专利名称：中国北方大肠癌患者hMSH2基因的新突变及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中国北方Lynch syndrome大肠癌患者的hMSH2基因的一种新的突变类型。属于分子检测领域。
背景技术：
hMSH2基因是大肠癌患者的致病基因之一。自Fishel等人1993年在Lynchsyndrome大肠癌患者中发现了 hMSH2基因突变后，国内外很多文献报道了 hMSH2基因在Lynch syndrome大肠癌中的突变位点。但hMSH2基因在中国北方Lynch syndrome大肠癌患者中的突变无人报道，尤其是在一例Lynch syndrome大肠癌患者中新发现的突变(在 c. 1127后插入7个碱基(AACAACA)并在c. 1129后缺失三个碱基(AAG))在国内外均未见报道。
发明内容
本发明在已报道hMSH2基因突变基础上更丰富了 hMSH2基因在大肠癌患者中的突变谱。为大肠癌患者的分子诊断和治疗提供了理论基础。本发明的发明人在14例Lynch syndrome大肠癌患者中开展hMLHl基因外显子l-19、hMSH2基因外显子l-16、k-ras基因12和13密码子、Braf基因11、15外显子和PI3K基因9、20外显子的突变筛检，在I例Lynch syndrome大肠癌患者中发现了 hMSH2基因外显子7的一种新的突变类型。而该病例未携带其它与Lynch syndrome大肠癌有关的基因突变。在现有研究的基础上，本发明公开了一种分离的突变hMSH2基因或其片段，其特征在于突变hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登录号为NM_0002511所示的序列基础上发生以下突变在c. 1127后插入7个碱基AACAACA并在c. 1129后缺失三个碱基AAG。(cDNA碱基位置的命名是从ATG开始)。所述的突变hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。本发明还提供了一种用于扩增权利要求I或2所述的突变hMSH2基因或其片段的引物。优选的，所述的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。进一步的，本发明还提供了一种用于检测所述的突变hMSH2基因或其片段的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中包括以上所述的引物。优选的，所述的试剂盒中包括的引物序列如下所示上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。更进一步的，本发明提出了所述的引物在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMSH2基因试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMSH2基因试剂中的应用。本发明的是通过以下技术方案实现的(I)采用经典的饱和酚氯仿的方法提取组织样本DNA。(2)设计需要扩增的hMSH2基因外显子7的引物。
(3)配制25 μ I PCR扩增体系，并进行PCR扩增。(4)琼脂糖凝胶电泳配制I %琼脂糖凝胶称取Ig琼脂糖粉，加入到I. O X TBE电泳液中。PCR产物在100V的条件下电泳30-40分钟。电泳结束后于紫外灯下观察结果。若在目的片段大小的位置出现条带则PCR成功，可以进行下一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳。(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳①制备玻璃板架将两块玻璃板平放，玻璃板之间的三边插入胶条，三周用夹子夹紧，斜放在架子上。②配制浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶用500ml量筒量取243. 8ml双蒸水至IOOOml大烧杯中；用IOOml和500ml量筒分别称取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入双蒸水的大烧杯中，分别用移液管和移液器吸取4ml 10%过硫酸胺、200 μ ITEMED至大烧杯中，用玻璃棒充分搅拌混匀。③加样将上述配好的混合液用玻璃棒引流至已经夹好的玻璃板之间，插入梳子。将制好的聚丙烯酰胺胶连带玻璃板夹固定在电泳槽上，倒入约400mLl X TBE0将准备好的电泳槽连接到电泳仪上，300伏预电泳30分钟。将变性buffer与PCR产物按照5 : I的比例至10 μ I体积混匀离心。98°C变性10分钟，将变性后的PCR产物迅速冰浴。将PCR产物用微量加样器加入上样孔。④电泳将电泳槽放入4°C冰箱。300伏电泳5分钟，150伏电泳过夜。⑤染色第二天停止电泳。取下玻璃板，弃掉电泳液，将两玻璃板分离，将聚丙烯酰胺胶剥离出来。将剥离出来的凝胶放在盛有固定液的托盘里，放在摇床上固定10分钟，用一蒸水漂洗2次，每次5分钟。再将凝胶转移至盛有染色液的托盘里，染色10分钟，用一蒸水漂洗2次，每次5分钟。然后将凝胶转移至盛有显色液的托盘里，直至条带清晰可见。最后将凝胶装入10#封口袋中，在凝胶成像系统的白光下照相，保存图片并记录结果。(7)将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带出现异常者的PCR产物送至华大基因公司用ABI3730XL测序仪测序。测序结果序列和NCBI基因数据库中提供的原始序列用Chromas2. 22 软件(Technelysium Pty. Ltd.，QLD, Australia)进行比对分析。本发明的有益效果在于，本发明是首次在1/14例Lynch syndrome大肠癌患者中检测到hMSH2基因外显子7的移码突变。该突变位点在国内外均未见报道。
图I为一例Lynch syndrome大肠癌患者的外显子7的SSCP结果图；图2为该病例外显子7的测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I(I)饱和酚氯仿法提取组织样本DNA ①将Lynch syndrome大肠癌患者的术后切除的直肠癌组织组织样本用液氮研磨，在研磨好的组织粉末中加入4ml TES缓冲液，10% SDS溶液250 μ l,20mg/ml蛋白酶K溶液50μ 1，充分混匀，使聚集的白细胞分散开；56°C恒温水浴2小时。 ②加入等体积的饱和酚，反复缓慢地颠倒离心管，混合两相成乳状液。③5000rpm，4°C, 15 分钟离心。④用大口径吸管吸取粘稠的水相(上层)，移至另一洁净离心管中。⑤重复步骤②，③，④。 ⑥加入等体积氯仿-异戊醇(体积比为24 I)溶液，反复缓慢地颠倒离心管，混合两相成乳状液。重复步骤③，④。⑦重复步骤⑥两次，第二次的水相(上层)转移至IOOml小烧杯中。⑧加入2. 5倍体积的在_20°C预冷的无水乙醇，边加边轻摇，有DNA纤维状沉淀析出，置于冰上15 30分钟；用吸头(最好将口熔封)捞出DNA，移到装有lml70%乙醇的
I.5ml离心管中，漂洗。⑨12000rpm，4°C, 10分钟离心，小心移去乙醇液；再用70%乙醇漂洗一次，弃乙
醇，置室温，使乙醇挥发。⑩用适量TE溶液(400-800ul)溶解DNA，4°C冰箱保存。(短期保存可用水溶解DNA)。(2)设计hMSH2基因各外显子的引物，该突变位点在外显子7中，其引物序列如下上游F :5，-TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3，；下游R : 5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。(3)配制25 μ I PCR扩增体系如下HG buffer 12. 5 μ I, dNTP2 μ 1，上下游引物各
O.8 μ I, Supper Taq 酶 O. 5 μ I, DNAO. 8 μ I,双蒸水 7· 6 μ I。(4)在型号为ΑΒΙ9700的PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增程序如下95°C 5分钟，以以下程序扩增35个循环95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，72 °C延伸7分钟，4°C保存。(5)琼脂糖凝胶电泳配制I %琼脂糖凝胶称取Ig琼脂糖粉，加入到I. O X TBE电泳液中。用10 μ I微量移液器吸取2μ I 6X loading buffer于0.5ml EP管中，再吸取4μ I PCR产物于O. 5mlEP管中，离心后加到琼脂糖胶孔中，IOOV电泳30-40分钟。电泳结束后于紫外灯下观察结果。若在目的片段大小的位置出现条带则PCR成功，可以进行下一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳。(6)聚丙烯酰胺凝胶电泳①制备玻璃板架将两块玻璃板平放，玻璃板之间的三边插入胶条，三周用夹子夹紧，斜放在架子上。
②配制浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂40%聚丙烯酰胺取116g丙烯酰胺、4g双丙烯酰胺、加超纯水至1000ml，搅拌溶解。10 X T BE 缓冲液取 121. 15gTris Base,55. 65g硼酸，加 20ml 500mMEDTA (PH8. O)，加超纯水至1L，混匀。10 %过硫酸胺取IOg过硫酸胺加超纯水至IOOml，混匀。12%聚丙烯酰胺胶的配制用500ml量筒量取243. 8ml双蒸水至IOOOml大烧杯中；用IOOml和500ml量筒分别称取40ml 10XTBE、192ml 30%聚丙烯酰胺至已加入双蒸水的大烧杯中，分别用移液管和移液器吸取4ml 10%过硫酸胺、200 μ ITEMED至大烧杯中，用玻璃棒充分搅拌混勻。③加样将上述配好的混合液用玻璃棒引流至已经夹好的玻璃板之间，插入梳子。这期间要不断观察，出现漏液立即补充。一到两个小时后，拔掉上方的梳子及下方的玻璃条，将玻璃板周围的夹子去掉，电泳槽底部倒入约300mL I X TBE，把玻璃板夹在电泳槽上，将玻璃板底部的气泡赶出，在电泳槽上端两块玻璃板之间倒入约400mLl X TBE。将准备好的电泳槽连接到电泳仪上，同时用IOml注射器冲洗梳子孔，将电泳槽放在4°C冰箱中，300伏预电泳30分钟。准备样品。在0.5ml离心管中加入变性buffer 6 μ 1，然后加入PCR产物
I.8μ 1，离心。当预电泳至30分钟后，将离心好的样品放入PCR仪中，98°C变性10分钟。将变性后的PCR产物从PCR仪中迅速移至冰浴。将PCR产物用微量加样器加入上样孔。④电泳将电泳槽放入4°C冰箱。300伏电泳5分钟，150伏电泳过夜。⑤染色第二天停止电泳。取下玻璃板，弃掉电泳液，将两玻璃板分离，将聚丙烯酰胺胶剥离出来。配制固定液，染色液和显色液，配方如下固定液无水乙醇100ml、冰乙酸4ml,加一蒸水至800ml,混勻。染色液硝酸银I. 6g，加入甲醛4 μ 1，加一蒸水至800ml，混匀。显色液氢氧化钠128，加入甲醛4 4 I，加超纯水至800ml，混匀。将剥离出来的凝胶放在盛有固定液的托盘里，放在摇床上固定10分钟，用一蒸水漂洗2次，每次5分钟。再将凝胶转移至盛有染色液的托盘里，染色10分钟，用一蒸水漂洗2次，每次5分钟。然后将凝胶转移至盛有显色液的托盘里，直至条带清晰可见。最后将凝胶装入10#封口袋中，在凝胶成像系统的白光下照相，保存图片并记录结果。本发明的携带新突变的大肠癌病例外显子7的SSCP结果图，如图I所示。(7)将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带出现异常者的PCR产物送至华大基因公司用ABI3730XL测序仪测序。测序结果序列和NCBI基因数据库中提供的原始序列用Chromas2. 22 软件(Technelysium Pty. Ltd. ,QLD,Australia)进行比对分析。该病例外显子7测序结果如图2所示，突变hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登录号为NM_0002511所示的序列的c. 1127后插入7个碱基AACAACA并在c. 1129后缺失三个碱基AAG。
权利要求
1.一种分离的突变hMSH2基因或其片段，其特征在于突变hMSH2基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登录号为NM_0002511所示的序列基础上发生以下突变在c. 1127后插入7个碱基AACAACA并在c. 1129后缺失三个碱基AAG。
2.如权利要求I所述的分离的突变hMSH2基因或其片段，其特征在于所述的突变hMSH2基因的cDNA序列如SEQ ID NO. I所示。
3.一种用于扩增权利要求I或2所述的突变hMSH2基因或其片段的引物。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
5.一种用于检测权利要求I或2所述的突变hMSH2基因或其片段的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中包括权利要求3或4所述的引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中包括权利要求4所述的引物，所述的引物序列如下所示上游 F :5’ -TCAGATTGAATTTAGTGGAAGC-3’ ；下游 R :5，-TTCATGTTTTTCCAGAGCCTG-3，。
7.权利要求3或4所述的引物在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMSH2基因试剂中的应用。
8.权利要求5或6所述的试剂盒在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMSH2基因试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了中国北方大肠癌患者hMSH2基因的新突变及其用途，它涉及中国北方Lynch syndrome大肠癌患者的hMSH2基因的一种新的突变类型。本发明在1/14例Lynch syndrome大肠癌患者中发现一种新的突变，即在GeneBank登录号为NM_0002511所示的序列基础上发生以下突变在c.1127后插入7个碱基AACAACA并在c.1129后缺失三个碱基AAG。本发明在已报道hMSH2基因突变基础上更丰富了hMSH2基因在大肠癌患者中的突变谱。为大肠癌患者的分子诊断和治疗提供了理论基础。
文档编号C12Q1/68GK102634521SQ20121005768
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者朱琳, 梁静, 王帆, 胡付兰, 赵亚双 申请人:哈尔滨医科大学