用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了用于检测肺炎衣原体98KDa?MOMP基因的引物组和探针及其应用。该引物组和探针由具有SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的探针组成。本发明提供的引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDa?MOMP基因相结合，在采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDa基因时，显著提高了检测的特异性和灵敏度，能够应用于制备检测肺炎衣原体98KDa?MOMP基因的试剂。
【专利说明】用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其应用。
【背景技术】
[0002]肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae, CP)是一种严格真核细胞内寄生的原核细胞微生物，与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属。首株肺炎衣原体是于1965年从台湾省一名儿童的眼部用鸡胚分离出的，暂名为TW-183T (小T示原型株)，1983年又从西雅图一名患咽炎的大学生咽部分离出一株AR-39，因其一些生物学性状类似于鹦鹉热衣原体，所以当时被归于鹦鹉热衣原体种中TffAR组，后经深入研究，根据其独特的超微结构及基因和特异性抗原分析，于1989年被定为衣原体属中一个新种，定名为肺炎衣原体，后来根据2004年公布的伯杰氏细菌分类学手册，已被更名为肺炎嗜衣原体。
[0003]肺炎衣原体基因组大小约1.2Mbp、由21个Pmp基因、一个III型分泌毒力因子系统基因、3个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和2个磷脂酶-D样蛋白基因组成。其染色体DNAG+C mol%含量为40%，但与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体的同源性小于10%，限制性内切酶图谱极不相同。世界不同地区分离得到的肺炎衣原体不同株DNA的同源性可达94%以上，限制性内切酶图谱基本一致，标准株为TW-183和AR-39。肺炎衣原体只有一个血清型，代表株为TWAR。肺炎衣原体具有属特异性抗原和种特异性抗原，属特异性抗原主要有两个抗原决定簇表位，一个是肺炎衣原体LPS核心多糖的第三个KDO残基，一个是分子量为39.5KDa的主要外膜蛋白(Μ0ΜΡ)，这两个抗原决定簇均对甲醇敏感，与其它衣原体种间存在交叉；肺炎衣原体的种特异性抗原为9`8KDa的主要外膜蛋白(Μ0ΜΡ)，该抗原对丙酮敏感，并不与沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗血清发生交叉反应。
[0004]肺炎衣原体的感染极为普遍，无显著的性别和地区差异，一年四季均可发生，主要引起人类的呼吸道感染和非典型性肺炎，与人口密度呈正相关，临床上多以隐性、持续性感染的形式存在，其反复迁延导致难以治疗的并发症。研究发现肺炎衣原体与哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病等心脑血管疾病的发生和发展密切相关。肺炎衣原体的感染率随着年龄的增加迅速上升，儿童感染率在20%左右，青壮年感染率可达50-60%，老年的感染率为70-80%。肺炎衣原体通过呼吸道分泌物进行人与人传播，在家庭、学校、军队以及其他人口集中的工作区域可存在小范围的流行。目前，肺炎衣原体已是继肺炎链球菌和流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎(community acquiredpneumonia, CAP)的主要病原体，肺炎衣原体急性感染率占23%，肺炎病人仅占感染者的小部分，70-90%为亚临床表现。肺炎衣原体感染的潜伏期为15-23天，可引起上呼吸道感染，如鼻窦炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。呼吸道感染多数表现为咽痛、发热、咳嗽，病情通常较轻，有自限性。老年肺炎衣原体肺炎病人症状可能较为严重，有时甚至致死，尤其是在合并细菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病时，其致死几率大大增加。因此，肺炎衣原体感染早期诊断对于尽早发现和治疗肺炎衣原体感染性疾病非常重要。
[0005]目前对肺炎衣原体的实验室诊断方法主要有病原体分离培养技术、血清学诊断技术和核酸检测技术等方法。因为肺炎衣原体是一种极难培养的衣原体，其抵抗力较弱，对室温或冰冻敏感，难以从临床标本中分离培养成功，传代也比较困难，所以不适合采用病原体分离培养技术进行诊断。目前临床上常用的肺炎衣原体的检测方法主要是检测特异性抗体的方法。由于病原体进入机体进行复制、抗原刺激到产生抗体需要一定时间，导致这种方法仍不能满足早期病原体确诊的需要，进而不能满足进行早期积极治疗的临床需求。
[0006]实时荧光定量PCR技术是近些年来迅速发展起来的一种核酸检测技术。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。因为实时荧光定量PCR技术的检测物为致病病原体基因核酸，所以能够准确检测处于疾病各个时期的病原体。目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学可以分为两种:荧光探针和荧光染料。由于Taqman探针具有特异性强、准确性高、对引物及试剂要求不高等优点，使该类型的荧光探针常用于实时荧光定量PCR。为了实现将实时荧光定量PCR技术应用于肺炎衣原体的检测，很有必要提供一种特异性高、准确性高的肺炎衣原体核酸检测试剂盒。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针及其 应用。该引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDa MOMP基因相结合，在采用实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因时，显著提高了检测的特异性和灵敏度，能够应用于制备检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的试剂。
[0008]为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案:
[0009]本发明提供了一种用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的引物组和探针，其由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。
[0010]本发明提供的引物组和探针是根据肺炎衣原体的种特异性抗原所对应的基因的保守区域，即98KDa MOMP基因的保守区域,设计的。首先使用Primer Premier5.0软件手动涉及出多组上游引物序列、下游引物序列和探针序列，之后将每组序列导入PrimerExprssV3软件中，分析引物和探针共同参与反应时的参数是否符合要求，最终获得三组引物和三条探针。通过引物和探针筛选试验，确定了最佳的引物组和探针的组合。实验数据证实，本发明提供的引物组和探针能够特异性与肺炎衣原体98KDa MOMP基因相结合，能够应用于检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因。
[0011]优选地，本发明提供的引物组和探针中的探针为TaqMan探针。
[0012]更为优选地，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为6-FAM (6-羧基荧光素)、TET (四氯-6-羧基荧光素)、HEX (六氯-6-甲基荧光素)或JOE (2, 7_ 二甲基-4, 5_ 二氣_6_竣基突光素)。
[0013]在本发明的一些实施例中，本发明提供的引物组和探针中TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为6-FAM。
[0014]优选地，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的3’端标记的淬灭基团为MGB (Miner Groove Binder)或BHQl (Black Hole Quencherl)。
[0015]在本发明的一些实施例中，本发明提供的引物组和探针中的TaqMan探针的5’端标记6_FAM、3’端标记MGB。
[0016]本发明还提供了一种引物组和探针在制备检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的试剂中的应用，该引物组和探针由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ IDN0:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。
[0017]本发明还提供了一种检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的试剂盒，其包括引物组和探针，该引物组和探针由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。
[0018]本发明提供的试剂盒中包括本发明提供的引物组和探针，实验数据表明，本发明提供的试剂盒能够显著提高肺炎衣原体检测的特异性和灵敏度，并且具有较低的检出限。本发明提供的试剂盒中还包括尿嘧啶DNA糖基化酶，实验数据表明本发明提供的试剂盒能够有效防止待测样品、检测试剂、扩增体系中肺炎衣原体核酸或其98KDa MOMP基因的污染，降低假阳性率。
[0019]优选地，本发明提供的试剂盒还包括dNTP/dUTP混合溶液、尿嘧啶DNA糖基化酶和Taq DNA聚合酶，其中该dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成。
[0020]由于肺炎衣原体的感染极为普遍，导致在肺炎衣原体核酸检测时容易造成待测生物样品、检测所用试剂、扩增体系被污染，进而使检测结果出现假阳性。本发明提供的试剂盒中的dNTP/dUTP混合溶液和尿嘧啶DNA糖基化酶，形成了 dUTP-尿嘧啶DNA糖基化酶防污染体系。尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶，也称为UDG酶)的作用机理为:在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的dT全部被dU取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UDG酶能选择性断裂单链和双链DNA中dU碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染产生的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。实验数据表明，本发明提供的试剂盒能够有效防止肺炎衣原体核酸及其扩增产物的污染，降低肺炎衣原体核酸检测时的假阳性率。
[0021]优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为 50nmol/L ~200nmol/L。
[0022]在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为lOOnmol/L。
[0023]优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为 50nmol/L ~200nmol/L。
[0024]在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为lOOnmol/L。
[0025]优选地，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为 50nmol/L ~200nmol/L。
[0026]在本发明提供的一些 实施例中，本发明提供的试剂盒中具有SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的探针的浓度为50nmol/L。[0027]优选地，本发明提供的试剂盒中dNTP/dUTP混合溶液的浓度为0.01 μ mo I/L~300 μ mol/L ;其中，dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成；dNTP与dUTP的物质的量比为3:2。
[0028]在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中dNTP/dUTP混合溶液的浓度为200 μ mol/L，其中dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成；dNTP与dUTP的物质的量比为3:2。
[0029]优选地，本发明提供的试剂盒中的尿嘧啶DNA糖基化酶和Taq DNA聚合酶的酶活力比为1:1~100。
[0030]在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中尿嘧啶DNA糖基化酶与TaqDNA聚合酶的酶活力比为1:10。
[0031]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的试剂盒，由CP PCR反应液A、CP PCR反应液B、样本处理液、阳性对照和阴性对照组成；
[0032]其中CP PCR反应液A由如下组分组成:
[0033]
【权利要求】
1.用于检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的引物组和探针，其特征在于，由具有SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物和具有SEQID NO:3所示核苷酸序列的探针组成。
2.根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述探针为TaqMan探针。
3.如权利要求1或2所述的引物组和探针在制备检测肺炎衣原体98KDaMOMP基因的试剂中的应用。
4.一种检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的引物组和探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括dNTP/dUTP混合溶液、尿嘧啶DNA糖基化酶和Taq DNA聚合酶，其中所述dNTP由dATP、dCTP和dGTP按照物质的量比为1:1:1组成。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述具有SEQID NO:1所示核苷酸序列的上游引物的浓度为50nmol/L~200nmol/L。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述具有SEQID NO:2所示核苷酸序列的下游引物的浓度为50nmol/L~200nmol/L。
8.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述具有SEQID NO:3所示核苷酸序列的探针的浓度为50nmol/L~200nmol/L。
9.一种非诊断目的的检测肺炎衣原体98KDa MOMP基因的方法，其特征在于，包括以下步骤:` 步骤1:制备扩增体系，所述扩增体系包括生物样品、具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物、具有SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的TaqMan探针、Taq DNA聚合酶； 步骤2:所述具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、所述具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游引物和所述具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针与肺炎衣原体98KDa MOMP基因片段结合； 步骤3:所述Taq DNA聚合酶以所述肺炎衣原体98KDa MOMP基因片段为模板，延伸核苷酸序列至所述具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针结合部位,所述Taq DNA聚合酶水解所述具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的TaqMan探针的5’端核苷酸残基后，释放荧光报告基团，产生荧光； 步骤4:重复所述步骤2和所述步骤330次~40次，收集所述荧光； 步骤5:转化所述荧光为荧光信号，以循环数-荧光信号的变化量的对数作图得扩增曲线后，根据荧光阈值得Ct值； 步骤6:比较所述Ct值和对照品Ct值，判断所述生物样品中肺炎衣原体98KDa MOMP基因的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤I之后步骤2之前还包括: 用尿嘧啶DNA糖基化酶预处理所述扩增体系。
【文档编号】C12N15/11GK103773884SQ201410049236
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】柳辉 申请人:深圳康美生物科技股份有限公司