一种保藏酵母菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种保藏酵母菌的方法，属于酵母菌的保藏技术领域。
【背景技术】
[0002] 酵母为单细胞真菌，是子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。酵母无害，容易 生长，可将大分子物质分解成细胞新陈代谢易于利用的小分子物质，属于异养生物。酵母菌 是人类文明史中被应用得最早的微生物，其既可用于酿造生产，又是遗传工程和细胞周期 研宄的模式生物，受到广大科研工作者的青睐。
[0003] 酿酒酵母在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵 母宿主，毕赤酵母作为宿主的外源基因表达系统近年来发展迅速，应用也最为广泛，此外， 汉逊酵母中较高的目的蛋白表达量使得其也日益应用于大规模生产中。随着大量新型酵 母工程菌株的构建，酵母工程菌的培养与保存成为了影响其蛋白表达的重要因素：菌种保 存方法得当，复苏后酵母生长状态良好，目的蛋白表达量高，产量大大提高。传统的酵母菌 保藏方法主要有两种，一，酵母菌保存于含有一定比例甘油的培养基中，于低温或液氮中保 存；二，将酵母中加入脱脂奶粉等保护剂，进行冻干保存。传统的方法，可以使得酵母成功地 复苏培养，逐级放大生产，实现目的蛋白的表达与收获。然而，传统的保藏方式会造成酵母 菌的大量死亡，尤其随着保存时间的增加，酵母的活菌率呈现明显的下降趋势，影响了复苏 后的酵母扩大培养。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种提高酵母菌复苏时活菌率的保藏酵母菌的方法、利用 该方法保藏的酵母工程菌的目的蛋白表达量也能够获得显著提高。
[0005] 本发明提供的一种保藏酵母菌的方法，是在酵母菌液中加入甘油和琼脂，混匀后 迅速置于液氮中冷冻，之后于-20°c以下长期保藏。
[0006] 其中，酵母菌液中甘油的终浓度为12% -18%，琼脂的终浓度为0. 02% -0. 1%，所 述％为质量百分比。
[0007] 优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为14 % -16 %，琼脂的终浓度为 0. 03% -0. 07%，所述％为质量百分比。
[0008] 更优选地，酵母菌液中甘油的终浓度为15%，琼脂的终浓度为0.05%，所述％为 质量百分比。
[0009] 本领域技术人员应当理解，本发明提供的上述方法可以针对任何浓度的酵母菌液 进行冷冻保藏，为了节省成本、提高酵母菌保藏效率，优选地酵母菌液中酵母菌的〇D_为 13-22,再优选地，为15-17,更优选地为19-21。
[0010] 本发明所述酵母菌为酵母工程菌或天然酵母菌，例如酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵 母等。
[0011] 在本发明的一个实施例中，记载了保藏酵母菌的具体方法为：
[0012] (1)将通过鉴定的酿酒酵母、毕赤酵母及汉逊酵母工程菌株划线接种到Yro琼 脂固体培养基上，30-37°C培养24-72小时后，挑取单菌落，接种于YH)液体培养基中， 30-37°C，振动培养18-36小时；经分光光度法测定，酵母菌的OD_值为15. 4-16. 2 ;
[0013] (2)将培养的菌液按照1% -10%的接种量转接至新的YH)液体培养基中，30_37°C 继续振动培养18-36小时；经分光光度法测定，酵母菌的OD_值为19. 3-20. 2 ;
[0014] (3)收获不同类型的酵母菌液，加入甘油至终浓度为15%，加入琼脂至终浓度为 0. 05%，混匀后迅速置于液氮中冷冻，后放于-20°C以下长期保存。
[0015] 本发明提供一种酵母菌保藏液，其含有甘油和琼脂。
[0016] 进一步地，该酵母菌保藏液中，甘油的终浓度为12% -18%，琼脂的终浓度为 0. 02% -0. 1%，所述％为质量百分比。
[0017] 优选地，该酵母菌保藏液中，甘油的终浓度为14% -16%，琼脂的终浓度为 0. 03% -0. 07%，所述％为质量百分比。
[0018] 更优选地，该酵母菌保藏液中，甘油的终浓度为15 %，琼脂的终浓度为0. 05 %，所 述％为质量百分比。
[0019] 本发明提供了上述酵母保藏液在冷冻保藏酵母菌中的应用。
[0020] 本发明提供了琼脂在保藏酵母菌中的应用，具体为酵母菌液中琼脂的终浓度为 0.02% -0. 1%，优选0.03% -0.07% ;所述％为质量百分比。
[0021] 本发明提供的琼脂在保藏酵母菌中的应用，更优选为酵母菌液中琼脂的终浓度为 0. 05%，所述％为质量百分比。
[0022] 本发明的保藏酵母菌的方法具有以下优点及有益效果：
[0023] (1)操作简便，成本低。
[0024] (2)通过在保藏体系中加入低浓度的液态琼脂和甘油，使二者共同形成保护体系， 减少冻融过程中温度变化对细菌的伤害，改善了酵母菌的生长状态，大大提高酵母菌在不 同保存温度下的存活率以及酵母菌复苏时的活菌率。
[0025] (3)由于酵母菌的存活率大大提高，因此，利用基因工程酵母表达的蛋白量大大增 加，提高了目标产品的产量。
[0026] (4)本发明方法适用范围较广，在不同程度的低温条件下均可实现对酵母菌种的 保护，且保藏期长。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 实施例中所用的试剂为市售商品。实施例中所用的酿酒酵母、毕赤酵母及汉逊酵母工程菌 株均为北京科兴生物制品有限公司根据常规分子生物学方法构建得到的含有目的基因的 酵母工程菌株。
[0029] 实施例1保藏酵母菌的方法
[0030] 1、将通过鉴定的酿酒酵母、毕赤酵母及汉逊酵母工程菌株划线接种到Yro琼脂固 体培养基上，33 °C培养48小时后，挑取单菌落，接种于ΥΗ)液体培养基中，33 °C，振动培养24 小时，分光光度法测定酵母菌的密度：
[0031] 表 1
[0032]
[0033] 2、步骤1培养的菌液5ml转接至新的YH)液体培养基95ml中（接种体积比例 5% )，于33°C下继续振动培养24小时，分光光度法测定酵母菌的密度：
[0034] 表 2
[0035]
[0036] 3、取步骤2获得的酿酒酵母、毕赤酵母及汉逊酵母工程菌液各Iml X 2份（三种酵 母菌共6份），分别加入灭菌甘油至终浓度为15% (质量百分比），加入灭菌琼脂至终浓度 为0. 05% (质量百分比），混匀后迅速置于液氮中冷冻，后分别置于-20°C及_70°C中保存。 与此同时，取酿酒酵母、毕赤酵母及汉逊酵母工程菌液各lmlX2份，按照传统的菌种保藏 方法，分别加入灭菌甘油至终浓度为15%，后分别置于-20°C及_70°C中保存。
[0037] 实施例2不同保藏时间活菌率比较
[0038] 实施例1中的各酵母菌保存3个月、6个月、9个月、12个月后，取出，检测其活菌率 (%)，结果如下：
[0039] 表3 3个月活菌率检测率（％ )
[0040]
[0041] 表4 6个月活菌率检测率（％ )
[0042]
[0043] 表5 9个月活菌率检测率（％ )
[0044]
[0045] 表6 12个月活菌率检测率（％ )
[0046]
[0047] 上述结果表明，在加入低浓度的液态琼脂后，酵母菌种在-20°C和-70°C温度下、 不同保藏时间的存活率都较不加琼脂的存活率有显著提高。
[0048] 实施例3本发明保藏酵母菌的方法对酵母菌蛋白表达量的影响
[0049] 在酿酒酵母，毕赤酵母及汉逊酵母菌种的不同保存时间，分别取不加琼脂（传统 方法）及加入琼脂（本发明实施例1的方法）的菌种，按照实施例1的方法培养，在培养 24小时后，均加入相同剂量的甲醇进行诱导，表达目的抗原。诱导表达72小时后，通过采 用ELISA的方法，分别测定酿酒酵母，毕赤酵母及汉逊酵母的抗原表达量，并计算其抗原表 达率（％)，见表7。表中的"不加"指传统方法仅添加甘油至终浓度为15%于液氮中保藏 酵母菌，"加入"指本发明实施例1的方法保藏的酵母菌。
[0050] 表7本发明保藏方法的不同酵母菌其蛋白表达率（％ )
[0051]
[0052] 上述结果表明，加入液体琼脂之后，目的抗原的表达率增加，由此可见，该方法的 应用可提高目的蛋白的表达率，增加目的抗原的产量。
[0053] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种保藏酵母菌的方法，其特征在于，在酵母菌液中加入甘油和琼脂，混匀后迅速置 于液氮中冷冻，之后于-20°C以下长期保藏。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的终浓度为12% -18%， 琼脂的终浓度为0.02% -0. 1%，所述％为质量百分比。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的终浓度为14% -16%， 琼脂的终浓度为0. 03% -0. 07 %，所述％为质量百分比。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的终浓度为15%，琼脂的 终浓度为〇. 05 %，所述％为质量百分比。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中酵母菌的OD_为13-22。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌为酵母工程菌或天然酵母菌。7. -种酵母菌保藏液，其特征在于，含有甘油和琼脂。8. 权利要求7所述的酵母保藏液在冷冻保藏酵母菌中的应用。9. 琼脂在保藏酵母菌中的应用，其特征在于，酵母菌液中琼脂的终浓度为 0. 02% -0. 1%，所述％为质量百分比。10. 琼脂在保藏酵母菌中的应用，其特征在于，酵母菌液中琼脂的终浓度为0. 05%，所 述％为质量百分比。
【专利摘要】本发明提供了一种保藏酵母菌的方法，属于菌种保藏技术领域。本发明通过在酵母菌液中添加甘油和琼脂，迅速于液氮中冷冻，之后于-20℃以下可长期保藏。本发明的保藏方法可大大提高酵母菌复苏时的活菌率，并改善了酵母菌的生长状态，提高了目的蛋白的表达率，增加了目的产品的产量。本发明方法可应用于基因工程领域保藏能够表达外源基因的酵母宿主，也可应用于普通酵母菌的保藏，大大提高生产效率，节约生产成本，具有较好的市场应用前景和经济价值。
【IPC分类】C12R1/78, C12R1/84, C12R1/865, C12N1/04
【公开号】CN104928182
【申请号】CN201510295396
【发明人】张星星, 董高峰, 高强, 尹卫东
【申请人】北京科兴中维生物技术有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月2日