基因通过下述方法和得是以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板，PCR扩增rmp基因，并连接到T载体pMD19中，以连接产物pMD19rmp为模板，扩增包含rmp基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和rmp基因上游侧翼区的线性DNA片段，与相同酶切处理的卡那霉素抗性基因Kanr连接，得到的突变基因Δrmp。
文档编号C12N15/10GK102382844SQ201110293170
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月7日 优先权日2011年10月7日
发明者严华, 季明春, 李国才, 杜庆辉, 汪静, 潘兴元, 焦红梅, 解如山, 钱莉, 陈红菊, 龚卫娟 申请人:扬州大学