水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用的制作方法

专利名称：水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的脂肪酸去饱和酶基因0sFAD6的核苷酸编码序列的克隆，序列的同源比对，重组表达载体构建，对水稻此基因内源的不同器官、组织的空间表达模式，高盐、氧化、低温胁迫处理后的表达模式变化进行分析鉴定所使用的方法，以及转化此基因于酵母INVScI细胞内，进行活细胞实验，分子模拟油酸氧化脱氢的过程及抗性改变研究。
背景技术：
不饱和脂肪酸作为构成植物膜脂的主要结构成分之一(Shah et al. , 1997)， 对生物体生长发育至关重要。不饱和脂肪酸的含量在大多数植物组织中占总脂肪酸含量的75%以上(戴晓峰，2007)。并且具有影响植物生长发育、应答各种环境信号等多种作用 (Klaus et al.，2002 ；代玉华等，2004)。不饱和脂肪酸脱氢酶的活性是影响各种不饱和脂肪酸合成的主要因素，在亚油酸和亚麻酸的合成过程中尤其重要。在拟南芥中研究成果较完整，目前，已经分别克隆到了 7 个编码脂肪酸脱氢酶的基因(/ 似，FAD3, FAD4, FAD5, FAD6, FAD7,FAD8) (Arondel et al. , 1992; Iba et al. , 1993; Yadav et al. , 1993; McConn et al. , 1994; Okuley et al.，1994)。是定位于叶绿体的ω -6不饱和脂肪酸脱氢酶基因，这个酶在单不饱和脂肪酸油酸的12碳和13碳之间引入1个双键变成多不饱和脂肪酸亚油酸，以此控制着植物细胞中大多数多不饱和脂肪的合成。不饱和脂肪酸含量越高，那么植物的抗寒性就越强。基因目前已在多个物种中有报道，在高等植物中，这些物种分别是拟南芥(Falcone, Gibson et al. 1994)，大豆(Hitz, Carlson et al. 1994)，甘蓝型油菜(Scheffler, Sharpe et al. 1997)，播娘蒿(Sanyuan, Ji et al. 2007)，油橄榄 (Banilas, Moressis et al. 2005)，马齿苋(Teixeira, Coelho et al. 2009)和菠菜 (Schmidt, Dresselhaus et al. 1994)。忧外，在MMkChlamydomonasreinhardtii 印叙有
基因的报道(Chi, Zhang et al. 2008)。本发明通过克隆水稻脂肪酸去饱和酶基因fls/^i^，对其时空表达模式及胁迫响应方式进行确定，并且对其脱氢功能进行验证，结果显示基因在各个器官中组成型表达在接受高盐和低温处理后，该基因在叶中的表达量下降而在根中的表达量上升；在接受氧化胁迫后，该基因在叶和根中表达量均上升。将《s/^i^转入酵母INVScI细胞后，检测酵母细胞内亚油酸与油酸含量变化。结果显示该基因的转入能够导致酵母细胞内产生亚油酸的生成，揭示该基因具有油酸去饱和酶的作用，从而为可控地改变水稻脂肪酸组成及最终为提高水稻耐冷以及其他胁迫抗性提高的分子育种提供基因来源与技术基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的水稻基因，还提供该水稻基因的蛋白编码序列， 并提供该水稻基因的应用。
本发明从水稻中克隆出一种新的水稻基因，命名为fls/^i^。为具有特定序列的 DNA分子，全长1365bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示，并将其与其他物种中脂肪酸去饱和酶基因家族中的成员进行同源性比对。本发明还提供这种水稻0sFAD6蛋白编码序列，有妨4个氨基酸残基，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。本发明还提供用于调取获得水稻样品中基因0sFAD6的一对核苷酸引物。该引物根据基因0sFAD6开放阅读框设计，使用此对引物对水稻样品cDNA进行PCR扩增可获得长 1365bp的基因片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。本发明从水稻中克隆出的基因fls/^i^是脂肪酸去饱和酶基因，该酶对体内生成的甘油脂其脂肪酸基团进一步脱氢去饱和，是油酸到亚油酸转变的限速酶。本发明还提供一种检测水稻基因fls/^i^在不同器官表达模式的方法，即利所述基因0sFAD6的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列SEQ ID NO. 5与SEQ ID N0. 6，对水稻cDNA样品进行Real-timePCR，然后检测该基因在根、种子、茎和叶中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA ；其步骤如下
(1)提取水稻器官的总RNA(Trizol，市售)；
(2)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，根据SEQID N0. 5与SEQ ID N0. 6设计引物，利用SEQ ID NO. 1的保守区段84bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。本发明还提供一种检测水稻基因0sFAD6在高盐、低温、氧化胁迫下的表达模式变化的方法，即将水稻进行高盐、氧化及低温胁迫处理后，提取水稻叶和根的总RNA ；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0. 5与SEQ ID N0. 6，进行定量PCR 检测。具体操作步骤如下
(1)将两周大的水稻苗置于0. 25M氯化钠溶液中，28° C培养Mh以进行高盐胁迫处理； 置于水中，10° C培养Mh以进行低温处理；置于6mM过氧化氢溶液中，28° C培养他以进行氧化胁迫处理；置于水中，28° C培养乩及24h作为对照。(2)提取前述个处理的水稻苗的叶和根中的总RNA(Trizol，市售)。(3)利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA，根据SEQ ID N0. 5与SEQ ID N0. 6设计引物，利用SEQ ID NO. 1的保守区段84bp作为PCR产物，进行实时定量PCR检测。本发明还提供一种将fls/^i^转入酵母INVkI并检测生成亚油酸的方法，其步骤如下
(1)使用SEQID N0. 7与SEQ ID N0. 8作为引物，从反转录得到的水稻cDNA中PCR得到两端带有损al/IAoI酶切位点及完整编码阅读框(SEQ ID NO. 1)的fls/^i^基因序列，并操作的连接酵母表达载体pYES NT (C) (.XbaI /ZAoI )，形成含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的载体；
(2)将转入pYES-NT(C) -0sFAD6载体与转pYES_NT (C)空载体的两个酵母菌株分别在含有gal的YPD培养基中培养16h，各取IOml菌液5000rpm离心得到酵母细胞；
(3)向离心得到的酵母细胞中加入2.5%硫酸/甲醇溶液1ml，震荡混勻后在80°C水浴中反应1. 5h。加入1. 5ml 0. 9%NaCl溶液和Iml正己烷，震荡混勻后5000rpm离心IOmin取
上清备用；(4)运用气相色谱仪器(HP6890 Plus Hewlett - Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亚油酸的含量。程序为起始温度150 °C 3 min后按照15°C/min的温度上升速率升温直至210°C，当气相色谱仪程序进行完毕后机器保持12min后分析结果。结果显示转入基因fls/^i^后，与转空载体对照组相比，可以在酵母中检测到亚油酸形成。本发明还提供一种检测转0sFAD6基因与转空载体的酵母INScI对数种胁迫的抗性改变的方法，其步骤为
(1)将转化后酵母在液体筛选培养基中培养2d，调整菌液浓度使二者的起始0D_在 1. 5左右。取20 μ 1菌液在等量液体乳糖诱导培养基中培养16h，测量两者的0D_，并按比例取出保证细胞数相等的菌液各约Iml左右，3000rpm离心5min，弃掉培养基，用Iml无菌水悬浮细胞。并以10倍逐级稀释6个浓度梯度。(2)将各梯度菌液分别取10 μ 1，滴于相应YPD培养基上。除低温外均在培养2d后照相观察。低温处理组在4° C暗处存放6周后置于恢复培养2d照相观察。结果显示转入基因fls/^i^后，与空载体对照组相比，酵母对胁迫的抗性有显著提高。以上结果表明，基因0sFAD6为可控地改变水稻脂肪酸组成及最终为提高水稻耐冷以及其他胁迫抗性的分子育种提供基因来源与技术基础。即该基因《s/^i^可用于改良水稻品种，以提高水稻耐冷性及其他胁迫抗性。本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。


图1 (A)为对0sFAD6推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析的结果图示。图1 (B)为图1 (A)的续。图2为最小进化法对FAD6成员进行系统进化分析图示。图3为水稻0sFAD6基因器官表达模式分析图示。图4为水稻基因fls/^i^在低温、高盐、氧化胁迫下的表达模式分析结果图示。其中，A、B为叶中；C、D为根中。图5为转入0sFAD6基因的酵母INVScI中亚油酸含量变化检测结果图示。图6为转入基因0sFAD6的酵母INVkI对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性改变图示。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1水稻基因0sFAD6的克隆。1. /K 稻品种 Nipponbare {Oryza sativa Japonica)在培养箱 (SPX-250-GB, Shanghai, China)中培养生长条件为光周期 16h /8h (L/D)，28°C。
2. RNA提取。取100毫克左右新鲜的水稻植物组织材料，液氮充分研磨。加1 ml Trizol试剂，涡旋15 s后室温放置5 min。加0.2 ml氯仿，去蛋白，12000rpm离心IOmin后上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混勻，室温放置10 min, 12k rpm离心lOmin， 弃上清，用DEPC处理过的水配制的75%乙醇1 ml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5_10 min, 溶于20 μ 1 DEPC水中，测OD值，电泳检测。3.基因的克隆。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用正向引物和反向引物进行PCR，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。实施例2水稻基因0sFAD6的同源性以及进化树分析。利用Clustal. X程序对0sFAD6推测编码氨基酸序列及其同源序列进行氨基酸序列相似性分析；结果显示，在0sFAD6中具有三个组氨酸簇，分别位于其氨基酸序列的78-82 位，208-218位和374-378位(图1)。同源性比对的结果显示，本基因存在三个保守的组氨酸簇结构域HDC*H ；E##*H**HH ；H**HH。以衣藻ChIamydomonasreiz7AariZiii中的FAD6基因为外类群，利用Mega4软件，最小进化法进行FAD6成员的系统进化分析(图2);所挑选的序列均系根据已发表的成果或通过BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)在线搜索获得。结果显示，各物种中的 FAD6，双子叶植物、单子叶植物分别聚类在了一起。这说明fls/^i^基因既有FAD6基因在序列上的共同性，亦存在着进化亲缘关系上的独立性。实施例3水稻0sFAD6基因器官表达模式分析。分别提取水稻种子、根、茎、叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成 cDNA，利用引物SEQ ID NO. 5与SEQ ID N0. 6，，进行实时荧光定量PCR检测(图3)。结果显示，fls/^i^在上述四个器官均有表达，其中在叶中表达最高。实施例4水稻基因0sFAD6在低温、高盐、氧化胁迫下的表达模式分析。对两周大的水稻幼苗分别进行10°C低温(Mh)、0. 25M氯化钠(Mh)、6mM(6h)过氧化氢的处理，并同无处理的对照组一起，分别提取根和叶中的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID N0. 5与SEQ ID N0. 6，进行实时荧光定量PCR检测。结果显示，在经过氧化处理后，根和叶中《s/^i^的表达量均有上升。在高盐和低温处理后，根中0sFAD6的表达量上升而叶中0sFAD6的表达量下降(图4)。实施例5转入0sFAD6基因的酵母INVkI中亚油酸含量变化检测。(1)使用SEQ ID N0. 7与SEQ ID N0. 8作为引物，从反转录得到的水稻cDNA中PCR 得到两端带有损al/IAoI酶切位点及完整编码阅读框(SEQ ID NO. 1)的fls/^i^基因序列。 并连接至酵母表达载体PYES-NT(C)中。并通过测序验证，转化酵母。(2)将转入pYES-NT (C) ~0sFAD6载体与pYES_NT (C)空载体的两个酵母菌株分别在含有gal的YPD培养基中培养16h，各取IOml菌液5000rpm离心得到酵母细胞。(3)向离心得到的酵母细胞中加入2. 5%硫酸/甲醇溶液1ml，震荡混勻后在80°C 水浴中反应1. 5h。加入1. 5ml 0. 9%NaCl溶液和Iml正己烷，震荡混勻后5000rpm离心IOmin 取上清备用。(4)运用气相色谱仪器(HP6890 Plus Hewlett-Packard, Wilmington, Del.)分析油酸和亚油酸的含量。程序为起始温度150 °C 3 min后按照15°C/min的温度上升速率升温直至210°C，当气相色谱仪程序进行完毕后，机器保持12min后分析结果。
结果显示，与转入空载体组相比，转入fls/^i^基因的酵母细胞中能够检出亚油酸存在(图5)，证明表达的0sFAD6能够将酵母中油酸催化形成亚油酸。实施例6转入基因fls/^i^的酵母INVScI对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性改变。(1)分别将转入pYES-NT (C)空载体及转入pYES_NT (C) ~0sFAD6的INVScI酵母在 YPD培养基中28° C培养至OD600达到1. 5左右。(2)取20 μ 1菌液加至IOml含有gal的& U—培养基中，培养16h。(3)测量两者的0D·，并按比例取出保证细胞数相等的菌液各约Iml左右， 3000rpm离心5min，弃掉培养基，用Iml无菌水悬浮细胞。并以10倍逐级稀释6个浓度梯度。(4)将各梯度菌液分别取10 μ 1，滴于相应YPD培养基上。除低温外在培养 2d后照相观察。低温处理组在4° C暗处存放6周后置于培养2d照相观察。结果显示，转基因的酵母细胞与转空载体的酵母相比，其对低温、氧化、盐及乙醇胁迫耐受性均有提高(图6)。参考文献
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权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的基因0SFAD6,全长 136^DP，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.一种如权利要求1所述的基因《s/^i^编码的蛋白质分子，其特征在于，该序列编码妨4个氨基酸残基，分子量44. 35kDa，等电点为9. 24，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
3.一对用于调取获得水稻样品中基因0sFAD6的引物序列，其特征在于，根据权利要求 1所述基因0sFAD6开放阅读框设计，序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
4.一种检测水稻基因fls/^i^mRNA表达模式的方法，其特征在于利用权利要求1所述基因fls/^M的的核苷酸序列作为设计探针引物的保守区段，调取其序列的引物序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，对水稻cDNA样品进行Real-timePCR，然后检测该基因在根、种子、茎和叶中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA ；其步骤如下提取水稻不同器官的总RNA ；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，进行定量PCR检测。
5.一种检测水稻在高盐、氧化、低温胁迫处理后，基因0sFAD6表达含量变化的方法， 其特征在于具体步骤为将水稻进行高盐、氧化及低温胁迫处理后，提取水稻叶和根的总 RNA ；利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA,利用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6，进行定量PCR检测。
6.如权利要求1所述的基因《s/^i^在改良水稻品种中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种水稻脂肪酸去饱和酶基因OsFAD6编码序列及其应用。具体包括基因OsFAD6的克隆、含有该基因的表达载体构建、基因OsFAD6表达模式分析，低温、高盐、氧化处理后OsFAD6的表达量的变化分析。半定量PCR检测结果显示OsFAD6在植物的各个器官中均有表达，其中在叶中表达量最高。在氧化处理后，OsFAD6在根和叶这两个器官中的表达量均有上升；在低温和高盐胁迫处理后，OsFAD6在叶中的表达量下降而在根中的表达量上升。本发明还公开基因OsFAD6在转入酵母INVScI后，可以改变酵母的亚油酸含量并提高对高盐、乙醇、氧化及低温胁迫的抗性。该基因OsFAD6可用于植物品种改良。
文档编号C12N9/02GK102206656SQ201110113370
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者明凤, 王尧峰, 石金磊 申请人:复旦大学