专利名称：多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。
背景技术：
同源异型框基因(homeobox gene，Hox)，编码一个高度保守的转录因子家系，这些转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用，能够维持正常的体节形成，菱脑原节形成和发育，以及后脑和各个器官、组织及四肢的正常的分化和发育。HoxclO是Hox基因家族中一位重要的成员。已有研究表明，HoxclO不仅影响脊椎动物的胚胎发育，尤其是神经系统发育，同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、人及大鼠 HoxclO的抗体，这些抗体与羊、兔、猴等有一定的交叉反应，针对多疣壁虎的HoxclO蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究HoxclO在多疣壁虎断尾再生过程中的作用及其他相关生物学功能，本专利拟制备兔源抗多疣壁虎HoxclO抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎HoxclO蛋白抗体的多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。本发明的技术解决方案是
步骤1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得
根据同源比对小鼠、人、鸡等物种HoxclO基因序列，设计一对简并引物，序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ； 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’， 基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步骤2)、多疣壁虎HoxclO全长序列获得
RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列，共包含2156bp，其ORF区位于112_1242bp，共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陆号GQ267528. 1
步骤3)、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位，通过综合分析发现HoxclO抗原表位极有可能位于氨基酸4-6，21-24，27，29-30, 36-42，45，57，7 2-73，78-81, 83-85, 99，
131-132, 136，147-149，153-154，162-165，205-206，209，211，216-217， 226，233-234，240-241，271-274，295，301-302，308-310，337，370，372-373。本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。步骤4)、构建HoxclO的原核表达载体
1.设计构建HoxclO原核表达载体的引物，上游引物5’端加上B10 I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5，- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3，； 2.取多疣壁虎脑，脊髓及部分其他组织，用Trizol试剂法提取总RNA ；3. RT-PCR扩增用 QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应，合成cDNA ；4.采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增；5.用限制性内切酶)(ho I、EcoR I消化HoxclO的PCR产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收。6.连接用T4 DNA连接酶将 PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；7.感受态细胞的制备用无菌接种棒从_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板， 37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/ 分震荡培养12小时。取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中，37°C 震荡培养2-2. 5小时，至OD6tltl为0. 4-0. 5时，放置于4°C冰箱冷却1_2小时。将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮 30分钟。4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮。 以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，-70°C冻存备用。8.重组质粒的转化取5μ 1 DNA 连接产物加入100 μ 1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均勻，冰浴30分钟，42°C水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200 μ 1，于37°C缓摇孵育60分钟， 将培养物适量涂于1. 5%琼脂LB平板(含氨苄青霉素)，待胶表面没有液体流动时，37°C温箱倒置培养12-16小时；9.重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；10.将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步骤5)、目的蛋白的表达BL21感受态细胞的制备(方法同上述DH5ci感受态细胞的制备)。用鉴定正确的pGEX-4Tl-HoXC10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至anl LB培养基(含氨苄青霉素50mg/L)中37°C震荡培养过夜。将Iml菌液加入到含50ml LB培养基的IOOOml培养瓶中，37°C震荡培养至OD6tltl为0. 6左右，取Iml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mm0l/L，3(TC诱导6小时。同时以转化了 pGEX_4Tl载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、 末诱导的含PGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml，室温IOOOOg离心1分钟，弃去上清，0. OlM PBS 500ml重悬，加入等体积2 X SDS电泳上样缓冲液，100°C煮沸5分钟，然后以12000g 离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20 μ 1悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；步骤6)、目的蛋白的纯化证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了 pGEX-4Tl-HoXC10 的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37°C震荡培养至0D_为0. 6左右， 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mmOl/L，30°C诱导6小时。菌液离心,超声破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose 吸附 GST-HoxclO 融合蛋白。用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione s印harose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4°C透析M小时，收集透析后的液体。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-HoxclO融合蛋白。步骤7)、多克隆抗体的制备参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积(1 ml)的Freud’ s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫M天后进行第二次免疫，使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s 不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；末次免疫10天后，Elisa检测HoxclO抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于_80°C备用。使用制备的HoxclO抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的HoxclO蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。本发明所述制备的兔源抗多疣壁虎HoxclO蛋白多克隆抗体，体内外均可特异性的与多疣壁虎HoxclO蛋白相结合。本发明的优越性在于以PGEX-4T1为基础所构建的体外HoxclO表达系统在 BL 21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行纯化，可方便地获得大量的 GST-HoxclO融合蛋白。另外，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎HoxclO 抗血清滴度高、特异性好，完全可以满足相关实验的需要。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1是多疣壁虎HoxclO优势表位肽段构建入原核表达载体的测序结果示图。 图2是原核表达质粒pGEX-4T I-Hoxc 10构建示图。图3是GST-HoxclO融合蛋白的诱导表达电泳示图
图 4 是 GST-HoxclO 经 glutathione sepharose 纯化后电泳示5是制备的抗体与细菌表达的HoxclO融合蛋白Western Blot结果示6是制备的抗体与多疣壁虎各组织中的HoxclO蛋白Western Blot结果示7是制备的抗体与多疣壁虎脊髓组织中的HoxclO蛋白免疫组化结果示图。图3中M:低分子量蛋白标准品；1 未诱导的含PGEX-4T1质粒的细菌总蛋白； 2 经IPTG诱导的含pGEX-4Tl质粒的细菌总蛋白；3 未诱导的含pGEX_4TI-Hoxc 10质粒的细菌总蛋白；4 经IPTG诱导的含pGEX-4Tl- HoxclO质粒的细菌总蛋白。图4中1 经glutathione sepharose纯化后的GST-HoxclO融合蛋白；2 未诱导的含pGEX-4Tl质粒的细菌总蛋白；3 经IPTG诱导的含pGEX_4Tl质粒的细菌总蛋白；4 未诱导的含pGEX-4Tl-HoxclO质粒的细菌总蛋白；5 经IPTG诱导的含pGEX_4Tl_ HoxclO 质粒的细菌总蛋白；箭头表示GST-HoxclO融合蛋白。
图 5 中 1 经 glutathione sepharose 纯化后 GST-HoxclO 融合蛋白；2 经 IPTG 诱导的含PGEX-4T1质粒的细菌总蛋白；箭头所示分别为37 kD HoxclO蛋白和沈kD GST蛋白。图6中1 壁虎睾丸组织总蛋白；2 壁虎肾组织总蛋白；3 壁虎肺组织总蛋白； 4 壁虎心组织总蛋白；5 壁虎脊髓组织总蛋白；6 壁虎脑组织总蛋白；7 壁虎肝组织总蛋白；箭头所示为41 kD HoxclO蛋白。图7中A:多疣壁虎脊髓组织中TRITC标记的HoxclO蛋白，bar=20 μ m ；B:Hoechst 标记细胞核，bar=20ym;C:A图与B图叠加，bar=20ym;D: C图矩形区域的放大，箭头标记 HoxclO 蛋白，bar=20 μ m。
具体实施例方式步骤1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得
根据同源比对小鼠、人、鸡等物种HoxclO基因序列，设计一对简并引物，序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ； 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’， 基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步骤2)、多疣壁虎HoxclO全长序列获得
RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列，共包含2156bp，其ORF区位于112_1242bp，共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陆号GQ267528. 1
步骤3)、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位，通过综合分析发现HoxclO抗原表位极有可能位于氨基酸4-6，21-24，27，29-30, 36-42，45，57，7 2-73，78-81, 83-85, 99，
131-132, 136，147-149，153-154，162-165，205-206，209，211，216-217， 226，233-234，240-241，271-274，295，301-302，308-310，337，370，372-373。本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。步骤4)、构建HoxclO的原核表达载体
1.设计构建HoxclO原核表达载体的引物，上游引物5’端加上B10 I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为
5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5，- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3，； 2.取多疣壁虎脑，脊髓及部分其他组织，用Trizol试剂法提取总RNA ；3. RT-PCR扩增用 QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应，合成cDNA ；4.采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增；5.用限制性内切酶Xho I、EcoR I消化HoxclO的PCR产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收。6.连接用T4 DNA连接酶将 PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；7.感受态细胞的制备用无菌接种棒从_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，
737°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/ 分震荡培养12小时。取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37°C 震荡培养2-2. 5小时，至OD6tltl为0. 4-0. 5时，放置于4°C冰箱冷却1_2小时。将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮 30分钟。4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮。 以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，-70°C冻存备用。8.重组质粒的转化取5μ 1 DNA 连接产物加入100 μ 1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均勻，冰浴30分钟，42°C水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200 μ 1，于37°C缓摇孵育60分钟， 将培养物适量涂于1. 5%琼脂LB平板(含氨苄青霉素)，待胶表面没有液体流动时，37°C温箱倒置培养12-16小时；9.重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；10.将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC
101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步骤5)、目的蛋白的表达BL21感受态细胞的制备。用鉴定正确的pGEX-4Tl-HoXC10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至aiil LB培养基(含氨苄青霉素 50mg/L)中37°C震荡培养过夜。将Iml菌液加入到含50ml LB培养基的IOOOml培养瓶中， 37°C震荡培养至0D_为0. 6左右，取Iml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mmOl/L，30°C诱导6小时。同时以转化了 PGEX-4T1载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、末诱导的含pGEX_4Tl载体的BL21菌液各 lml，室温IOOOOg离心1分钟，弃去上清，0. OlM PBS 500ml重悬，加入等体积2 X SDS电泳上样缓冲液，100°C煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20 μ 1悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况； 步骤6)、目的蛋白的纯化证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了 pGEX-4Tl-HoXC10 的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37°C震荡培养至0D_为0. 6左右， 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mmOl/L，30°C诱导6小时。菌液离心,超声破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose 吸附 GST-HoxclO 融合蛋白。用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione s印harose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4°C透析M小时，收集透析后的液体。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-HoxclO融合蛋白。步骤7)、多克隆抗体的制备参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积(1 ml)的Freud’ s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫M天后进行第二次免疫，使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s 不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；末次免疫10天后，Elisa检测HoxclO抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于_80°C备用。使用制备的HoxclO抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的HoxclO蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。 制备BL21感受态细胞的方法是用无菌接种棒从_70°C保存的BL21菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/分震荡培养12小时；取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37°C震荡培养2-2. 5小时，至OD600为0. 4-0. 5时，放置于4°C冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清， 用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮30分钟；4°C离心，4000gX 10分钟，弃去上清，加入冰浴的 0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮；以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，_70°C冻存备用。
权利要求
1. 一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是包括下列步骤(1)多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得根据同源比对小鼠、人、鸡物种HoxclO基因序列，设计一对简并引物，序列如下上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ；下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’，基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列；(2)多疣壁虎HoxclO全长序列获得RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列，共包含2156bp，其ORF区位于112_1242bp，共编码376个氨基酸； 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因，GenBank登陆号GQ267528. 1 ；(3)使用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位，选取 96-191片段为免疫肽段，对应397-684核苷酸序列；(4)构建HoxclO的原核表达载体设计构建HoxclO原核表达载体的引物，上游引物5’端加上Bio I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’ - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’ ； 取多疣壁虎脑及脊髓组织，用iTrizol试剂法提取总RNA ； RT-PCR扩增用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应，合成cDNA ；采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的对应蛋白表位优势肽段96-191的397-684核苷酸序列，PCR 扩增；用限制性内切酶》io I ,EcoR I消化HoxclO的PCR产物和pGEX-4Tl原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收；连接用jM DNA连接酶将PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；感受态细胞的制备用无菌接种棒从-70°C保存的 DH5 α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/分震荡培养12小时；取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中，37°C震荡培养2-2. 5小时，至0D_为0. 4-0. 5 时，放置于4°C冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX 10 分钟，弃去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮30分钟；4°C离心，4000gX 10分钟，弃去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮；以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，-70°C冻存备用；重组质粒的转化取5μ 1 DNA连接产物加入100 μ 1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均勻，冰浴30分钟，42°C水浴中热休克90秒，继续冰浴2_3分钟后加入LB培养基200 μ 1，于37°C摇孵育60分钟，将培养物涂于含氨苄青霉素的1. 5%琼脂LB 平板，待胶表面没有液体流动时，37°C温箱倒置培养12-16小时；重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGMAATGCCTG.51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG ；(5 )目的蛋白的表达制备BL21感受态细胞；用鉴定正确的pGEX-4T I-Hoxc 10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素50mg/L的 2ml LB培养基中37°C震荡培养过夜；将Iml菌液加入到含50ml LB培养基的IOOOml培养瓶中，37°C震荡培养至OD6tltl为0.6，取Iml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mm0l/L，3(TC诱导6小时；同时以转化了 PGEX-4T1载体的BL21细菌作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX_4Tl载体的BL21菌液各 lml，室温IOOOOg离心1分钟，弃去上清，0. OlM PBS 500ml重悬，加入等体积2 X SDS电泳上样缓冲液，100°C煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20 μ 1悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；(6)目的蛋白的纯化证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了pGEX-4Tl-HoXC10的 BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37°C震荡培养至OD6tltl为0. 6，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mmol/L, 30°C诱导6小时，菌液离心，超声破碎后，用 GE healthcare 公司的 glutathione s印harose 吸附GST-HoxclO 融合蛋白；用 10 mM 的还原型GSH洗脱glutathione sepharose,将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4°C透析M小时，收集透析后的液体；用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-HoxclO融合蛋白；(7)多克隆抗体的制备参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积的Freud's完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫对天后进行第二次免疫， 使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0. 5mg融合蛋白与等体积的Freud’ s不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第三次免疫10天后，Elisa检测HoxclO抗血清达到效价后，心脏取血， 免疫血清储存于-80°C备用；使用制备的HoxclO抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的HoxclO蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。
2.根据权利要求1所述的多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法， 其特征是制备BL21感受态细胞的方法是用无菌接种棒从_70°C保存的BL21菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/分震荡培养12小时；取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37°C震荡培养2-2. 5小时，至OD600为0. 4-0. 5时，放置于4°C冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清， 用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮30分钟；4°C离心，4000gX 10分钟，弃去上清，加入冰浴的 0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮；以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，_70°C冻存备用。
全文摘要
本发明公开了多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得，RACE法获得Hoxc10全长序列，采用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位，选取优势表位肽段构建Hoxc10的原核表达载体，体外诱导融合蛋白表达，融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备等步骤。本发明以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步进行纯化，可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好。
文档编号C12N15/70GK102206647SQ201110113360
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者周晓芳, 陆仁飞, 陈海莲, 顾星星 申请人:南通大学