来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与脱饱和酶有关的方法和组合物，所述脱饱和酶调节长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中双键的数量和位置。特别地，本发明涉及利用外源的脱饱和酶和编码这样的酶的核酸，来改善植物产品和部分中ω-3脂肪酸分布的方法和组合物。在特定的实施方式中，利用的外源脱饱和酶是半片藻属物种Δ5脱饱和酶。还提供的是改善的大豆油组合物，其具有衍生自带有感兴趣基因的植物的EPA。
【专利说明】来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用
[0001] 本申请是申请日为2009年10月14日和发明名称为“来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用”的200980140691.2号发明专利申请的分案申请。
_2] 对相关申请的引用
[0003]本申请要求2008年10月14日提交的美国临时申请N0.61 / 105，316的优先权，通过引用将其完全合并在本文中。
[0004]序列表的引入
[0005]作为当前的公开的一部分的序列表包括标题为“M0NS219W0_ST25.txt”的36KB计算机可读文件，其包含通过EFS-Web提交的本发明的核苷酸和/或氨基酸序列。序列表的内容通过完全引用合并在本文中。
[0006]发明背景
[0007]1.发明领域
[0008]本发明一般地涉及脱饱和酶，其调节长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中双键的数量和位置。特别地， 本发明涉及利用△ 5脱饱和酶和编码这样的脱饱和酶的核酸来改变脂肪酸分布。
[0009]2.相关技术的说明
[0010]在大多数生物体中脂肪酸生物合成的主要产物是16-碳和18-碳化合物。这些脂肪酸的链长度与不饱和度的相对比例在物种之中广泛地变化。例如,哺乳动物主要产生饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而大多数高等植物生产具有一个、两个或三个双键的脂肪酸，后两者包括多不饱和脂肪酸(PUFA)。
[0011]两种主要的PUFA家族是ω-3脂肪酸(也称为“n-3”脂肪酸)，例子是二十碳五烯酸(EPA，20: 5，n-3)，以及ω-6脂肪酸(也称为“n-6”脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20: 4，n-6)。PUFA是细胞的质膜和脂肪组织的主要成分，在其中它们可以分别以磷脂和甘油三酯的形式存在。PUFA是哺乳动物中适当的发育所必需的，特别是在婴儿脑部的发育中，以及对于组织形成和修复是必需的。花生四烯酸是类花生酸类物质的合成的主要前体，类花生酸类物质包括白细胞三烯、前列腺素和凝血噁烷，其也在炎症过程中起到重要作用。
[0012]几种失调响应于脂肪酸的治疗。补充PUFA已经显示了降低血管成形术后再狭窄的几率。证据表明，PUFA可能涉及钙代谢，表明PUFA可能在骨质疏松症的治疗或预防以及肾脏或泌尿道结石的治疗或预防中是有用的。健康效益的大部分证据适用于长链ω-3脂肪、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸(DHA，22: 6，n-3)，它们在鱼类和鱼油中存在。
[0013]PUFA，例如，亚油酸(LA，18: 2，Λ 9，12)和 α -亚麻酸(ALA，18: 3, Δ9,12,15)被认为是膳食中的必需脂肪酸，因为哺乳动物缺乏合成这些酸的能力。LA通过Λ12-脱饱和酶从油酸(0Α，18: 1，Λ 9)产生，而ALA通过Λ 15-脱饱和酶从LA产生。然而，当摄食时，哺乳动物具有代谢LA和ALA以形成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的η_6和η_3家族的能力。在哺乳动物中，LC-PUFA的形成由Λ 6脱饱和的步骤限速，这个步骤将LA转化成GLA,将ALA转化成SDA。许多生理学和病理学的状况已经显示了甚至进一步地降低这种代谢步骤，因而，降低LC-PUFA的产生。为了克服限速步骤和提高EPA的组织水平，人们可以消费大量的ALA。作为选择，通过饮食补充EPA或DHA来绕过Λ 6-脱饱和可以有效地减轻许多与低水平的PUFA相关的病理性疾病。然而，如以下更详细地阐述的，PUFA的当前可用的来源不是理想的。
[0014]主要的重要长链PUFA包括DHA和ΕΡΑ，其主要在不同类型的鱼油中存在，以及ARA，其在丝状真菌例如被孢霉属(Mortierella)中发现。对于DHA，存在着商业生产的许多来源，包括多种海洋生物、从冷水海洋鱼类获得的油、以及蛋黄级分。然而，从天然来源商业生产PUFA存在几个缺点。PUFA的天然来源倾向于具有高度异质的油组成。因而从这些来源获得的油可能需要大量的纯化来分离出一种或多种期望的PUFA，或来产生富集了一种或多种PUFA的油。
[0015]其他天然的限制也希望获得生产PUFA的新方法。天气和疾病可以导致来自鱼类和其他海洋来源的产量的变动。生物体例如被孢霉属的大规模的发酵是昂贵的。天然的动物组织含有很低数量的ARA，并且难以被加工。
[0016]发明概沭
[0017]本发明的一个方面提供了编码多肽的分离的核酸，所述多肽能够在碳5使脂肪酸分子脱饱和。这些核酸可以用于转化细胞或修饰植物的脂肪酸组成或植物产生的油。本发明的某些实施方式提供了分离自具有独特的脱饱和酶活性的半片藻属物种(Hemiselmisspp.)的分离的多核苷酸序列。在本发明的某些进一步的实施方式中，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%的序列同一性、包括与这些序列具有至少约80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、98%和99%同一性的多肽。本领域技术人员将认识到，由于这些序列是相关的，给定的序列可能同时与这些多肽序列的超过一种享有75%或更高的序列同一性。在某些实施方式中，本发明的半片藻属物种的脱饱和酶进一步被限定为ω-3 Λ 5脱饱和酶(即，具有ω-3底物偏爱的脱饱和酶)。
[0018]在另一个方面，本发明提供了编`码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性，`所述多核苷酸包含选自以下的序列:(a)编码SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列的多核苷酸；(c)在5XSSC、50%甲酰胺和42°C的条件下与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或其互补物杂交的多核苷酸；(d)编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少75%、85%、95%、98%或99%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和e)编码具有至少一种以下氨基酸基序的多肽的多核苷酸:
【权利要求】
1.一种用多核苷酸分子转化的转基因植物或植物部分的细胞，所述多核苷酸分子包含选自以下的核酸序列: a)编码SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列的核酸序列； b)SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列；和 c)编码与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽序列具有至少95%的序列同一性、具有在碳5使脂肪酸分子脱饱和的脱饱和酶活性的多肽的核酸序列， 其中所述多核苷酸分子与异源启动子可操作地连接。
2.权利要求1的转基因植物或植物部分的细胞，所述植物选自芥花、菜苔、含油种子油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿和高粱。
3.权利要求1的转基因植物或植物部分的细胞，进一步包含编码脂肪酸脱饱和酶或延伸酶的至少一种另外的多核苷酸。
4.权利要求3的转基因植物或植物部分的细胞，进一步包含编码Λ6脱饱和酶、Λ 6延伸酶、Λ 18延伸酶、Λ 15脱饱和酶、Δ 9延伸酶、Λ 8脱饱和酶、Δ 17脱饱和酶、Λ 4脱饱和酶或C20延伸酶的多核苷酸。
5.权利要求1的转基因植物的子代植物的细胞，其中所述子代植物包含所述多核苷酸分子。
6.从权利要求1的植物或植物部分获得的商业产品，其中所述产品包含所述多核苷酸分子或由所述多核苷酸分子编码的多肽，其中所述商业产品是食物或饲料。
7.权利要求6的商业产品,其中所述食物或饲料是油、青忙饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。
8.权利要求6的商业产品，其中所述商业产品包含EPA、ARA和/或DHA。
9.一种生产食物或饲料组合物的方法，包括步骤: (a)获得根据权利要求1的转基因植物或植物部分；和 (b)生产所述食物或饲料组合物。
10.权利要求9的方法，其中所述食物或饲料是油、青贮饲料、粗粉、谷粒、淀粉、细粉或蛋白质。
【文档编号】C12N5/10GK103756972SQ201410049582
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2009年10月14日 优先权日:2008年10月14日
【发明者】V·厄辛, B·弗罗曼, S·斯克瑞恩, L·勒曼 申请人:孟山都技术公司