专利名称：一株降解金霉素的小刺青霉lj220的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能够降解金霉素的小刺青霉(Penicillium spinulosum)LJ220,属于微生物技术领域。
背景技术：
金霉素可以预防多种动物疾病，被广泛应用于兽医临床和畜牧业养殖中。金霉素在发酵生产过程中会产生大量菌渣和废水，若处理不完善，大量金霉素进入环境，会对生态环境和诸多生物产生毒性和抑制作用，同时还可能诱导出耐药性菌及耐药基因，对人类健康造成潜在危害。因此，金霉素废弃物的脱毒处理已成为金霉素废弃物残留污染和生产企业可持续发展中亟待解决的重大问题。与此同时，金霉素菌渣中富含蛋白质、矿物质等多种营养成分，资源化利用潜力巨大。筛选并利用高效降解金霉素的微生物菌株，对菌渣进行ニ 次发酵，降解菌渣中的金霉素残留，不仅可以减少金霉素对环境的危害，而且又为菌渣的资源化利用和变废为宝提供了基础条件。目前，国内外对金霉素降解菌株的筛选以及利用高效菌株降解金霉素废弃物的研究报导极少。2005年，何瑜利用筛选得到一株红曲霉B3菌株对金霉素生产废水进行了降解率研究。而有关小刺青霉对降解金霉素方面的研究，国内外尚无报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一株金霉素高效降解菌株小刺青霉LJ220以及基因。本发明所提供的金霉素降解菌株LJ220，通过对其形态特征观察和rDNA-ITS序列分析，确定该菌株为小刺青霉(Penicillium spinulosum),命名为小刺青霉LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)。该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为=CGMCC No. 5754，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株的rDNA-ITS序列由554个碱基(bp)组成，序列如下TGOGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC 0GTGTTTATT 60GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCOGCCGG GGGGCTTCTG CCCC0GGGTC 1200G0G0GCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCOGGC ATCGATGAAG AA0GCAGCGA 240AATG0GATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TOGAGTCTTT GAACGCACAT 300TGOGCCCCCT GGTATTCOGG GGGGCATGCC TGTC0GAG0G TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCOGGG GACGGGCCOG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC 0GGCGCCAGC 480OGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TOGGATCAGG TAGGGATACC 0GCTGAACTT 540AAGCATATCA ATAA554本发明中的菌株LJ220的菌落形态为
菌落边缘较整齐，周边菌丝为乳白色，短绒毛状，菌丝致密，中部产生分生孢子区，为灰緑色，表面上常分泌出水珠，菌落背面为肉桂色。显微镜观察菌丝具横隔，分生孢子梗顶端生有扫帚状的分枝结构，分生孢子椭圆形。本发明中的金霉素降解菌株LJ220可以在以金霉素为唯一碳源的培养基中生长。在以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4. Og/L的液体培养基中培养，其对金霉素的降解率可达31. 60%。本发明中的菌株LJ220对 菌渣中金霉素的降解率达到80. 20%，该菌株对金霉素菌渣具有较好的适应性，在新鮮的菌渣中能快速生长。该菌株可应用于金霉素生产企业废弃物的处理和周边污染环境的生物修复。本发明的有益效果本发明的一株金霉素降解菌株LJ220的基因，它是小刺青霉(Penicilliumspinulosum) LJ220的rDNA-ITS基因，它是通过基因组DNA的提取，rDNA-ITS序列的扩增，rDNA-ITS全序列测定和分析而获得。本发明从金霉素生产企业的废弃物中筛选得到一株在金霉素为唯一碳源培养基中能较好生长的新菌株LJ220。该菌株使用方便，具有降解菌渣与液体中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复。同吋，菌株LJ220还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。
图I为金霉素降解菌株LJ220的基因组DNA凝胶电泳图(从左向右第一泳道和第ニ泳道为LJ220的基因组DNA，第三泳道为Marker)；图2为金霉素降解菌株LJ220的菌落形态图；图3为金霉素降解菌株LJ220的显微形态图。
具体实施例方式实施例II. 一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的筛选方法I. I材料准备菌样品来源采自金霉素生产企业废弃物。培养基无机盐固体培养基(NH4)2S042.00g, K2HPO4O. 50g, KH2PO4O. 50g, MgSO4 · 7H20O. 50g, NaCl 0. 20g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g,琼脂 13. OOg,葡萄糖 2. OOg/L,溶于1000ml蒸馏水中。115°C灭菌20min后，在超净工作台中添加2. 00g/L金霉素。马丁氏培养基:蛋白胨6. 0g，葡萄糖 10. 0g, KH2PO4L 0g, MgSO4 · 7H20 O. 5g，溶于1000ml蒸懼水中。115で灭菌20111；[11。选择培养基(NH4)2S042. 00，K2HPO4O. 50，KH2PO4O. 50，MgSO4 · 7H20 0. 50，NaCl0. 20,CaCl2O. 10,FeSO4O. Olg,EDTA 0. 015g，溶于 1000ml 蒸馏水中。115°C灭菌 20min，待冷
却后，添加4. 0g/L金霉素。I. 2实验仪器与设备
岛津LC-20A高效液相色谱仪，UNICO UV-2600A紫外可见光分光光度计，MettlerToledo ML204 分析天平、Mettler Toledo pH 计、YT-CJ-IND 超净工作台、HZQ-F160 全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、YX-280D手提式压力蒸汽灭菌器、Nicon Eclipse 80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、DHP-9082电热恒温培养箱、BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝胶成像系统等。I. 3菌株筛选操作步骤如下I)菌株分离与纯化吸取400 μ L废水样，涂布于无机盐固体培养基平板上，置于28-30°C条件下遮光培养2-7天。挑选单菌落，在无机盐固体培养基上划线分离纯化。此步骤重复1-2次，直至得到单ー菌落。
2)高效降解金霉素菌株的筛选将步骤I)中得到的单菌落挑起并依次接入马丁氏培养基中进行活化，然后按2%的接种量转接到的选择培养基中，置于28-30°C，170r/min震荡条件下进行暗培养，第3天和第6天用高效液相色谱法测定各个单ー菌落对金霉素的降解率，从中筛选出降解率高的菌株LJ220。2.对金霉素降解菌株LJ220的分子生物学鉴定鉴定步骤如下2. I基因组DNA的提取I)菌种活化配制马铃薯培养基，分装后灭菌。按O. 5%的接种量将菌株LJ220的种子液接种至装有马铃薯培养基的三角瓶中，28°C，170r/min培养24h。取上述发酵液按2%接种量转接至新的马铃薯培养基中，28°C，170r/min培养48h。2)将步骤I)培养得到的菌球放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的I. 5ml的EP管中，加入600 μ I 65°C的CTAB，于水浴锅中65°C保温15_30min。3)向EP管中加入600μ1氯仿异戊醇为24 I的混合液，充分混匀，4°C，10000r/min离心5min,取上清液至新的EP管中。4)向步骤3)得到的上清液中加入1/10体积的3M NaAc和2. 5倍体积的无水こ醇，-20°C沉淀 IOmin0 4°C, 10000r/min 离心 5min,弃上清。5)用70%冰こ醇500 μ I洗涤DNA 2-3次，倒掉液体，倒置EP管晾干，然后加入100 μ I I X TE 溶解。6)用I %琼脂糖凝胶电泳检测。7)凝胶成像系统观测，照相。图I为金霉素降解菌株LJ220的基因组DNA凝胶电泳图(从左向右第一泳道和第二泳道为LJ220的基因组DNA，第三泳道为Marker)。2.2ITS序列的扩增采用通用引物ITSl和ITS4，对菌株LJ220的rDNA基因的ITS片段进行PCR扩增。PCR扩增序列采用50 μ L反应体系Mix 25yL，引物ITSl(10mmol/L)lyL，引物ITS4 (IOmmoI/L) I μ L,模板(约 25mmol/L) 2 μ L, ddH20 21 μ しPCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30S，55°C退火 45S，72°C延伸 lmin，30个循环，最后72°C延伸IOmin。扩增后的PCR产物通过I %琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统观察。2.3ITS序列的鉴定将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到该菌株的rDNA-ITS序列组成TGOGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC OGTGTTTATT 60GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCOGCCGG GGGGCTTCTG CCCCOGGGTC 1200G0G0GCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCOGGC ATCGATGAAG AAOGCAGCGA 240AATGOGATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TOGAGTCTTT GAACGCACAT 300TGOGCCCCCT GGTATTCOGG GGGGCATGCC TGTCOGAGOG TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCOGGG GACGGGCCOG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC OGGCGCCAGC 480OGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TOGGATCAGG TAGGGATACC OGCTGAACTT 540AAGCATATCA ATM554上述rDNA-ITS序列由554个喊基(bp)组成。3.菌落形态特征观察菌株LJ220在马丁氏平板培养基上能较好生长。菌落边缘较整齐，周边菌丝为乳白色，短绒毛状，菌丝致密；菌落中部产生分生孢子后，为灰緑色，表面上常分泌出水珠；菌落背面为肉桂色。显微镜观察菌丝具横隔，分生孢子梗顶端生有扫帚状的分枝结构，分生孢子椭圆形。图2为金霉素降解菌株LJ220的菌落形态图；图3为金霉素降解菌株LJ220的显微形态图。4.菌株LJ220鉴定为一种新功能菌株将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到LJ220与Penicilliumspinulosum的ITS序列的同源性为99%。根据菌株LJ220的形态特征以及rDNA-ITS序列分析结果，将该菌株鉴定为小刺青霉(Penicillium spinulosum),并命名为小刺青霉LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)。该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号=CGMCC No. 5754。目前，国内外尚没有文献报导小刺青霉(Penicillium spinulosum)具有降解金霉素的功能。因此，菌株LJ220属于ー种新功能菌株。实施例2菌株LJ220对金霉素为唯一碳源的降解实验将菌株LJ220接入以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4. 00g/L的无机盐液体培养基中，进行摇瓶培养，測定培养液中金霉素含量。通过测定得知LJ220对唯一碳源金霉素的降解率可达31. 60% ο测定方法为取ImL培养液,加入5mL的甲醇,8000r/min离心5min,取上清液用22 μ m的滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出的降解率。实施例3菌株LJ220对金霉素菌渣处理实验用马丁氏培养基活化菌株LJ220，然后接种到新鮮的金霉素菌渣中，室温条件下、进行暗培养，然后定期取样测定菌渣中金霉素的残留量，得知菌株LJ220对菌渣中金霉素的降解率为80. 02%。測定方法为准确称取菌渣5. 00g，用50mL丙酮盐酸溶液(4mol/L):水=13 : I : 6的提取液提取，提取液在8000r/min条件下，离心5min，取上清液，用 22 μ m的滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出的降解率。
权利要求
1.一株降解金霉素的小刺青霉LJ220，其特征在于通过形态特征观察，基因组DNA提取和rDNA-ITS序列扩增与比对，鉴定菌株LJ220为小刺青霉(Penicillium spinulosum)，命名为小刺青霉 LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)，CGMCC No. 5754。
2.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220，其特征在于小刺青霉LJ220的菌落形态为边缘较整齐，周边菌丝为乳白色，短绒毛状，菌丝致密，中部产生分生孢子区，为灰绿色，表面上常分泌出水珠，菌落背面为肉桂色；显微镜观察菌丝具横隔，分生孢子梗顶端生有扫帚状的分枝结构，分生孢子椭圆形。
3.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的基因，其特征在于菌株的rDNA-ITS全序列如下 TGCGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC CGTGTTTATT 60 GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCCGCCGG GGGGCTTCTG CCCCCGGGTC 120 CGCGCGCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA 240AATGCGATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT 300 TGCGCCCCCT GGTATTCCGG GGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360 GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCCGGG GACGGGCCCG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420 GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC CGGCGCCAGC 480 CGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT 540 AAGCATATCA ATAA554 该菌株的rDNA-ITS序列由554个碱基(bp)组成。
4.根据权利要求3所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的基因，其特征在于采用BLAST分析法，对菌株LJ220的rDNA-ITS基因序列与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到菌株LJ220与Penicillium spinulosum的ITS序列的同源性为99%。
5.根据权利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的应用，其特征在于该菌株LJ220用于金霉素的降解中。
6.根据权利要求5所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的应用，其特征在于将菌株接种于以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4. Og/L的液体培养基中，其对金霉素的降解率达到31.6%。
7.根据权利要求5所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的应用，其特征在于用马丁氏培养基活化菌株LJ220，然后接种到金霉素菌渣中，室温条件下进行暗培养；菌株LJ220对菌渣中金霉素的降解率为80. 02%。
全文摘要
本发明涉及一株能够降解金霉素的小刺青霉LJ220，属于微生物技术领域。本发明所述的小刺青霉命名为小刺青霉LJ220(Penicillium spinulosum LJ220)。该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.5754。本发明的基因序列是通过基因组DNA提取、rDNA-ITS序列扩增和全序列测定与分析而获得。本发明菌株LJ220能在金霉素为唯一碳源的培养基中生长。该菌株使用方便，对菌渣中残留的金霉素具有高效降解作用。
文档编号C12N1/14GK102732431SQ20121005768
公开日2012年10月17日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者李秀珍, 李艳菊, 杨正礼, 肖思颖, 董晓霞 申请人:北京理工大学, 杨正礼