专利名称：一种甲烷氧化菌的保藏方法
技术领域：
本发明涉及微生物的保藏方法，特别是涉及一种可以有效防止杂菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。
背景技术：
甲烷氧化菌是自然界中一类非常特殊的微生物，它以甲烷为唯一的碳源及能源。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以广泛地应用于以甲烷为原料的化工产品(天然气或沼气等)的大规模工业化生产中，也可以应用于环境中有机污染物的治理，甚至可以用来有效地预防煤矿中的瓦斯气体爆炸。目前，该菌种没有特殊的保存方法，一般只是像其它微生物一样加入甘油后于-70℃冷冻保存。因为甘油在后续的操作中被很难完全除去，而甲烷氧化菌的生长速度又远远慢于其它杂菌，因此，杂菌就利用其中的甘油作为碳源大量生长，引起杂菌污染。另一种保藏方法是将甲烷氧化菌菌种保存于含有甲烷的平板培养基上，培养起来后再接种到另一平板上，如此不停。该方法虽然可以避免杂菌污染且能使甲烷氧化保持较高的活性，但费时费力，实施起来很不方便。
因此迫切需要一种简便，且可以有效防止杂菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，且可以有效防止杂菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。
本发明所提供的甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌体，将其与经灭菌的石蜡油混匀后，在-4℃～-90℃下保存。
在上述保藏方法中，所述甲烷氧化菌与石蜡油混合物的OD600值为0.3-1.5。
所述石蜡油的灭菌条件可为在121℃下加热15-25分钟。
可用于保存甲烷氧化菌的容器是多种多样的，任何经灭菌且耐低温的容器均可，如容积为200微升～500毫升的塑料容器，优选为500微升～1.5毫升的塑料离心管。
上述保藏方法对经液体培养和固体培养的甲烷氧化菌同时适用。
需要使用时，只需将保藏的菌体连同石蜡油一同倒入培养基中培养即可，因为石蜡油除可用于甲烷氧化菌的菌种保藏外，还具有促进该菌生长的作用。
本发明提供了一种甲烷氧化菌的保藏方法。该方法是用石蜡油代替甘油进行菌种保藏的方法。由于石蜡油不能被大多数杂菌作为碳源利用，因此该方法可以大大地降低杂菌的污染机会；此外，使用时只需将菌体及石蜡油的混合物直接添加入培养基中进行培养即可，方便、快速。本发明将在甲烷氧化菌的保藏及其工业化生产中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
NMS培养基配方每升培养基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素贮存液2mL，lmmol/L H2SO40.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固体培养基再添加1.5％的琼脂)，pH 7.0。
微量元素贮存液的配方为每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
实施例1、甲烷氧化菌的液体培养一、甲烷氧化菌单菌落的获得用灭菌的接种环挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用划线的方法将其接种于NMS平板固体培养基表面，每天用注射器通过0.2μ的过滤器向培养皿中加入5-10毫升的甲烷气体，在30℃下培养四周后，平板上有明显的菌落产生。
二、甲烷氧化菌的液体培养1)取50毫升的培养瓶，装入NMS液体培养基10毫升，在121℃下灭菌20分钟；2)挑取一个步骤一在平板上长出的甲烷氧化菌单菌落，将其接种到NMS液体培养基中，每天用注射器通过0.2μ的过滤器加入5-20毫升的甲烷气体，在30℃、150rpm下振荡培养四周，培养基的OD600值约为0.1-1.0后，即可用于保存。
实施例2、甲烷氧化菌在石蜡油中的保存将实施例1培养的甲烷氧化菌菌液1.5毫升倒入经灭菌的1.5毫升离心管中，8000rpm离心10分钟后，弃去上清，在超净台中或用无菌操作的方法将收集的菌体加入经灭菌(121℃下加热20分钟)的500微升石蜡油中，在旋涡振荡器上振荡，使菌体在石蜡油中分散均匀，然后放入-20℃冰箱中保存。
实施例3、石蜡油保藏的甲烷氧化菌的使用取50毫升培养瓶，装入NMS液体培养基10毫升，在121℃下灭菌20分钟后，从冰箱中取一管用石蜡油保存90天的甲烷氧化菌，在超净台中将解冻的菌液全部倒入到NMS液体培养基中，每天用注射器通过0.2μ的过滤器加入5-20毫升的甲烷气体，在30℃、150rpm下振荡培养三天后，培养基呈现混浊状，其OD600值约为0.1-0.3，甲烷氧化菌培养成功，表明用本发明方法对甲烷氧化菌进行保藏，可使菌体长期维持较高的生物活性。
权利要求
1.一种甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌体，将其与经灭菌的石蜡油混匀后，在-4℃～-90℃下保存。
2.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述甲烷氧化菌与石蜡油混合物的OD600值为0.3-1.5。
3.根据权利要求1或2所述的保藏方法，其特征在于所述石蜡油的灭菌条件为在121℃下加热15-25分钟。
全文摘要
本发明公开了一种甲烷氧化菌的保藏方法。该方法是收集甲烷氧化菌菌体，将其与经灭菌的石蜡油混匀后，在－4℃～－90℃下保存。由于石蜡油不能被大多数杂菌作为碳源利用，因此该方法可以大大地降低杂菌的污染机会；此外，使用时只需将菌体及石蜡油的混合物直接添加入培养基中进行培养即可。本发明将在甲烷氧化菌的保藏及其工业化生产中发挥重要作用。
文档编号C12N1/26GK1844368SQ200610074530
公开日2006年10月11日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者缑仲轩, 邢新会, 赵洪新, 吴昊, 韩冰, 江皓, 王磊 申请人:清华大学