预测不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的分子方法【专利摘要】本发明公开了一种预测不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的分子方法，其特征在于，包括：（1）获得棉花抗黄萎病性状的优势等位基因位点；（2）获得棉花各材料含有优势等位基因的平均效应值，根据平均效应值的大小来预测棉花材料抗黄萎病性状强弱。本发明通过分析与抗黄萎病性状显著关联的优势等位基因的效应值大小来鉴定材料的抗病性，与现有技术相比，不需要对棉花进行抗病性鉴定既可以实现对不同材料间抗病性大小的比较，大大提高了抗病材料的选择效率。【专利说明】预测不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的分子方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种棉花抗病性状强弱的方法，尤其涉及一种预测棉花抗黄萎病性状强弱的分子方法，属于棉花抗黄萎病性状强弱的分子预测方法。【
背景技术：
】[0002]棉花黄萎病是危害棉花最大的世界性病害之一，被称为棉花的“癌症”。实践证明，防治棉花黄萎害最经济、安全、有效的方法就是培育和推广抗病品种。抗病品种的选育已成为目前棉花育种的主要方向。然而，近年来我国棉花抗黄萎病育种进展缓慢，主要原因是我国现有棉花品种资源的遗传基因狭窄，缺乏高抗黄萎病的棉花资源，与病原菌小种的快速变异不相适应。在棉花抗黄萎病性状的筛选上，目前主要是在大田环境条件下利用黄萎病病圃对育种材料进行抗黄萎病鉴定。然而，目前棉花育种中对抗黄萎病性状的选择效率十分有限，表现为不同年份、不同棉区筛选的抗黄萎病材料的抗病性表现存在较大差异，难以筛选到真正的抗黄萎病材料。这主要是由于以下几个原因:1.植株成熟早晚的差异:棉花黄萎病是土传性病害，病原物由根部侵入棉株内部，成熟早晚不同的棉株，根系发育早迟也不同，早熟棉株根系发育较早，比晚熟棉株在鉴定时有带菌更多的趋势，晚熟棉株抗性就有比早熟棉株过高估计的可能；2.试验小区间的干扰:遗传试验材料都相邻种在一起，如果一个抗病材料和一个高度感染的材料相邻种植，因病菌是土传性的，抗性植株能从邻近感病株接受大量菌种，感病株输出大量菌种，远多于它所能收到的，抗病材料的抗性将受到低估，而感病材料的抗性则大大高估了；3.接种量:接种物的浓度和接种量也影响鉴定的正确性，浓度和接种量过低将导致抗性的过高估计，过高则可能混淆抗、感材料间的差异，原来抗病的材料也难以表现其抗性；4.检测的时间:棉花对黄萎病抗性的表现也决定于环境条件，温度是黄萎病抗性表现的重要环境因素，对棉花黄萎病检测的有利温度是25~28°C，过高或过低温度条件都足以影响检测的正确性。[0003]近年来，随着分子标记技术的发展，利用分子标记筛选与目标性状基因紧密连锁的分子标记，可以大大提高性状选择的准确性，并且不受环境因子影响。[0004]目前在棉花中，利用分子标记对棉花抗黄萎病性状进行选择大多是对来自抗、感亲本杂交的后代分离群体进行选择，这些分子标记仅仅是作为一种辅助手段，在选择效果上仅能选择到具有抗性亲本背景的材料，而这些材料间的抗病性大小仅仅利用分子标记无法判断，要判断各个材料抗病性的大小还需要借助常规的抗病鉴定；尽管本发明人在前期也发明了可用于棉花抗黄萎病性状辅助选择的分子标记，但这些标记仅能用于区分抗病基因型和感病基因型，无法用于多个材料间抗病性大小的比较。【
发明内容】[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有的用于棉花抗黄萎病性状辅助选择的分子标记无法用于多个材料间抗病性大小比较的缺陷，提供一种判断棉花抗黄萎病性状强弱的分子方法，该方法可用于判断不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱。[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:[0007]—种预测不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的分子方法，包括:[0008](I)获得棉花抗黄萎病性状的优势等位基因位点；(2)获得棉花各材料含有所述优势等位基因的平均效应值，根据平均效应值的大小来预测棉花材料抗黄萎病性状强弱。[0009]本发明人首先构建了棉花关联作图群体，利用该群体对棉花抗黄萎病性状进行了关联分析，获得棉花抗黄萎病性状的优势等位基因位点；[0010]更具体的，本发明通过以下方法获得了棉花抗黄萎病性状的41个优势等位基因位点:[0011](I)从棉花种质资源中期库中选择系谱不同、地理来源不同的158份陆地棉优异种质组成棉花关联作图群体；[0012](2)将158份材料的种子于人工生长箱中进行培养，待子叶平展时，提取各材料幼苗的DNA；[0013](3)选择棉花AD基因组参考图谱(见网站http://www.cottondb.0rg/cg1-bin/cmap/viewer)h.的所有SSR标记对步骤2中的DNA进行多态性扫描，筛选表现多态性的SSR标记；[0014](4)利用多态性标记对棉花关联作图群体进行基因型分析,利用PowerMarker软件(商业途径获得)对关联群体进行遗传多样性分析，利用STRUCTURE2.2软件(商业途径获得)进行群体结构分析；结合对关联作图群体进行温室抗黄萎病鉴定和人工黄萎病病圃鉴定结果，利用TASSEL2.1软件(商业途径获得)中的GLM模型进行抗黄萎病性状的关联分析，最后检测到41个与棉花抗黄萎病性状显著关联的分子标记位点，每个标记位点所含有的等位基因数目为2-4个，统计每个标记位点的各个等位基因在关联群体中的分布情况，同时计算含有各个等位基因的材料所表现出的平均黄萎病病指，其中，平均黄萎病病指最低的等位基因确定为该标记位点的优势等位基因，同时将该黄萎病病指作为该优势等位基因的效应值。该方法涉及到41个与棉花抗黄萎病性状显著关联的优势等位基因，这41个优势等位基因所对应的分子标记名称、序列、等位基因大小及效应值为表1所示。[0015]所述的41个优势等位基因位点为BNL2599-120，NAU5233-590,NAU3592-185,NAU3828-310,NAU3212-360,BNL3255-240，NAU3201-240,NAU3499-550,DPL0222-580,NAU3074-190,CIR196-300，NAU980-180,NAU5428-490,BNL1034-400,NAU5064-310,BNL2646-130,BNL2441-250,NAU2627-460,BNL3319-210，TMB1114-220,NAU2887-460，NAU5120-170,BNL1606-220,JESPR101-140，NAU2859-280，BNL4069-100，JESPR0001-500，CIR364-250,NAU2894-190,BNL3646-230,NAU3574-210，BNL3649-200,NAU2954-460，JESPR274-190,NAU1047-175,NAU4912-360,NAU5463-190，Gh268_190,Gh454_180，NAU3563-220或73686-3-190。[0016]本发明进一步分析棉花各材料含有的不同优势等位基因及其数目，利用SEQIDN0.1-SEQIDN0.82所示的多态性引物对有待预测的棉花材料进行PCR扩增，根据扩增结果对群体进行分子标记基因型分析，根据基因型分析结果统计每个材料含有的优势等位基因及其数目，根据每个优势等位基因的效应值，计算每份材料含有的所有优势等位基因的平均效应值；利用所计算出的优势等位基因的平均效应值的大小来评价材料的抗病性强弱，实现不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的判断。[0017]本发明利用41个优势等位基因的分子标记对158份材料进行分析表明，每份材料含有的优势等位基因数目为6-34个，不同材料间优势等位基因平均效应值的范围为36.92-39.91。其中，平均效应值小于38的材料共有44份，经人工病圃抗黄萎病鉴定证实，这44份材料中有30份材料的抗黄萎病病指在30以下，其中包括5份病指20以下的抗病材料；平均效应值大于39的材料共有25份，经人工病圃抗黄萎病鉴定证实，这25份材料中有18份材料的抗黄萎病病指在50以上。选择平均效应值效应小于38的那些材料，那么将有68.18%(30/44)的几率选择到黄萎病病指在30以下的抗(耐)病材料；同时，可以淘汰掉平均效应值效应大于39的那些材料，则淘汰掉感病材料的几率为72%(18/25);因此，本发明方法将优势等位基因的平均效应值小于38的棉花材料预测为抗黄萎病或耐黄萎病材料，将优势等位基因的平均效应值大于39的棉花材料预测为黄萎病感病材料，可以有效的将抗(耐)病材料(黄萎病指35以下)与感病材料(黄萎病指35以上)区分开，从而实现比较不同材料抗病性强弱的目的。[0018]本发明方法可以实现基于优势等位基因分析的棉花抗病性强弱的预测，同时也为棉花抗黄萎病育种中抗病性的选择提供了分子工具。与以往的分子标记辅助选择方法不同，本发明方法不需要对棉花进行抗病性鉴定就可以实现对不同材料间抗病性大小的比较，大大提高了抗病材料的选择效率。利用这些分子标记对不同棉花材料进行抗病性大小的预测，其预测到抗(耐)病材料的几率可以达到68.18%，预测感病材料的几率可以达到72%。[0019]传统抗黄萎病鉴定主要是在大田环境条件下利用黄萎病病圃对育种材料进行抗黄萎病鉴定，鉴定所需的时间较长，且受环境影响较大。本发明方法通过分析与抗黄萎病性状显著关联的优势等位基因的效应值大小来鉴定材料的抗病性，与现有技术相比，本发明方法不需要对棉花进行抗病性鉴定既可以实现对不同材料间抗病性大小的比较，大大提高了抗病材料的选择效率。【专利附图】【附图说明】[0020]图1为对关联作图群体进行温室和大田人工病圃抗病性鉴定的表型变异的频率分别图。[0021]图2为含有158份材料的关联作图群体基于212对多态性引物的群体结构。【具体实施方式】[0022]实施例1棉花关联作图群体的构建及抗黄萎病性状测定[0023]本实施例中的关联作图群体为158份系谱不同、地理来源不同的陆地棉优异种质，该群体材料从棉花种质资源中期库中选择。分别采用温室和人工黄萎病病圃两种方法对群体进行抗病性鉴定，其中温室鉴定采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法(朱荷琴等)，人工病圃鉴定采用田间人工病圃成株期鉴定方法(朱荷琴等，2007)。抗病性数据分析结果表明:两种鉴定方法得到的抗病性数据结果表明抗病性属于数量性状均成连续性正态分布，且变异范围很广，说明抗病性为数量性状(图1)。[0024]实施例2关联作图群体材料叶片总DNA提取[0025]将158份材料的种子于人工生长箱中进行培养，待子叶平展时，利用CTAB法提取各材料幼苗的DNA,具体方法参照1993年Paterson等(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPandPCRanalysis.PlantMolBiolR印，1993，11:122-127)报道的方法提取。[0026]实施例3多态性引物的筛选[0027]根据网站(http://www.cottondb.0rg/cg1-bin/cmap/viewer)公布的棉花AD基因组参考图谱，选择该图谱上的所有SSR标记，根据这些SSR标记的引物序列，通过生物公司合成这些SSR引物。共合成SSR引物1482对。筛选结果表明，有212对SSR引物的扩增产物在158份材料间存在长度多态性差异。多态性筛选程序如下:[0028](I)从群体中选择24份系谱差异较大的材料的DNA，作为筛选引物的模板。[0029](2)PCR反应体系:【权利要求】1.一种预测不同棉花材料间抗黄萎病性状强弱的分子方法，其特征在于，包括:(1)获得棉花抗黄萎病性状的优势等位基因位点；(2)获得棉花各材料含有所述优势等位基因的平均效应值，根据平均效应值的大小来预测棉花材料抗黄萎病性状强弱。2.按照权利要求1所述的分子方法，其特征在于:所述的优势等位基因位点为BNL2599-120,NAU5233-590，NAU3592-185，NAU3828-310，NAU3212-360，BNL3255-240，NAU3201-240,NAU3499-550,DPL0222-580,NAU3074-190,CIR196-300，NAU980-180,NAU5428-490,BNL1034-400，NAU5064-310,BNL2646-130,BNL2441-250,NAU2627-460，BNL3319-210,TMBl114-220,NAU2887-460，NAU5120-170，BNL1606-220，JESPR101-140,NAU2859-280,BNL4069-100，JESPR0001-500,CIR364-250，NAU2894-190，BNL3646-230，NAU3574-210,BNL3649-200，NAU2954-460,JESPR274-190,NAU1047-175,NAU4912-360，NAU5463-190,Gh268_190，Gh454_180，NAU3563-220，73686-3-190。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:利用SEQIDN0.1-SEQIDN0.82所示的多态性引物对有待预测的棉花材料进行PCR扩增，根据扩增结果对群体进行分子标记基因型分析，根据基因型分析结果统计每个材料含有的优势等位基因及其数目，根据每个优势等位基因的效应值，计算每份材料含有的所有优势等位基因的平均效应值。4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于:所述棉花材料优势等位基因平均效应值的范围为36.92-39.91。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:将优势等位基因的平均效应值小于38的棉花材料预测为抗黄萎病或耐黄萎病材料；将优势等位基因的平均效应值大于39的棉花材料预测为黄萎病感病或易感材料。【文档编号】C12Q1/68GK103740856SQ201410049099【公开日】2014年4月23日申请日期:2014年2月12日优先权日:2014年2月12日【发明者】王红梅,赵云雷,陈伟,李运海,龚海燕,桑晓慧申请人:中国农业科学院棉花研究所