专利名称：通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的检测方法、探针组和诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠癌的预后领域，尤其涉及一种通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存进行预测的检测方法。本发明还涉及用于该方法的探针组及诊断试剂盒。
背景技术：
大肠癌泛指发生在直肠 和全部结肠(升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠)的恶性肿瘤，是临床上常见的恶性肿瘤之一。目前，国内大肠癌每年的新发病例约为80万例，每年有50万人死于大肠癌。由于生活条件和生活习惯的改变，大肠癌的发病率还在呈逐年上升趋势，与上世纪90年代和70年代相比，大肠癌的发病率，在城市上升了 31. 95%，在农村上升了 8. 51%，在全国五大城市(北京、天津、上海、武汉、哈尔滨)中，北京的大肠癌发病率最高，其次为上海；上海的大肠癌发病率正以每年4. 2%左右的速度上升。同时，大肠癌的发病平均年龄越来越低，可以预见，随着人口的进一步老龄化，老年人口的大肠癌发病率还将大幅上升。根据美国癌症协会2005年的统计数据，早期大肠癌的五年生存率为90% ;—旦肿瘤侵犯周围的淋巴结或者脏器，其五年生存率就降为67% ;假如肿瘤发生远处转移，则其五年生存率就只有9%。但是，由于大肠癌的早期症状不明显，缺乏特异性临床表现，加上患者的自我保健意识较差或讳疾忌医，因此，大肠癌的早期发现和诊断比较困难，临床上，有60 70%以上的患者确诊时已是大肠癌的中晚期，而在能够进行结直肠癌根治手术的II期和III期患者中，约20%和50%的患者会在术后发生复发和转移，需要根据病情再接受化疗或放疗等辅助治疗。但是，肿瘤的复发和转移，涉及到众多基因的变化，其过程相当复杂，因此，对患者术后发生复发转移危险度的预测比较困难。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的检测方法，它有助于提高大肠癌患者术后的生存率。为解决上述技术问题，本发明的通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的检测方法，包括以下步骤(I)采集大肠癌患者的手术切除癌组织标本；(2)抽提 RNA 样本；(3)纯化该RNA样本；(4)检测4个探针在该RNA样本中的表达，所述探针分别具有如SEQ ID No :1，SEQIDNo 2, SEQ ID No :3及SEQ ID No 4所示的序列或其互补链；(5)计算上述4个探针中，呈高表达状态的探针数目，并对该患者手术后的预后进行评价。本发明要解决的另一技术问题是提供一种用于上述方法的探针组。
为解决上述技术问题，本发明的用于通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的探针组，包括有4个探针，这4个探针分别具有如SEQ ID No U SEQ ID No :2、SEQID No 3及SEQ ID No 4所示的序列或其互补链。本发明要解决的再一技术问题是提供一种用于上述方法的诊断试剂盒。为解决上述技术问题，本发明的用于通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的诊断试剂盒，包含有上述探针组。本发明通过对4个特异性探针的检测和联合分析，来快速诊断大肠癌患者术后发生复发和转移的危险度，从而可以在术后及早筛查出复发转移危险度较高的大肠癌患者，对其进行相应的辅助治疗，以提闻患者术后的生存率，延长患者的生存时间。
图I为本发明实施例中用SAM软件分析得到的散点图；
图2为本发明实施例的对数生存函数曲线图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。I.实验对象本实施例的研究对象选自2004年6月至12月间，在复旦大学附属肿瘤医院大肠外科接受根治性手术治疗，且术前检查无远处转移的172例II-III期结直肠癌患者。在上述所有患者均完成术后辅助治疗并进入单纯随访期后，再进行二次筛选，排除未接受辅助化疗的II期患者29例，术后未接受或接受少于3个疗程化疗的患者12例，接受术后辅助放疗的低位直肠癌患者15例，未获得组织标本的患者8例，术后采用CPT-Il作为辅助化疗药物的患者6例，研究开始时即失访的患者7例，最后有95例患者通过筛选，成为本实施例的研究对象。这95例患者术后病理证实均为AJCC/nCC分期II-III期，所接受的术后辅助化疗方案包括不含奥沙利钼的单药化疗方案(5-Fu/CF或卡培他滨单药)和含奥沙利钼的联合化疗方案(5-Fu+CF+奥沙利钼或卡培他滨+奥沙利钼)，且所有直肠癌患者均未接受辅助或新辅助放射治疗。对这95例患者的随访时间为4 48个月，中位随访时间为37个月，除在随访开始后36个月内死亡的患者，所有患者的随访时间至少为36个月。2.实验方法采集上述95例患者的手术切除癌组织标本,用德国Qiagen公司的RNeasy MiniColumnKit,按照试剂盒的说明，抽提RNA样本。抽提后的RNA样本保存在-70°C的深低温冰箱中。用Roche Molecular Biochemicals 公司的 High Pure RNA Paraffin Kit (货号3270289)，按照试剂盒的说明，对抽提的RNA进行纯化。采用DASL(cDNA介导退火、选择、延伸、连接反应)技术，按照illuminabeadstationDASL系统手册(Illumina Doc. #11175105)规定的标准操作步骤，对纯化后的95个RNA样本同时进行502个基因的表达检测。对DASL分析所得的实验数据，用quantile (分位数)标化法，剔除2个信号较差样本。对剩余的93例样本，用SAM(微阵列显著性分析)软件进行分析，筛选出阳性探针359个，阴性探针23个，如图I所示。通过SAM软件计算各探针的q_值，进一步筛选出q_值(％ ) = O的4个特异性探针，这4个探针的序列分别如SEQ ID No USEQ ID No :2、SEQ ID No 3以及SEQ ID No 4所示。通过ROC曲线(受试者工作特征曲线)选择切点，定义这4个探针的高低表达，计算各样本中的高表达探针数。3.结果分析结合93例患者的随访结果，利用EpiCalc统计软件进行趋势卡方检验，检验结果(检验值为23. 27，P = O. 000002)如表I所示 表I趋势卡方检验结果
高表达探针数复发人数无复发人数复发率~ OR(优势比)I RR(相对危险度)
O3318.82% Τ 1700
~ 152834.88% 5 543 95
~25362. 5% 17.22 Γθ8
33 75%31.008 50
~4O100%^11. 33从表I中可以看出，高表达探针数目越多的个体，术后发生肿瘤复发和转移的几率和危险度就越高；当4个特异性探针均呈高表达状态时，该个体的术后复发率达到100%。同时，再对这93例样本进行Kaplan-Meier生存分析。根据高表达探针数目，将样本分为Α、Β两组，A组样本的高表达探针数小于2，B组样本的高表达探针数大于或等于2。分析结果如图2所示(P = 3. 9Ε-6，图中带符号“ + ”的数据为截尾数据)，有2个以上探针高表达的个体，其术后无病生存时间显著缩短。4.在预后诊断中的应用采集待检大肠癌患者的手术切除癌组织标本，按照前述方法，抽提、纯化RNA样本，并利用DASL技术，检测上述4个特异性探针在该RNA样本中的表达，然后，计算其中呈高表达的探针数目，再根据表I的趋势检验结果和图2的对数生存函数曲线，评价该待检患者在手术后发生复发转移的危险度和无病生存的时间。
权利要求
1.一种通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)采集大肠癌患者的手术切除癌组织标本； (2)抽提RNA样本； (3)纯化该RNA样本； (4)检测4个探针在该RNA样本中的表达，所述探针分别具有如SEQID No :1，SEQIDNo :2，SEQ ID No :3及SEQ ID No 4所示的序列或其互补链； (5)计算上述4个探针中，呈高表达状态的探针数目，并对该患者手术后的预后进行评价。
2.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于步骤⑵中，使用RNeasyMiniColumnKit抽提RNA样本，抽提后的RNA样本保存在-70°C的深低温冰箱中。
3.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中，使用HighPure RNAParaffinKit 纯化 RNA 样本。
4.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于步骤⑷中，采用cDNA介导退火、选择、延伸、连接反应技术，检测探针的表达。
5.如权利要求I所述的检测方法，其特征在于步骤(5)中，所述预后评价包括复发率和无复发生存时间的评价。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述高表达的探针数目越多，该患者术后的复发率越高，无复发生存时间越短。
7.一种用于通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的探针组，其特征在于包括4个探针，这4个探针分别具有如SEQ ID No: I、SEQ ID No :2、SEQ ID No :3及SEQIDNo 4所示的序列或其互补链。
8.一种用于通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的诊断试剂盒，其特征在于该诊断试剂盒包含有如权利要求7所述的探针组。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因记数方法对大肠癌术后无复发生存预测的检测方法，包括步骤采集大肠癌患者的手术切除癌组织标本；抽提RNA样本；纯化RNA样本；检测4个特异性探针的表达；计算高表达探针数目，评价该患者的预后。本发明还公开了由上述探针组成的探针组，以及包含该探针组的诊断试剂盒。本发明的检测方法有助于提高大肠癌患者术后的生存率。在大肠癌患者接受根治性手术后，即可通过对4个特异性探针的检测和联合分析，快速判断出该患者术后发生复发和转移的危险度，从而能够对复发危险度较高的患者及早地进行辅助治疗，帮助延长患者的生存时间。
文档编号C12N15/11GK102766678SQ201110113489
公开日2012年11月7日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者彭俊杰, 徐烨, 牛振民, 王志敏, 王海丰, 蔡三军, 黄薇 申请人:上海人类基因组研究中心, 复旦大学附属肿瘤医院