基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法

专利名称：基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于滚环扩增的比色检测靶核酸或蛋白的方法，属于生物大分子的检测领域。
背景技术：
快速、特异、高通量的生物分子检测方法在医疗以及生物安全领域对病原微生物以及遗传性疾病的诊断具有重要意义。直接从样本中高灵敏的检测低浓度的生物分子在检验医学、病理学、流行病学、环境及食品检测等大量领域具有广泛而潜在的应用。目前，最广泛应用的扩增方法主要是聚合酶链反应(PCR)，PCR技术可以实现10个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和专一性，然而其主要缺点在于需要使用复杂的设备，反应过程需要精确的控温，对实验条件的要求较高，极易造成污染，不适合现场使用。滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是近些年发展起来的一种等温信号扩增方法，其线性扩增倍数为105。滚环扩增过程始于一条线性DNA单链引物和环形单链模板的杂交，引物在DNA聚合酶的作用下延伸，形成一条具有大量重复序列且与环状模板链完全互补的线状单链。RCA技术正成为一种多功能的DNA扩增工具被广泛应用于基因组、蛋白组、诊断、生物传感、药物研发、纳米技术等研究领域。目前基于滚环扩增的一些检测，均较为复杂，需要昂贵的仪器，如芯片检测(全基因组滚环扩增及其产物的固定方法，专利号200610096842，电泳检测(用滚环扩增法扩增寡核苷酸，专利号 200480027696. I)以及拉曼光谱检测等(通过滚环扩增和SEBS检测进行的生物分子分析， 专利号200480001922. 9)，显然这些方法均不能适应于现场的快速检测。纳米金粒子具有独特的光学、电学性质及生物相容性，且制备简单、化学性质稳定、易于生物分子的固定修饰等的优点，广泛应用于纳米生物传感器和疾病的诊疗中。由于纳米金的表面等离子体吸收的作用，宏观上，单分散的纳米金颗粒间的平均间距大于1000 纳米，临近颗粒偶极子间无重叠，使溶液呈现红色，但颗粒间距减小到小于纳米金粒径时， 溶液颜色会发生明显的改变。研究者们利用这种距离依赖的颜色变化开发了一系列溶胶颗粒免疫分析方法用于检测尿液和血清中的靶标蛋白。也有研究者利用纳米金在盐溶液的诱导下对DNA扩增产物片段大小和量的多少产生不同被DNA双链及单个碱基的稳定性而呈现出不同颜色的方法变化对多种样品进行单碱基错配滚环扩增产物进行的检测，并且检测灵敏度高(达到PM)，无需昂贵仪器，可达到了简单、快速、可视化的检测目的。本发明试图利用未标记的纳米金粒子结合上述近年来发展起来的滚环扩增方法， 利用比色检测靶核酸或蛋白，引导出本申请的构思。

发明内容
本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增的比色检测靶核酸或蛋白的方法，以解决现有技术中存在的缺陷。本发明涉及一种快速检测核酸或蛋白的技术平台，利用恒温滚环扩增产生的大量重复序列的单链DNA暴露在纳米金溶液中所产生颜色的变化，通过肉眼观察以及测定其紫外吸收值从而实现对靶核酸或蛋白的微量检测。其主要原理是滚环扩增的大分子产物团聚在一起，表面的负离子堆积程度高，对纳米金颗粒表面的负电荷有屏蔽作用，导致纳米金颗粒间排斥减弱，容易发生聚集，溶液的颜色由原来酒红色逐渐转变为紫黑色。而无扩增产物的溶液或产物较少的溶液颜色变化较小。本发明所述的一种基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法，其特征在于利用核酸之间的杂交反应以及抗原抗体结合将所要检测的靶核酸或蛋白的捕获探针或捕获抗体间接固定于磁珠上或固态支持物上，然后加入滚环成分，通过杂交上的滚环引物进行恒温滚环扩增，产生的大量重复序列的单链DNA大分子产物，最终通过纳米金的颜色反应检测恒温扩增的大分子产物，以达到相对检测靶核酸及蛋白的目的。本发明所述的一种基于滚环扩增比色检测靶核酸和蛋白的方法，包括I. 一种基于滚环扩增比色检测靶核酸的方法(I)将待检测靶核酸的捕捉探针固定到磁珠或固态支持物上；(2)设计针对核酸检测的报告引物探针，其5’端序列与待测核酸靶序列3’端互补，3’端具有和环形模板互补的序列，能作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；(3)捕获探针和报告引物探针可与待检测的目标核酸分子进行三明治杂交，报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物来达到对待测核酸分子的相对定量检测。所述步骤(I)中待检测的目标核酸是指RNA或DNA ；所述步骤(I)中的捕获探针5’端以羧基(-C00H)修饰，3’端连接与待测靶核酸 5’端互补的一段序列；其中，捕获探针5’羧基(-C00H)端连接3个(CH2)及10个T以减少探针杂交时的空间位阻5’ -COOH-(CH2) 3-(T) 10-；所述步骤⑵中报告引物探针的5’端序列与3’端序列之间以poly (T) 10-15连接以减少反应时的空间位阻；所述步骤(3)中的环形模板是末端磷酸化的线性ssDNA通过连接酶的作用形成；所述步骤(3)和(4)中的滚环扩增指线性滚环扩增(LRCA)或指数滚环扩增 (ERCA)；所述步骤(4)中纳米金溶液颜色检测是将扩增产物暴露于纳米金溶液中；通过扩增；产物引起的纳米金溶液颜色变化，以间接检测出目标核酸的相对定量。2. 一种基于滚环扩增比色检测靶蛋白的方法(I)将检测蛋白的捕获抗体固定到磁珠或固态支持物上；(2)设计针对蛋白检测的报告引物探针，其5’端通过巯基修饰，经过Sulfo-EMCS 的作用可连接到检测抗体上，3’端具有和环形模板互补的序列，能作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；(3)检测抗体上连接的报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物来达到对待测蛋白分子的相对定量检测。
所述步骤⑴中待检测的蛋白包括蛋白、肽以及多肽分子等；所述步骤(I)的捕获抗体是针对待检测蛋白的一抗；其中，所要检测蛋白的一抗通过羧氨基反应或配体偶联结合到经过修饰的磁珠上，所述配体包括链亲和素、生物素、 抗体及抗体片段等；所述步骤(3)的检测抗体是针对待检测蛋白的单抗或多抗。所要检测蛋白的检测抗体通过交联剂(如Sulfo-EMCS)或配体偶联到经过修饰的报告引物探针5’端。所述步骤(3)和(4)中的滚环扩增指线性滚环扩增(LRCA)或指数滚环扩增 (ERCA)；所述步骤(4)中纳米金溶液颜色检测是将扩增产物暴露于纳米金溶液中；通过扩增产物引起的纳米金溶液颜色变化，以间接检测出目标蛋白的相对定量。综上所述，本发明利用滚环扩增技术(RCA)，结合适合现场检测的颜色信号输出方式，实现检测灵敏度与PCR相当的核酸或蛋白分子的检测。避免了 PCR过程及PCR仪的使用。在检测上更不需要昂贵的仪器设备，只需通过纳米金溶液的颜色变化直接肉眼观察检测结果，也通过紫外吸收光谱的检测达到对靶标的相对定量。该方法操作简单，快速，特异性好，检测结果直观明了，可望应用于床边快速诊断以及食品安全以及环境中的现场检测。 本发明集成了分子诊断技术、纳米技术、光学检测等多项技术，为多学科交叉应用于生物分子的检测领域做了有益的尝试。


下面的附图构成了本说明书的一部分，将它们引入说明书是为了进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考其中一个或多个附图，并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，这些实施方案可以被更好的理解。图I为基于滚环扩增比色检测靶核酸的原理图(其中A为在标记有捕获探针的磁珠中加入靶核酸(待测RNA或DNA)和信号报告探针，杂交后清洗磁珠；B为加入环模板；C 为加入RCA组分，置于-20°C，以无扩增作为空白对照；D加入RCA组分，扩增及检测；E为将 C、D产物置于95°C变性，取出上清液，取等量的扩增产物加入等量的15nm±3. 5nm的纳米金溶液，观察其颜色变化，并用紫外可见光谱仪测定其吸收；图2显示为基于滚环扩增比色检测蛋白的原理图。所公开的特定类型的分析是免疫RCA分析，其中使用了偶联到寡核苷酸引物上的抗体。该抗体通过三明治杂交与待检测的蛋白结合，其连接的寡核苷酸引物可针对对滚环模板进行扩增，扩增原理同图I ;图3显示为滚环扩增及颜色检测方法的可行性实验.为纳米金颜色变化图(A)及其对应的紫外可见光谱吸收曲线图(B)，其中I为纳米金原液呈酒红色，2为无大分子产物的纳米金溶液也呈酒红色，3为有大分子产物的纳米金溶液呈紫蓝色。紫外可见光谱图中的曲线a、b、c分别对应了图中1、2和3三种溶液；图4为基于滚环扩增可视化检测靶DNA的灵敏度检测结果。分别用浓度为 100nmol/L、10nmol/L、lnmol/L、100pmol/L、10pmol/L、lpmol/L 的甲型 HlNl 核酸及一个空白阴性对照进行滚环扩增及纳米金溶液检测，观察其颜色变化并用紫外可见光谱仪测定每个样品的光谱吸收结果，确定其最低检测浓度为ΙρΜ。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I一种基于滚环扩增比色检测靶核酸的方法本实施例以甲型HlNl核酸为例叙述一种基于滚环扩增的比色检测靶核酸的方法
的建立(I)检测探针的设计及合成本发明以流感病毒HlNl (Inf luenza A virus HlNlenvelope_2)序列为革巴目标基因模板，DNA探针序列如下(探针的合成由大连TaKaRa生物技术有限公司完成)。表I. H1N1DNA靶序列及探针
权利要求
1.一种基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法，其特征在于利用核酸之间的杂交反应和抗原抗体结合将所要检测的靶核酸或蛋白的捕获探针或捕获抗体间接固定于磁珠上或固态支持物上，然后加入滚环成分，通过杂交上的滚环引物进行恒温滚环扩增，产生的大量重复序列的单链DNA大分子产物，最终通过纳米金的颜色反应检测恒温扩增的大分子产物，以达到相对检测靶核酸及蛋白的目的。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于检测靶核酸的具体步骤是(1)探针及引物的设计(a)捕获探针5'端以羧基(-C00H)修饰，3’端连接与待测靶核酸5’端互补的一段序列；(b)报告引物探针设计针对目标靶核酸检测的报告引物探针，其5’端序列与待测核酸靶序列3’端互补，3’端一段序列与环形模板互补，作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；(c)末端磷酸化的线性ssDNA:通过连接酶的作用形成环形模板；(2)将待检测核酸的捕捉探针固定到磁珠或固态支持物上；(3)捕获探针和报告引物探针可与待检测的目标核酸分子进行三明治杂交，报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物，达到对待测目标核酸分子的相对定量检测；其中，①所述的待检测的目标靶核酸是指RNA或DNA ；②所述的捕获探针5’羧基(-C00H)端连接3个(CH2)及10个T以减少探针杂交时的空间位阻 5' -COOH- (CH2) 3- (T) 10-；③捕捉探针固定的固态支持物包括磁珠，硅片，玻片，硅纳米线，石墨烯，碳纳米管或电极；④报告引物探针的5’端序列与3’端序列之间以poly(T)10-15连接以减少反应时的空间位阻；⑤所述的环形模板是末端磷酸化的线性ssDNA通过连接酶的作用形成；⑥所述的滚环扩增指线性滚环扩增或指数滚环扩增；⑦所述的纳米金溶液颜色检测是将扩增产物暴露于纳米金溶液中；通过观察扩增产物引起的纳米金溶液颜色变化，以间接检测出目标靶核酸的相对定量。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于基于核酸滚环扩增的步骤包括(A)磁珠上捕获探针的标记取50 μ L未标记的氨基磁珠，加入50 μ L浓度为O. lmol/L, PH 4. 6的MES，清洗两次， 磁分离，弃上清；加入40 μ L的MES和10 μ L的羧基修饰的捕获探针，充分混匀；配制浓度为20g/L的EDC和30g/L的NHS各100 μ L，各取60 μ L加入到磁珠溶液中，充分混匀，室温震荡下孵育2小时；加入lOOmmol/L的羟胺20 μ L，混匀，室温下震荡15min以终止反应；先用 100 μ L 的 PBS (含 O. 5% BSA, PH 7. 4)洗 2 次，弃上清；最后用 100μ L 含 O. 1% BSA, PH7.4的PBS重悬，4°C下保存备用；(B)线性环模板ssDNA的环化10ymol/L ssDNA I μ L，10 X CircLigase ssDNA 连接酶缓冲液 2 μ L，50mmol/LMnCl2I μ L，lmmol/L ATP I μ L, 100U/μ LCircLigase ssDNA连接酶 I μ L，Sterilized ddH20 14“1^，601反应311，再于801作用IOmin灭活CircLigase ssDNA连接酶；鉴于反应体系中存在未环化的ssDNA，以及反应过程中DNA可能形成的二级结构，向上述反应体系中加入 Exonuclease I 混合液和 Exonuclease III 混合液，并加入 Sterilized ddH20 I. 5 μ L补足至30yL，37°C反应45min，予以去除，再于80°C反应15min将外切酶灭活，连接成功的环状模板于_20°C储存备用；(C)滚环扩增及检测平行做两组实验，每组分别取标记有捕获探针的磁珠、靶核酸、信号报告探针、PBS， 30°C杂交15min，磁分离，弃上清，lXphi29缓冲液洗2次；加入等量lXphi29缓冲液和环状模板，混匀，30°C杂交15min，磁分离，弃上清，I Xphi29缓冲液洗1_2次。再用I Xphi29 缓冲液重悬，加入RCA组分，10Xphi29缓冲液、10mmol/L的dNTP、2%的BSA、phi29聚合酶 (8U)、水共2(^1^体系，混匀，一组置于371扩增120min，另一组于-20°C保存120min ;将两组95°C变性5min使产物从磁上脱离下来，立即磁分离，收集上清；置于_20°C保存备用；取三管制备好的纳米金溶液，第一管为纳米金溶液原液；第二管为等量的纳米金溶液及扩增出大分子产物体积的溶液，此大分子产物为37°C下扩增的阳性的扩增产物；第三管为等量纳米金溶液加入没有扩增出大分子产物的溶液，该产物为加入各组分后没有在37°C 扩增，而是在-20°C放置120min的产物，以做同等条件下的阴性对照；将上述溶液混匀，观察其颜色变化并测其吸光度值；其中，所述的羧基修饰的捕获探针的浓度为94. 2mg/L，标记到磁珠上后，磁珠上捕获探针的浓度为18. 9mg/L ；所述的连接成环状的ssDNA经酶切后，纯的环状DNA的浓度为175mg/L ；所述的待检测的靶核酸为HlNl核酸；所述的 Exonuclease I 混合液为 5U/μ L Exonuclease I 2 μ L, lOXExonucleasel 缓冲液3 μ L ;所述的 Exonuclease III 混合液为 200U/μ L ExonucleaseIII O. 5 μ L, 10 XExonucleaseIII 缓冲液 3 μ L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(C)中，扩增出大分子产物占总体积3%。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的检测最低检测灵敏度为ΙρΜ。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于检测蛋白时步骤是(1)设计针对蛋白检测的报告引物探针，其5’端通过巯基修饰，经过Sulfo-EMCS的作用可连接到检测抗体上，3’端具有和环形模板互补的序列，能作为引物针对滚环模板进行恒温滚环扩增；(2)将待检测蛋白的捕获抗体固定到磁珠或固态支持物上；(3)捕获抗体和检测抗体可与待检测的目标蛋白形成三明治结构，检测抗体上连接的报告引物探针的3’端序列作为环形模板的引物对环形模板进行扩增；(4)通过纳米金溶液颜色反应检测扩增产物来达到对待测目标蛋白的相对定量检测其中，①待测蛋白包括蛋白、肽以及多肽分子；②捕获抗体固定到固态支持物固态支持物包括磁珠，硅片，玻片，硅纳米线，石墨烯，碳纳米管或电极；③所要检测目标蛋白的捕获抗体通过羧氨基反应或配体偶联结合到经过修饰的磁珠上，所要检测目标蛋白的检测抗体通过交联反应或配体偶联到进过修饰的报告引物探针5’ 端;④所述配体包括链亲和素、生物素、抗体或抗体片段；⑤所述的滚环扩增指线性滚环扩增或指数滚环扩增；⑥所述的纳米金溶液颜色检测是将扩增产物暴露于纳米金溶液中；通过扩增产物引起的纳米金溶液颜色变化，以间接检测出目标靶蛋白的相对定量。
7.如权利要求6所述的方法，其中基于蛋白滚环扩增及检测方法主要包括(A)磁珠上捕获蛋白的标记将50ul磁珠用25Mm，PH6等量MES清洗两次，磁分离后去上清，依次加入25ul浓度均为50mg/ml的EDC和NHS，混匀后孵育30分钟，磁分离后去上清，用MES清洗2次；将活化好的磁珠溶于45ul的MES，与2. 5ug抗体混合均匀，孵育30分钟；然后加入50ul PH7，50mM Tris孵育30分钟，将磁珠表面未反应的基团封闭，磁分离后用IOOul含O. I % BSA的PBS 清洗四次，加入50ul含O. 1% BSA的PBS重新悬浮磁珠，4°C保存；(B)检测抗体与信号报告引物探针的连接(a)在检测抗体O.5mM溶液40 μ I中加入5mM的Sulfo_EMCS40 μ 1，再加120 μ I水或 PBS，室温下反应45分钟；将过量的Sulfo-EMCS用离心过滤组件去除；(b)取25μ I浓度为5m M巯基修饰的DNA与25 μ I浓度为IM的DTT，在室温下反应3 小时，过量的DTT用柱子去除；最终体约为于40 μ 1，DNA浓度约2. 5mM ；(c)将(a)中处理处理完毕的抗体，与(b)中经DTT处理的DNA混合，室温下放置2.5 小时；过量的以及未与抗体结合的DNAJP 400 μ IPBS使用离心过滤组件去掉；(C)免疫RCA反应取标记有捕获抗体的磁珠、待检测蛋白(目的抗原)、修饰信号报告探针的检测抗体，混匀，37°C杂交30min，磁分离，弃上清，PBS洗2次，磁分离，弃上清，加人RCA组分， 10Xphi29 缓冲液、10mmol/L 的 dNTP、2% 的 BSA、phi29 聚合酶(8U)、水共 20 μ L 体系，混匀，置于37°C扩增120min ;将20ul O. 5M 二硫苏糖醇加入到“三明治”复合物中，50°C加热 15min后，在25°C下慢慢旋转45min，磁分离，收集上清液即为释放的信号报告引物探针扩增出的大分子产物；(D)纳米金溶液的检测将6管50 μ L纳米金溶液原液分别加入浓度为100nmol/L、10nmol/L、lnmol/L、 100pmol/L> 10pmol/L> lpmol/L的肌I丐蛋白滚环扩增出来的大分子产物2uL(及信号报告引物探针扩增出的大分子产物)；一个空白阴性对照为52μ L的纳米金溶液原液，分别混匀， 观察其颜色变化并用紫外可见光谱仪测定每个样品的光谱吸收结果，确定其最低检测浓度，肌钙蛋白的最低检测灵敏度为ΙρΜ。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的蛋白为肌钙蛋白，最低检测灵敏度为IpM ;所述的肌钙蛋白的信号报告引物探针为5' -CCTTCCGT(T) 10CGTGTCCTCGTTGTCTGCTC-3'；所述的末端磷酸化的环模板线性ssDNA为5' -P-GTTCTGAGCAGACAACGAGGACACGCTTACTGAATAGCTA-3'。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于①步骤(B)的(a)和(c)中离心过滤的膜片型号为Cut-offMW30, 000 ；②步骤(B)的(b)中DTT用柱子型号为MicrospinTM G_25Column。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于肌钙蛋白的检测灵敏度为1PM。
全文摘要
本发明涉及一种基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法，该方法主要利用核酸之间的杂交反应以及抗原抗体结合将所要检测的靶核酸或蛋白间接固定于磁珠上，加入滚环成分，通过杂交上的滚环引物进行恒温滚环扩增，最终通过纳米金的颜色反应检测恒温扩增的大分子产物，以达到相对检测靶核酸及蛋白的目的。该方法通过滚环扩增与纳米金颜色反应的结合，既实现了对微量样品信号的大量扩增，又实现了结果的快速直观检测，避免了PCR仪等昂贵仪器的使用，降低了对实验硬件条件的要求。可望应用于床边快速诊断以及食品安全以及环境中微生物的现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102586450SQ201210057638
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者毛红菊, 王萍, 赵建龙, 邢亚斯, 金庆辉 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所