专利名称：用于产生蛋白质的昆虫感染方法
技术领域：
本发明是关于一种用于以杆状病毒表达载体在昆虫中产生蛋白质的昆虫感染方法。特定而言，所述感染方法用于感染昆虫幼虫或蛹。
背景技术：
基于生物反应器生产蛋白质的一种低成本替代方法是利用昆虫幼虫作为“微型生物反应器”。此类方法主要利用昆虫幼虫作为制造蛋白质的生物工厂。因为昆虫幼虫生长快速且成本廉价，已尝试以遗传工程改造它们(取代细胞)以表现蛋白质。必须将基因导入幼虫以表现蛋白质，在此方面，杆状病毒(Baculovirus)已用于将基因导入昆虫或其幼虫。杆状病毒表达载体系统已广泛用于昆虫。杆状病毒，为一种昆虫病毒，仅感染昆虫且用于作为转殖基因在昆虫中的大规模表现系统。杆状病毒通常根据所源自的宿主来命名杆状病毒。举例而言，自苜蓿环纹夜蛾(alfalfa looper)分离的杆状病毒被命名为加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)，AcMNPV。然而，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、大蜡螟 (Galleria mellonella)及薄荷灰夜蛾(Rachiplusia ou)中亦发现与AcMNPV几乎相同的杆状病毒。其它的杆状病毒表达载体亦为已知，例如源自家蚕(Bombyx mori L.)核多角体 BmNPV的表达载体。BmNPV载体系统尤其适用于在家蚕幼虫中，用以产生重组蛋白质。杆状病毒感染昆虫幼虫的最常见的方法为口服感染、注射感染及喷雾感染。然而， 当实际且工业应用于蚕时，却存在许多瓶颈问题。US 5，288, 616揭示一种藉由使用蚕来产生蛋白质的方法，其包含用已插入目标蛋白质基因的病毒经口感染蚕；喂养所述等蚕；及自所述等蚕收集所述目标蛋白质。EP 06381 提供用于口服感染的包埋前(pre-occluded)杆状病毒粒子，所述病毒经基因改造以使其缺乏功能性多角体蛋白或颗粒体蛋白基因。EP 1442658(及其对应案CN 1599554、 US 2004241822、JP 2003111535、WO 03030637)提供一种制造以重组病毒感染蚕的饲料的方法及一种将重组病毒同时经口接种于蚕体内的方法。Toru Arakawa等人揭示藉由光学增亮剂Tinopal UNPA-GX协助核多角体病毒出芽粒子(nuclear polyhedrosis virus budded particle)经口感染家蚕(Journal of Viorlogical Methods 88(2000)第 145-152 页)。 所述等作者更研究出一种使用昆虫生长调节剂，氟芬隆(f lufenoxuron)，以使BmNPV经口感染家蚕的方法(Journal of Virological Methods 100(2002)第 141-147 页)。然而，如何提高杆状病毒对昆虫的口服感染率仍然为此项技术中的一项难题，重组杆状病毒通常去除多角体蛋白基因以用于生产蛋白质，因此经由口服感染的此等重组杆状病毒，容易被昆虫消化分解，导致感染率较低。此外，在使用口服感染时难以控制病毒剂量。重组杆状病毒可利用注射器经由个别背侧注射来感染幼虫。举例而言，CN 1974776使用含有重组杆状病毒的脂质体，藉由注射来感染家蚕。尽管注射感染具有较高的感染率，但其耗费时间及人力。JP 9051742提供一种自动注射装置来节省人力。然而，其仍需要大量时间且不能批处理家蚕。耗费时间及人力已成为杆状病毒表现系统在家蚕生物反应器的实际及工业利用上的瓶颈。
US 7，261，886提供一种应用于生产重组蛋白与杆状病毒生物农药的虫体喷雾感染方法，藉由芽体形式杆状病毒(budding form baculovirus)的液体喷雾来感染昆虫幼虫。然而，所述专利的喷雾方法仅能用于三或四龄期的幼虫，在所述专利中，使用1-4龄的拟尺蠖进行实验并建议对3及4龄幼虫可获得较高的杆状病毒及蛋白质产率，而其感染率为约88%。另所述专利亦使用三龄期的小菜蛾幼虫进行实验，但感染率仅有三成。因此，喷雾感染方法的感染率在不同昆虫差异相当大。再者，所述等喷雾方法系以喷雾方式实施，无法均勻感染幼虫。在无需大量时间及人力下，于昆虫中获得高杆状病毒感染率为一难题；需要一种有效且能够获得高感染率的创新感染方法。
发明内容
本发明提供一种用于以杆状病毒表达载体在昆虫中产生蛋白质的昆虫感染方法， 所述方法包含以下步骤(a)提供复数个昆虫幼虫或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(c)使昆虫幼虫或蛹受到胁迫；(d)将所述等昆虫幼虫或蛹浸渍于所述溶液中持续一段适当时间以使其感染所述野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(e)培育经感染的幼虫或蛹以产生所述蛋白质；及(f)收集所述蛋白质。本发明亦提供一种用于实施本发明的感染方法的装置，其包含一用于承载病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撑昆虫幼虫或蛹的第一网；及一具有用于调整网高度的榫的第二网。
图1显示用于实施本发明方法的装置。1 容器；2 第一网；3 第二网；4 榫；5 病毒溶液；6 幼虫。图2显示对在接种4天后蚕体液内的CSFV E2累积的西方墨点分析结果。M =XP 蛋白质标准品；INF-15 进行INF方法感染15分钟的蚕；INF-0. 5 进行INF方法感染0. 5 小时的蚕；INF-I 进行INF方法感染1小时的蚕；INJ 以INJ方法感染的蚕；Std E2 :skE2 186ng ；CK 健康蚕。
具体实施例方式本发明提供一种以杆状病毒感染昆虫幼虫或蛹的方法。所述方法可一次性或批处理大量幼虫或蛹。此外，本发明方法可节约时间及人力，并具高感染率，可均勻、有效地感染幼虫或蛹。本发明提供一种用于以杆状病毒表达载体在昆虫中产生蛋白质的昆虫感染方法， 所述方法包含以下步骤
(a)提供复数个昆虫幼虫或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(c)使昆虫幼虫或蛹受到胁迫；(d)将所述等昆虫幼虫或蛹浸渍于所述溶液中持续一段适当时间以使其感染所述野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(e)培育经感染的幼虫或蛹以产生所述蛋白质；及(f)收集所述蛋白质。根据本发明，术语「感染」系指病毒感染，包括明显的病变，或仅为病毒在感染后于动物体内的复制及增殖。在一实施例中，检测出来自嵌合病毒基因组的表现蛋白质显示病毒构筑体具有感染性。根据本发明，术语「幼虫」系指自昆虫卵孵化成未成熟、无翅膀且常像蠕虫一样的昆虫发育阶段。经过若干次蜕皮后，主要造成其大小的变化，且最终蜕变成蛹(pupa)，由此羽化出成虫。术语「蛹」系指经历蜕变的昆虫的发育阶段。仅在彼等经历完全变态(complete metamorphosis)的全变态(holometabolous)昆虫中存在蛹阶段，全变态昆虫经历四个生命阶段胚胎、幼虫、蛹及成虫。在本发明的实施例中，昆虫幼虫或蛹为家蚕(Bombyx mori)、 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hilbner，甘蓝银纹夜蛾(callage looper))、加州苜蓿夜蛾(苜蓿环纹夜蛾)或草地黏虫(Spodoptera frugiperda)等昆虫的幼虫或蛹。较佳地所述幼虫为第三、第四或第五龄期的幼虫。根据本发明，「野生型杆状病毒」系指任何天然存在的杆状病毒。最常应用的杆状病毒属于核多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)。最常见杆状病毒为加州苜蓿夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)及家蚕核多角体病毒(BmNPV)。根据本发明，「杆状病毒表达载体」系指包含内源或外源基因或DNA的杆状病毒。 杆状病毒表达载体被广泛用在培养的昆虫细胞及昆虫幼虫中表现基因。用于外源基因表现的两种最常见的分离株为加州苜蓿夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)及家蚕核多角体病毒(BmNPV)。牛艮据本发明的一实施例，病毒浓度为IO4 101Qpfu/ml，较佳为IO5 l(fpfu/ml。基因较佳为转殖基因，其为拟表现于目标宿主(昆虫)的相关基因；或为标记基因 (报导基因)。较佳地，所述基因为外源转殖基因。此外，欲进行重组的基因较佳具有允许基因高度表现于昆虫细胞的启动子。当应用于宿主的载体最终制备完成后，在细胞中表现的启动子即作为转殖基因的启动子。此外，欲导入的基因不受特定限制，只要其可藉由以上提及的启动子表现即可；但就可利用性而言，以下相关的基因较佳各种遗传疾病、干扰素、 细胞激素、神经营养因子、非自身抗原基因、编码病毒(诸如流行性感冒病毒及肝炎病毒等)抗原的核苷酸序列、癌症抑制基因、反义序列(诸如Ras)、癌症基因、自杀基因(诸如胸苷激酶等)、抗生素基因、抗体基因或治疗性蛋白质基因。就此而言，以下文章以引用的方式 ^Λ^ Φ Journal of Clinical microbiology, 2009, % 3276-3282 M ；Appl Microbiol Biotechnol，2010，85 :459-470 ；PLoS ONE，2008 年 12 月，第 3 卷，第 12 期，e3933，第 1-7 页； 及 Molecular and Cellular Biology，1983 年 12 月，第 2156-2165 页。在一实施例中，家蚕杆状病毒表达载体系统可成功表现相关内源或外源基因。较佳地，外源基因可由各种原核及真核有机体及病毒分离得的。代表性实例包括许多人类基因在家蚕中表现，包括生长激素(hGH)、巨噬细胞群落刺激因子(hM-CSF)、β -干扰素(HuIF Ν-β)、人类α-干扰素的表现、及经编码表皮基因或脂动激素(adipokinetic hormone) 的昆虫信号肽的信号DNA序列置换的CD4(T细胞表面蛋白质T4)。蚕幼虫亦已用于高度表现及分泌具有生物活性的小鼠介白素-3及啮齿疟虫(Plasmodium berghei)的重组动合子(ookinete)表面抗原。重组全长角质细胞生长因子(KGF)已表现于包括家蚕的昆虫细胞宿主中(美国专利第5，863，767号、第5，843，883号及第5，773，586号)。另已使用家蚕核多角体病毒(BmNPV)将黄杆菌属(FlavcAacterium)的原核脯胺酰基肽链内切酶 (prolylendopeptidase)表现于昆虫细胞(美国专利第5，521，081号)。病毒成份亦可表现于家蚕杆状病毒表达载体系统。此等包括典型猪瘟病毒 (classical swine fever virus)、猪环状病毒(porcine circovirus)、猪流行性感冒病毒 (swine influenza virus)、假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)、猪冠状病毒(porcine coronavirus)、(foot-and-mouth disease virus)(NDV) ^D26的融合醣蛋白(F)；激酶活性v-erbB基因，即一种禽类红血球母细胞增多症病毒的致癌基因，其编码为表皮生长因子受体的截短形式的蛋白质；B型及C型肝炎病毒抗原；v-sis 蛋白质的特征；I型人类T细胞白血病病毒(HTLV-I)的重组蛋白质；及在昆虫(中国种家蚕)细胞中具有DNA结合活性的6b型人类乳突状瘤病毒CSFV E2基因产物。根据本发明，术语「胁迫」(stress)系指在不导致死亡下，使幼虫或蛹处于情绪或身体性压力下。在被胁迫的后，幼虫或蛹将恢复并正常表现蛋白质。本发明未预期地发现， 胁迫幼虫或蛹结合浸渍所述幼虫或蛹，可增进感染率。在本发明的实施例中，可藉由单独或组合使用以下手段来达成胁迫将幼虫或蛹保持在低温或高于正常生长温度但低于耐受温度的温度下、使幼虫或蛹饥饿、将幼虫或蛹置放于低压环境下、用辐射照射幼虫或蛹或用化学试剂处理幼虫或蛹。在一实施例中，幼虫或蛹被保持在以下低温下约2°C至约15°C、较佳约3°C至约15°C、更佳约4°C至约15°C、约4°C至约12°C、约5°C至约15°C、或约4°C至约 10°C、最佳约4°C至约6°C、约4°C至约8°C、或约4°C至约10°C。在另一实施例中，幼虫或蛹被保持在以下较高温度下约30 V至45 °C、较佳约32 °C至45 °C、约32 °C至42 °C、约32 °C至 40 V、约35 V至45°C、或约35°C至40°C。在另一实施例中，藉由用低剂量紫外线照射来处理幼虫或蛹。在另一实施例中，藉由将幼虫或蛹置放于低压环境中来对其进行处理。气压更佳被降低5%至50%。在另一实施例中，使幼虫或蛹禁食至少两天。较佳使幼虫或蛹禁食两天、三天或四天。根据本发明，「浸渍」昆虫幼虫或蛹系藉由将昆虫幼虫或蛹浸渍于杆状病毒溶液， 使其在不死亡的情况下感染杆状病毒来进行。病毒将进入幼虫或蛹的气孔(stoma)以进行感染。对幼虫或蛹的浸渍时间较佳为至少5分钟。浸渍时间范围较佳为5分钟至6小时， 更佳为10分钟至6小时、15分钟至1小时、30分钟至1小时、30分钟至2小时、或30分钟至3小时。具有此项技术的通常知识人员可基于物种、生理条件、异源基因种类等来调整浸渍时间及病毒浓度。根据本发明，培育幼虫或蛹以产生蛋白质。培育时间较佳为1. 5至5天、1. 5至6 天、1. 2至4天、1. 5至3天、或2至3天。有效培育条件及期间视此项技艺中已知的幼虫或蛹的种类、培育温度及蛋白质而调整并改变。举例而言，蚕的理想生长温度为约25°C至约28°C。本发明亦提供一种用于实施本发明的感染方法的装置，其包含一用于承载病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撑昆虫幼虫或蛹的第一网；及一具有用于调整网高度的榫的第二网。较佳地，所述装置进一步包含一用于降低大气浓度的真空构件。图1 为本发明装置的代表图式。所述装置包含用于承载病毒溶液5的容器1。第一网2位于所述容器上方以用于支撑昆虫幼虫或蛹，且第二网3具有用于调整网高度的榫4，以便幼虫或蛹6可位于第一网与第二网的间，并能适当地被病毒溶液浸渍。网较佳为不锈钢或塑料网。 本发明装置可批处理大量幼虫或蛹。本发明装置的尺寸可根据幼虫或蛹的量而调整。本发明的感染方法提供高感染率；感染率较佳高于85%、更佳高于90%。本发明的感染方法不需要大量人力且可同时感染大量幼虫或蛹。实例实例1家蚕核多角体病毒(BmNPV)对蚕幼虫的感染及感染率分析在第一天，藉由喷雾感染、注射感染、口服感染及本发明的感染方法，用具有红荧光蛋白质的重组家蚕核多角体病毒(BmNPV)接种五龄蚕幼虫0J03*0J04。未感染的蚕充当负对照组。在喷雾感染时，将2ml浓度为1 X 107pfu/ml的重组BmNPV溶液喷洒在蚕幼虫及桑叶上若干次；注射感染乃将1 X 106pfu/ml的BmNPV溶液经微量注射器注射至蚕幼虫的气孔中来进行。至于口服感染，乃对蚕幼虫喂养涂有lX107pfu/ml的重组BmNPV溶液的桑叶。对于本发明的感染方法，使家蚕幼虫处于4°C下15小时进行前处理。取出后恢复 1小时，再将幼虫浸渍于IXlOWml的BmNPV溶液中1小时。浸渍完成的家蚕置于含桑叶的饲育箱中，以惯行方式进行喂饲。在高湿度下，于25+/-2 V下培育感染后的家蚕。接种4天的后，测定各种感染方法的感染率(表现红荧光蛋白的幼虫数/全体经感染的幼虫数)，如下表1所示表1.家蚕以不同方法感染重组杆状病毒的感染率
权利要求
1.一种用于以杆状病毒表达载体在昆虫中产生蛋白质的昆虫感染方法，所述方法包含以下步骤(a)提供复数个昆虫幼虫或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(c)使昆虫幼虫或蛹受到胁迫；(d)将所述昆虫幼虫或蛹浸渍于所述溶液中持续一段适当时间以使其感染所述野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(e)培育经感染的幼虫或蛹以产生所述蛋白质；及(f)收集所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的感染方法，其中所述昆虫为家蚕(Bombyxmori L.)、粉纹夜蛾 CTrichoplusia ni Hiibner)、加州苜蓿夜蛾(Autographa californica，苜蓿环纹夜蛾 (alfalfa looper)) 5 ^ ^ (Spodoptera frugiperda)。
3.如权利要求1所述的感染方法，其中所述昆虫为家蚕(蚕)或粉纹夜蛾。
4.如权利要求1所述的感染方法，其中所述幼虫处于三、四或五龄期。
5.如权利要求1所述的感染方法，其中所述杆状病毒为加州苜蓿夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)或家蚕(蚕)核多角体病毒(BmNPV)。
6.如权利要求1所述的感染方法，其中所述基因为内源基因或外源转基因。
7.如权利要求1所述的感染方法，其中所述基因与以下相关疫苗蛋白质、抗细菌蛋白质、各种遗传疾病、干扰素、细胞因子、神经营养因子、非自身抗原基因、编码病毒(诸如流行性感冒病毒及肝炎病毒等)抗原的核苷酸序列、癌症抑制基因、反义序列(诸如Ras)、癌症基因、自杀基因(诸如胸苷激酶等)、抗生素基因、抗体基因或治疗性蛋白质基因。
8.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由单独或组合使用以下手段来进行将幼虫或蛹保持在低温或高于正常生长温度但低于耐受温度的温度下、 使幼虫或蛹饥饿、将幼虫或蛹放置于低压环境下、用辐射照射幼虫或蛹，或用化学试剂处理幼虫或蛹。
9.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由将所述幼虫或蛹保持在约2°C至约15°C的低温下来进行。
10.如权利要求9所述的感染方法，其中所述温度为约；TC至约15°C、更佳约4°C至约 15°C、约4°C至约12°C、约5°C至约15°C、或约4°C至约10°C、最佳约4°C至约6°C、约4°C至约8°C、或约4°C至约10°C。
11.如权利要求9所述的感染方法，其中所述温度为约4°C。
12.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由将所述幼虫或蛹保持在约30°C至45°C的高温下进行。
13.如权利要求12所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由将所述幼虫或蛹保持在以下高温下来进行约32V至45°C、约32V至42°C、约32V至40°C、约35V至 45°C、或约;35°C至 40°C。
14.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由以低剂量紫外线照射所述幼虫或蛹来进行。
15.如权利要求1所述的感染方法，其中对所述幼虫或蛹的浸渍时间为至少5分钟。
16.如权利要求1所述的感染方法，其中对所述幼虫或蛹的浸渍时间在5分钟至6小时范围内。
17.如权利要求1所述的感染方法，其中对所述幼虫或蛹的浸渍时间在以下范围内10 分钟至6小时、15分钟至1小时、30分钟至1小时、30分钟至2小时、或30分钟至3小时。
18.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由将幼虫或蛹置于具有降低气压的环境中来对其进行处理。
19.如权利要求18所述的感染方法，其中所述气压被降低5%至50%。
20.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由使所述幼虫或蛹禁食至少2天来进行。
21.如权利要求1所述的感染方法，其中步骤(c)中的所述胁迫是藉由使所述幼虫或蛹禁食两天、三天或四天来进行。
22.如权利要求1所述的感染方法，其中所述病毒的浓度为IO4 KTpfu/ml。
23.如权利要求1所述的感染方法，其中所述病毒的浓度为IO5 l(fpfu/ml。
24.一种用于实施如权利要求1所述的感染方法的装置，其包含一用于承载病毒溶液的容器、一位于所述容器上方且用于支撑昆虫幼虫或蛹的第一网；及一具有用于调整网高度的榫的第二网。
25.如权利要求M所述的装置，其中所述第一或第二网为不锈钢或塑料网。
全文摘要
本发明提供一种用于以杆状病毒表达载体在昆虫中产生蛋白质的昆虫感染方法，所述方法包含以下步骤(a)提供复数个昆虫幼虫或蛹；(b)提供一病毒溶液，所述病毒溶液包含野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(c)使昆虫幼虫或蛹受到胁迫；(d)将所述昆虫幼虫或蛹浸渍于所述溶液中持续一段适当时间以使其感染所述野生型杆状病毒或具有编码蛋白质的目标基因的杆状病毒表达载体；(e)培育经感染的幼虫或蛹以产生所述蛋白质；及(f)收集所述蛋白质。所述方法可同时处理大量的幼虫或蛹，达到批次感染，节省人力及高感染率的目标。
文档编号C12M1/00GK102286533SQ20111011332
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月4日 优先权日2010年6月18日
发明者余锡金, 卢美君, 廖久薰 申请人:财团法人工业技术研究院