表达系统的制作方法

专利名称：表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于重组多肽的微生物表达的表达系统。
背景技术：
从美国专利US6537779知道了基于T7的以完全回文操纵基因序列为基础的蛋白质表达系统。基于T7的系统存在缺点，因为T7系统的操作需要噬菌体聚合酶，它通常是通过将表达所需噬菌体聚合酶的XDE3原噬菌体插入到大肠杆菌宿主株中产生溶原宿主株而提供的。也可通过用特异性λ转导噬菌体进行侵染而将噬菌体聚合酶传递到细胞中，该 特异性λ转导噬菌体携带了噬菌体聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的基因。XDE3原噬菌体缺少了用于切除原噬菌体以形成裂解噬菌体颗粒所需的遗传元件。然而，已经证明XDE3溶原宿主株释放了噬菌体颗粒从而引起了发酵装置中不合需要的侵染。实际上，某些发酵装置操纵基因是不允许使用XDE3菌株的。不希望在诱导之前就表达异源蛋白质，因为ー些异源蛋白质对宿主细胞生长和质粒稳定性具有有害影响，这就降低了总产量。为避免这一点，基于Τ7的表达系统通常在两种水平上控制异源蛋白质表达。首先，驱动从Τ7启动子的表达需要诱导T7RNA聚合酶基因的表达以产生T7RNA聚合酶。第二，Τ7启动子本身也需要被诱导。这就增加了操作基于Τ7的表达系统的复杂性。有着大量的具有不同控制和诱导模式的异源蛋白质表达系统，这使得对感兴趣的蛋白质进行表达系统/发酵过程的选择和优化很大程度上成为了完全根据经验的过程。这是费时间的以及不合需要的。因此，就需要这样的系统，它们能够提供改善的表达控制和改善的蛋白质表达水平，它们不使用噬菌体聚合酶和溶原宿主株。也需要这样的系统，它们能够提供原核细胞以及真核细胞诸如哺乳动物和酵母细胞中的可诱导异源表达。

发明内容
根据本发明，提供了基于完全回文操纵基因序列的蛋白质表达系统，包括a)启动子；以及b)完全回文操纵基因序列；特征在于启动子不是T7。本发明的表达系统中可采用的启动子通常是基于宿主RNA聚合酶的启动子系统，优选基于大肠杆菌RNA聚合酶的启动子系统。可采用的启动子的例子包括T7A1、T7A2、T7A3、λ pL、λ pR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA 和 rrnB。在根据本发明的表达系统中可采用的操纵基因序列包括lac、gal、deo和gin。可采用ー种或多种完全回文操纵基因序列。在许多优选的实施方案中，采用了两种完全回文操纵基因序列，最有利的是ー种操纵基因序列位于启动子的下游，并且一种操纵基因序列位于启动子的上游。当采用两种操纵基因系统时，操纵基因序列优选被间隔开，从而最大程度控制启动子。在许多实施方案中，间隔85到150个碱基对，优选间隔90到126个碱基对，最优选间隔91或92个碱基对。在某些实施方案中，操纵基因序列与转录起始点重叠。将考虑到的是，操纵基因系统通常会采用合适的阻抑物序列。阻抑物序列产生阻抑蛋白，例如当使用Iac操纵基因时的IacI基因序列。也可使用其它Iac阻抑物序列，例如IacIe序列可用来増加Iac阻抑蛋白的水平。也可由宿主细胞基因组提供阻抑物序列或者通过使用另外的相容性质粒来提供。可将表达系统整合到宿主细胞基因组中，但是优选将其包含在染色体外元件诸如质粒之中。备选地，可将表达系统掺入到噬菌体或病毒载体中，使用这些载体将表达系统传递到宿主细胞系统中。可通过现有技术中的已知方法装配质粒或表达载体。典型地，质粒也包括如下之一或更多选择标记，例如赋予抗生素抗性的序列，cer稳定性序列和表达盒。如果需要所期望的蛋白质分泌，表达系统也可掺入信号序列。 表达的诱导可通过加入诱导物诸如异丙基-β -D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)，IPTG类似物诸如异丁基-C-吡喃半乳糖苷(IBCG)，乳糖或者蜜ニ糖。可以使用其它诱导物，在其它地方更充分地描述了所述其它诱导物(例如參见《操纵基因》(The Operon)，Miller和Renznikoff编辑(1978))。诱导物可単独使用或者组合使用。合适质粒或表达载体的构建对于普通技术的科学家来说将是显而易见的。可采用本发明的表达系统在宿主细胞特别是微生物中表达蛋白。如本文使用的，“蛋白质”一般是指具有超过大约10个氨基酸的肽或蛋白质。宿主细胞可以是原核的或真核的。原核细胞的例子包括细菌细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、铜绿假单胞菌以及革兰氏阳性细菌，包括枯草芽孢杆菌。真核细胞的例子包括酵母，诸如巴斯德毕赤酵母、啤酒糖酵母、多形汉逊酵母、乳克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母。可采用的哺乳动物宿主细胞包括人类细胞系，诸如人胚肾和PERC. 6细胞；鼠细胞系，诸如NSO细胞；以及特别是仓鼠细胞系，诸如幼仓鼠肾细胞和特别是中国仓鼠卵巢细胞。也可以采用其它真核宿主细胞，诸如丝状真菌、植物、昆虫、两栖动物细胞或卵巢物质。优选的宿主细胞是细菌，特别是肠细菌科，优选大肠杆菌，特别是其B或K12株。本发明的表达载体通常采用质粒形式，包括启动子和完全回文操纵基因序列的质粒形成了本发明的另一方面，其中启动子不是17。质粒可以是自主复制质粒或者整合型质粒。对于通过培养重组细胞生产蛋白质特别是重组蛋白质来说，采用本发明的表达系统是有利的。对于蛋白质的表达来说，将考虑到的是将启动子和操纵基因序列可操作地连接到编码待表达蛋白质的DNA上。
因此，本发明也提供了生产蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括a)启动子；b)完全回文操纵基因序列；以及c)蛋白质的表达盒；其特征在于启动子不是T7。
如果需要的话，也可以存在一种或多种启动子、操纵基因序列和表达盒，它们可以是相同的或不同的。通过现有技术中公知的用于所采用细胞的方法来使表达系统表达。优选的表达方法包括在生长培养基中培养重组细胞，特别是通过发酵，然后回收所表达的蛋白质。术语“生长培养基”是指用于生长重组细胞的营养培养基。在许多实施方案中，采用营养液。用于特定重组细胞的合适的生长培养基是现有技术中公知的。



图I显示蛋白Dl. 3的基因序列。图2显示实施例7的hTNF α蛋白积累結果。㈩=基础表达，未入诱导物(IPTG)；(**)=% TCP，％细胞总蛋白质。图3显示实施例9的菌株CLD038的蛋白质印迹分析。箭头指示hTNF α带。泳道6 CLD038 2小时温育(诱导前)泳道5 CLD038 4小时温育(诱导前)泳道4 CLD038 =IPTG诱导后I小时泳道3 CLD038 =IPTG诱导后2小时泳道2 CLD038 =IPTG诱导后3小时泳道I :CLD038 =IPTG诱导后4小时泳道7 :分子量标准參照物图4显示实施例11的菌株CLD030的hTNF α生产率分布图。图5显示实施例15使用的Dl. 3-Α5Β7双特异性单链四价双抗体(bsctDb)基因序列(SEQID NO 22)。图6显示实施例16使用的谷胱甘肽-S-转移酶-3C蛋白酶融合基因序列(SEQ IDNO 23)。图7显示实施例16使用的人干扰素α 2 (IFN α 2)基因序列(SEQ IDNO 24)。图8显示实施例16使用的人促红细胞生成素(EPO)基因序列(SEQID NO 25)。图9显示实施例17使用的L-2-卤代链烷酸脱卤素酶(hadL)基因序列(SEQ IDNO 26)。图10显示实施例17的L-2-卤代链烷酸脱卤素酶蛋白质的表达和累积。箭头指示HadL蛋白质的位置。泳道I :分子量标准參照物泳道2 :瓶1-CLD075诱导前泳道3 :瓶2-CLC075诱导前泳道4 :瓶1-CLD075，6小时培养物，O. 5mM IPTG诱导后3小时泳道5 :瓶2-CLD075，6小时培养物，未诱导泳道6 :瓶1-CLD075，23小时培养物，O. 5mM IPTG诱导后20小时泳道7 :瓶2-CLD075, 23小时培养物，未诱导泳道8:分子量标志物
图11显示实施例18的诱导后，L-2-卤代链烷酸脱卤素酶蛋白质的表达/累积。图12显示实施例21使用的HCMV启动子和双重的完全回文Iac操纵基因的DNA序列(SEQ ID NO 33)。图13显示实施例21使用的IgG Fe序列(SEQ ID NO 34)。图14显示实施例21的IgG Fe蛋白累积水平。对于诱导的和未诱导的两者都是η = 4。提供的数据为带有代表I个标准差的误差棒的平均值。图15显示实施例20使用的克隆序列I的序列(SEQ ID NO 35)。图16显示实施例20使用的克隆序列2的序列(SEQ ID NO 36)。图17显示实施例9的hTNF α的累积水平。 泳道I :CLD077诱导后20小时泳道2 CLD077诱导后3小时泳道3 CLD077诱导前泳道4:分子量标志物图18显示载体pAVE013的质粒图。
具体实施例方式通过下面的实施例但并不限制地说明本发明。I. pAVE系列载体的产牛载体pAVEO 11、pAVEO 12 和 pAVEO 13产生pAVEO 11的起始载体是pZT7#2. 0，根据US 6537779的描述进行制备。ρΖΤ7#2.0具有ρΑΤ153载体骨架、cer稳定性序列、tet A/R、感兴趣基因上游的单一天然Iac操纵基因序列以及上游T4转录终止子。使用合成的寡核苷酸接头通过Nco UEcoR I和Xba I限制酶位点将T7A3启动子和双完全回文Iac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸I和2. I，制备接头12.1:寡核苷酸I (SEQ ID NO I)5' CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG寡核苷酸2. KSEQ ID NO 2)5' AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA然后将接头作为Nco 1/EcoR I片段连接到质粒pZT7#2. O中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过使用Nco I限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE012。然后通过退火寡核苷酸3和4，将Τ7Α3启动子盒克隆到pAVE012中寡核苷酸3 (SEQ ID NO 3)5' AATTCAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4 (SEQ ID NO 4)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过质粒DNA的限制酶切消化进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVEO11。将人TNFa基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE013。PAVE013的质粒图谱示于图18中。这显示了操纵基因和启动子以及构建中使用的限制酶位点的排列。两个操纵基因都是完全回文Iac操纵基因。RBS是核糖体识别位点。载体包括pAT153载体骨架、cer稳定性序列、诱导型四环素抗性基因(tet A/R)以及上游T4转录终止子。载体pAVEO38 和 pAVE041产生pAVE038的起始载体是pZT7#2. 0，根据US 6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制酶位点将tac启动子和单ー天然Iac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸11和12，制备接头1112 :
寡核苷酸11 (SEQ ID NO 5)5' A ATTTTCTGA A ATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGATACTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCA寡核苷酸I2 (SEQ ID NO 6)5 ' CTAGTGGGGAAT TGT TAT CCGCT CACAAT T CCACACAGT AT CCGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后将接头作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pZT7#2. O中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过使用Nco I限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE038。将人TNF α基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生质粒pAVE041。
载体 pAVE037 和 pAVE040产生pAVE037的起始载体是pZT7#2. 0，根据US 6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制酶位点将tac启动子和単一完全回文Iac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸13和14，制备接头1314 寡核苷酸I3 (SEQ ID NO 7)5 ' AATTT TCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGAT ACTGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸14 (SEQ ID NO 8)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAGT AT CCGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA然后将接头作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pZT7#2. O中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过使用Nco I限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE037。将人TNF α基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE040。载体pAVE028 和 pAVE030产生pAVE028的起始载体是pAVE012。通过退火寡核苷酸5和6，将T7A3启动子盒克隆到PAVE012中
寡核苷酸5 (SEQ ID N09)5' AATTCGAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸6 (SEQ ID NO 10)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGT GTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTCG将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE028。
将人TNF α基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE030。载体pAVE007 和 pAVE031产生pAVE007的起始载体是pZT7#2. 0，根据US 6537779的描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制酶位点将Τ7Α3启动子和単一完全回文Iac操纵基因克隆到该质粒中。含有Τ7Α3启动子的接头由寡核苷酸3和4组成。寡核苷酸3 (SEQ ID NO 3)5' AATTCAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸4 (SEQ ID NO 4)5' CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGTGTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG退火寡核苷酸3和4，然后将形成的接头作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pZT7#2. O中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初歩筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE007。将人TNFa基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE031。载体pAVE029 和 pAVE027产生pAVE029的起始载体是pZT7#2. 0，根据US 6537779的充分描述进行制备。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制酶位点将λ PL启动子和単一完全回文Iac操纵基因克隆到该质粒中。通过退火寡核苷酸7和8，制备接头78 :寡核苷酸7 (SEQ ID NO 11)5' AATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸8 (SEQ ID NO 12)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCGCT CAGTAT CACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT然后将接头作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pZT7#2. O中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过使用Nco I限制酶切消化初步筛选转化体。通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE029。
将人TNF α基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE027。载体pAVE043 和 pAVE044产生pAVE043的起始载体是pAVE012。通过退火寡核苷酸17和18，将tac启动子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸17 (SEQ ID NO 37)5 ' AATTTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATT AATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸18 (SEQ ID NO 38)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAT T AT ACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE043。将人TNFa基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE044。载体pAVE034 和 pAVE035产生pAVE034的起始载体是pAVE012。通过退火寡核苷酸9和10，将ApL启动子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸9 (SEQ ID NO 39)5 ' AAT TCATCT CTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGAT ACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸10 (SEQ ID NO 40)5' CTAGTGGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATG将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE034。将人TNF α基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE035。载体VE020 和 AVE021产生pAVE020的起始载体是pAVE012。通过退火寡核苷酸7和8，将λ pL启动子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸7 (SEQ ID NO 11)5' AATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸8 (SEQ ID NO 12)5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCGCT CAGTAT CACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGAT将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE020。
将人TNFa基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE021。载体pAVE016 和 pAVE017产生pAVE016的起始载体是pAVE012。通过退火寡核苷酸15和16，将tac启动子盒克隆到PAVE012中寡核苷酸15 (SEQ ID NO 13)5 ' AATTCCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA寡核苷酸16 (SEQ ID NO 14)
5 ' CTAGTGGGGAAT TGTGAGCGCT CACAAT T CCACACAT T AT ACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGG将退火的寡核苷酸作为Xba 1/EcoR I片段连接到质粒pAVE012中，转化到克隆宿主株XL-IBlue MR(Stratagene)中。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为pAVEO 16。将人TNFa基因作为Nde I/Xho I片段克隆到该质粒中以产生pAVE017。载体pAVE049产生pAVE049的起始载体是pAVE017。不改变tac启动子盒。为增加两个操纵基因之间91到124个碱基对的间隔，克隆进了 EcoR I接头。这是由寡核苷酸19和20组成的。寡核苷酸19(SEQ ID NO 15)5' AATTCACCGGTGTACAGTCATGTACAACCGGTG寡核苷酸20 (SEQ ID NO 16)5' AATTCACCGGTTGTACATGACTGTACACCGGTG通过限制酶切消化质粒DNA进行初歩筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE049。载体PAVE046产生分泌载体pAVE046的起始载体是pAVE027。将A Dl. 3Fab表达盒(图1，SEQID NO 17)作为Nde I-BamH I片段进行克隆。通过限制酶切消化质粒DNA进行初步筛选。然后通过测序确认序列。将所得质粒命名为PAVE046。表I :pAVE载体汇总
权利要求
1.蛋白质表达系统，包括a)选自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的启动子；和 b)至少ー种完全回文操纵基因序列 其中所述完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
2.载体,包括a)选自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的启动子；和 b)完全回文操纵基因序列，其中所述完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
3.权利要求2的载体，进ー步包括蛋白质的表达盒。
4.权利要求2或3的载体，其中所述载体是质粒，优选自主复制质粒。
5.由权利要求2-4任一项的载体所转化的宿主细胞。
6.生产重组蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括a)选自Τ7Α1、Τ7Α2、Τ7Α3、λ pL、λ pR、lacUV5、trp、trc、phoA 和 rrnB 的启动子; b)完全回文操纵基因序列；和 c)重组蛋白质的表达盒； 其中所述完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
7.权利要求1-6的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述操纵基因系统是 lac、gal、deo 或 gin。
8.权利要求1-7的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中采用了单个完全回文操纵基因序列，其优选位于启动子的下游。
9.权利要求1-8的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述启动子是ApL或 T7A3。
10.权利要求1-9的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述操纵基因具有序列 GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (SEQ IDN0. 3 的核碱基 51-74)。
11.生产蛋白质的方法，其包括 a)培养用权利要求3的载体转化过的宿主细胞；以及 b)回收蛋白质。
12.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
13.权利要求11或12的方法，其中所述载体是如权利要求4或7-10任一项的载体。
14.权利要求11-13的任ー项的方法，其中所述启动子是ApL或T7A3。
15.权利要求11-14的任ー项的方法，其中所述操纵基因与转录起始点重叠。
16.蛋白质表达系统，包括用载体转化的大肠杆菌宿主细胞，所述载体包括 a)启动子；和 b)完全回文操纵基因序列 其特征在于所述启动子不是T7，并且完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
17.大肠杆菌载体，其包括 a)启动子；和 b)完全回文操纵基因序列 其特征在于所述启动子不是T7，并且完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
18.权利要求17的载体,进ー步包括蛋白质的表达盒。
19.权利要求17或18的载体,其中所述载体是质粒,优选自主复制质粒。
20.由权利要求17-19任一项的载体所转化的大肠杆菌宿主细胞。
21.生产重组蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括 a)启动子； b)完全回文操纵基因序列；和 c)重组蛋白质的表达盒 其特征在于所述启动子不是T7，并且完全回文操纵基因序列与转录起始点重叠。
22.权利要求16-21的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述操纵基因糸统是 lac、gal、deo 或 gin。
23.权利要求16-22的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中米用了位于启动子下游的单个完全回文操纵基因序列。
24.权利要求16-23的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述启动子是T7A1、T7A2、T7A3、λ pL、λ pR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA 和 rrnB。
25.权利要求16-24的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述与转录起始点重叠的操纵基因具有序列GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC (SEQ ID NO. 3的核碱基51-74)。
26.权利要求25的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述启动子是XPL、tac或T7A3。
27.生产蛋白质的方法，其包括 a)培养用权利要求18的载体转化过的宿主细胞；以及 b)回收蛋白质。
28.权利要求27的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
29.权利要求27或28的方法，其中所述载体是如权利要求19或22-26的任一项的载体。
30.权利要求27-29的任ー项的方法，其中所述启动子是ApL、tac_T7A3。
31.基于完全回文操纵基因序列的蛋白表达系统，其包括 a)酵母启动子；和 b)完全回文操纵基因序列。
32.载体，其包括 a)酵母启动子；和 b)完全回文操纵基因序列。
33.权利要求32的载体，进ー步包含蛋白质的表达盒。
34.权利要求32或33的载体，其中所述载体是自主复制的质粒。
35.权利要求32或33的载体，其中所述载体是整合型质粒。
36.由权利要求32到35任一项的载体所转化的酵母宿主细胞。
37.权利要求36的宿主细胞，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母、啤酒糖酵母、多形汉逊酵母、乳克鲁维酵母或粟酒裂殖酵母。
38.生产蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括 a)酵母启动子；和 b)完全回文操纵基因序列；和c)蛋白质的表达盒。
39.权利要求38的生产重组蛋白质的方法，其包括使表达系统表达，该表达系统包括
40.权利要求32-40的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述操纵基因序列是 lac、gal、deo 或 gin。
41.权利要求31-40的任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中米用了两种完全回文操纵基因序列，优选ー种操纵基因序列位于启动子的下游，并且一种操纵基因序列位于启动子的上游。
42.权利要求41的表达系统、载体、宿主细胞或方法，其中所述操纵基因序列间隔85到150个碱基对，优选间隔91或92个碱基对。
43.生产蛋白质的方法，其包括 a)培养用权利要求33的载体转化过的酵母；以及 b)回收蛋白质。
44.权利要求43的方法，所述酵母是巴斯德毕赤酵母、啤酒糖酵母、多形汉逊酵母、乳克鲁维酵母或粟酒裂殖酵母。
45.权利要求43或44的方法，其中所述载体是权利要求33和40-42的任ー项中的载体。
46.生产蛋白质的方法，其包括在哺乳动物细胞培养物中使表达系统表达，该表达系统包括 a)哺乳动物启动子；和 b)两种或更多种完全回文操纵基因序列，至少ー种操纵基因序列位于启动子的下游，并且至少ー种操纵基因序列位于启动子的上游；和 c)重组蛋白质的表达盒。
47.权利要求46的方法，其包括 a)制备包含以下成分的表达盒哺乳动物启动子；两种或更多种完全回文操纵基因序列，至少ー种操纵基因序列位于启动子的下游，并且至少ー种操纵基因序列位于启动子的上游；和蛋白质的表达盒； b)将表达系统送递到哺乳动物宿主细胞中； c)在哺乳动物宿主细胞的细胞培养物中使所述表达系统表达。
48.权利要求46或47的方法,其中所述操纵基因序列选自lac、gal、deo或gin。
49.权利要求46-48的任ー项的方法，其中所述操纵基因序列间隔85到150个碱基对，优选间隔91或92个碱基对。
50.权利要求46-49的任ー项的方法，其中所述表达系统整合到宿主细胞基因组中。
51.权利要求46-50的任ー项的方法，其中所述表达系统是染色体外的。
52.权利要求46-51的任ー项的方法，其中所述哺乳动物细胞是人、鼠或仓鼠细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
54.权利要求46-53的任ー项的方法，其包括另外的回收蛋白质的步骤。
55.权利要求46-54的任ー项的方法，其中所述启动子是hCMV启动子。
56.载体，其包括 a)哺乳动物启动子；和b)两种或更多种完全回文操纵基因序列，至少ー种操纵基因序列位于启动子的下游，并且至少ー种操纵基因序列位于启动子的上游；和 c)重组蛋白质的表达盒。
57.权利要求56的载体，其中所述载体是非整合型质粒。
58.权利要求56或57的载体,其中所述操纵基因序列选自lac、gal、deo或gin。
59.权利要求56-58的任一项的载体，其中所述启动子是hCMV启动子。
60.哺乳动物细胞，优选中国仓鼠卵巢细胞，其包含权利要求56-59的任一项的载体。
全文摘要
本发明涉及表达系统。具体地，提供了基于完全回文操纵基因序列的蛋白质表达系统。表达系统包括启动子；以及完全回文操纵基因序列，其中启动子不是T7。优选采用表达系统来通过发酵生产重组蛋白质。
文档编号C12N15/63GK102690834SQ20121005681
公开日2012年9月26日 申请日期2007年2月1日 优先权日2006年2月3日
发明者B·V·卡拉, C·D·J·伦农, I·J·霍奇森 申请人:富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司