专利名称：一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肺炎衣原体是人类呼吸道疾病的重要病原体，可引起急慢性呼吸道疾病，调查显示，社区获得的肺炎、支气管炎和鼻窦炎5-10%由肺炎衣原体引起。经常引起成人及青少年的非典范肺炎，亦可引起支气管炎、咽炎及扁桃体炎等急性呼吸道传染。肺炎衣原体呼吸道感染的临床表现不典型，通常以咽痛和音哑起病，几日至一周后出现咳嗽，与其他呼吸道疾病相比，自起病至就医的时间以肺炎衣原体感染为最长，因此病初时的低热，检查时多已降至正常，异常呼吸音和鼻窦区压痛为最常见的特征，白细胞计数大多正常，血沉增速，X线胸片常显示单侧节段性肺炎，类似非典型性肺炎，严重者病变较广泛，甚至波及双肺，也可 伴有胸膜炎或胸腔积水。热带国度地区高于北部发财国度，有的地区5 14岁年龄组发病率高于成年人。据统计在引起肺炎的病因中，是继肺炎球菌、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第三位紧张病原体。美国报告每年发病约30万例，而鹦鹉热衣原体引起的肺炎仅约150例。香港亦有雷同报告，在呼吸系统传染的患者中，检测血清肺炎衣原体抗体阳性率为54. 8%，紧张传染者为24. 8%，抗体效价多I : 256，而鹦鹉热衣原体抗体之阳性率仅为
0.9%，且多为非近期传染。亦发觉肺炎衣原体传染与冠芥蒂、心肌梗死及膨胀型心肌病等心血管疾病及脑血管疾病等的产生明显相干。本病埋伏期10 65天。贫乏特异性临床表现，无症状传染和轻症患者常见。I.急性呼吸系传染是其紧张表现，如咽炎、喉炎、鼻窦炎、中耳炎、支气管炎及肺炎，以肺炎最常见占50%以上，支气管炎次之。老年人以肺炎常见，20岁以下的青少年，则多为支气管炎及上呼吸道传染。常以发烧、满身不适、咽痛及声音撕哑起病，数日后呈现咳嗽，此时体温多已平常。亦可引起支气管炎、支气管哮喘，原有支气管哮喘的患者传染肺炎衣原体后，可加重病情。还可引起咽炎、鼻窦炎及中耳炎，此多与肺炎及支气管炎同时存在。病变平常均较轻，但尽管应用抗生素治疗，病情规复较慢，咳嗽及满身不适等症状可连续数礼拜至数月。病情紧张者可因原根本疾病加重或因产生并发症如细菌传染而死亡。2.伤寒型少数患者表现为高热、头痛、相对缓脉及肝脾年夜，易并发心肌炎、心内膜炎和脑膜炎，重症患者呈现昏倒及急性肾枯竭，表现雷同重型伤寒。3.肺炎衣原体传染与动脉硬化、冠芥蒂及急性心肌梗死之发病的相干性据统计50%的慢性冠芥蒂及68%急性心肌梗死患者血清中，可检出抗肺炎衣原体抗体(IgG和IgA)，比较组仅17%。 用肺炎衣原体单克隆抗体免疫组化染色或用PCR法，在冠状动脉或自动脉的硬化斑中，可检出肺炎衣原体抗原或其DNA，证实在病灶内存在病原体，而在平常动脉构造中未检出。Gloria等报告用 单克隆抗体免疫荧光法，别离在自动脉和冠状动脉硬化的标本中检出肺炎衣原体抗原，阳性率别离为13%和79%，平常自动脉为4%。故觉得肺炎衣原体传染与动脉硬化的产生相关，是产生冠芥蒂的危机身分，对冠芥蒂患者应注意除外肺炎衣原体传染，并觉得防治肺炎衣原体传染有年夜略裁减冠芥蒂的产生。据报告，动脉粥样硬化、冠芥蒂及外周动脉栓塞等心血管病患者，常归并肺炎衣原体传染，用罗红霉素等年夜环内酯类抗生素治疗，并经过议定2 7年的随访，可明显低落心血管病的进展。同时发觉有肾枯竭的冠芥蒂患者，其肺炎衣原体的传染率更高，且更易促进心血管病的进展。4.其他可引起虹膜炎、肝炎、心内膜炎、脑膜炎及结节性红斑等。通常情况下的诊断方法有
因为本病贫乏特异性临床表现，故对有肺炎或上述临床表现的患者，如疑及本病，可做病原学或免疫学检测确诊。实行室检测
I.血象血白细胞计数多平常，重症患者可升高。血沉多增快。2.病原学查抄是确诊本病的靠得住方法。临床诊断不常用。(I)直接涂片涂片后用Giemsa或免疫荧光单克隆抗体染色，检测肺炎衣原体包涵体及原体，方法轻巧，但阳性率低。(2)构造培养法鸡胚卵黄囊接种因检出阳性率低已罕用。可用细胞培养法，取咽拭子或收集下呼吸道标本，用ffiP-2细胞(喉癌细胞)或Hela229细胞培养24 h，再用肺炎衣原体特异性单克隆抗体染色，检测特异性包涵体。 方法较繁杂，且较其他衣原体检出率低。3.免疫学检测是常用的诊断方法。(I)直接免疫荧光法用肺炎衣原体单克隆抗体染色，直接免疫荧光法检测肺炎衣原体抗原，方法特异灵活且急剧轻巧。(2)微量免疫荧光(MIF)法检测肺炎衣原体抗体，特异性IgM滴度彡I : 16和(或)IgG彡I 512或双份血清滴度4倍以上升高者，均可诊断急性传染。如IgM彡I 16或IgG彡I 512，则为既往传染。本方法特异性灵活性均较高，且可用于区分原发传染和再传染，是如今最常用且最灵活的血清学方法。但要清除血轮回中类风湿因子的感化。(3)补体联合抗体检测滴度彡I 64和(或)双份血清滴度4倍以上升高者，均可诊断急性传染，但不能用于早期诊断，亦不能区分为哪种衣原体传染。4. PCR法检测肺炎衣原体DNA，灵活性更高，且可和其他种衣原体区分，其特异性灵活性高于其他方法。据统计，PCR法检出率为50% 55%，而直接免疫荧光法及涂片法别离为24% 27%和6% 10%。用连接聚合酶链反响(LCR)检测，可进一步进步伶俐性及检出率，但尚未在临床应用。据报告，PCR-EIA法是一种急剧、轻巧的酶免疫测定法，能进步PCR对肺炎衣原体DNA的扩增检测效果，优于PCR法，更优于培养法。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可以快速定性检测血清样本中的肺炎衣原体IgM抗体的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗，所述肺炎衣原体抗原浓度为l-2mg/ml，用SDS-PAGE测定；所述羊抗鼠IgG抗体浓度为l_3mg/ml ;所述鼠抗人IgM单抗浓度为5-30 Mg /mL，用SDS-PAGE测定。本发明的第二个目的是提供了一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤
(1)反应膜的制备用磷酸盐缓冲液将重组Cpn-Ag稀释到包被浓度为I. Omg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2. Omg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存；
(2)鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备将标记浓度为5-30iig/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min,弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn — IgM金结合物垫,将Cpn — IgM金结合物垫干燥保存；
(3)切割装配在反应膜所在胶板的上部揭去I.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0. 9cm的不干胶纸，贴上Cpn — IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1_，制成反应板，再用切条机切成4_试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。进一步的，所述肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法中，所述步骤(I)和(2 )的干燥条件为37 °C干燥3小时。进一步的，所述肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法中，其特征在于所述步骤(2)的鼠抗人IgM单抗的标记浓度为15y g/ml。本发明的有益效果为肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需几十分钟就可以判读结果。胶体金快速检测试纸条，以多表位的重组抗原为原料，具有操作更加简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高的特点，可单份检测，易于普及，对于肺炎衣原体IgM的检测和控制效果明显。
图I为本发明提供的一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备工艺流程不意图。
具体实施方式
、
一、生产工艺条件的确定
1.胶体金颗粒的选择
1.1原理根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。可以通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。操作在IOOmL纯化水中加入0. ImL 10%氯金酸煮沸、在搅拌条件下加入不同体积的1%柠檬酸三钠溶液，煮沸5分钟，制备不同条件的胶体金颗粒，待其自然冷却回复至原体积。用鼠抗人IgM单抗标记不同颗粒的胶体金，然后再用企业参考品进行检测。其结果如表I :
表I :1%柠檬酸三钠用量的选择实验(粒径选择)
液体加入顺序单位1234 纯化水毫升 ICO100100100
1% 氯金酸微升 1000100010001000
1%抒樣酸三钠毫升I1.41.82.0
'胶体金外观:颜色:紫色清亮紫红清亮鲜红清亮:橙红清亮'
波峰范围—L nm548535 —丨―525518
用制备的四种胶体金标记鼠抗人IgM单抗与重组Cpn-Ag包被的反应膜配比，再用企业参考品血清进行检测。如表2:
表2不同胶体金标记鼠抗人IgM单抗与重组Cpn-Ag膜配对检测结果
、.检测结果
胶体金編号.III
Pl P2 P3 NI i N2 NS
IIill"
I_ I _I__++ I_+++++士_j___
2[ + J ++ — +++ 士 — I _
3+++ +++— I ——
............................4 ' ± . + — ++ - I —二.......................
结果分析由表2结果可知，3号制金条件制的胶体金，颜色鲜红、清亮，无混浊及漂浮物，标记后的胶体金其特异性、敏感性较好。故选择制金条件为1/万氯金酸100ml+l. 8ml1%柠檬酸三钠
2.胶体金标记鼠抗人IgM单抗条件的优化
2.1原理根据胶体金标记技术特性，将胶体金中细微的金颗粒与纯化的鼠抗人IgM单抗稳定结合，形成红色的胶体金鼠抗人IgM单抗结合物。胶体金标记最适pH值的选择采用目测法。取若干个I. 5mL试管,分别加入I mL胶体金；用0. IM K2CO3或511盐酸将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10 ;取96孔酶标板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100 M L加入孔中，重复三次；每孔分别加入3 M L浓度为I mg/mL的鼠抗人IgM单抗,混合,室温下放置40 min ;每孔分别加入20 M L浓度为10%NaCl溶液，混匀，室温下放置2小时；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低PH(X)。调整pH为X-1. 0、X-0. 5、X、X+0. 5、X+1. 0，重复以上步骤，保持红色的最低pH值即为标记的最佳pH值。结果如表3 :
表3胶体金标记鼠抗人IgM单抗最适PH值的选择实验结果
权利要求
1.一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗,其特征在于 所述肺炎衣原体抗原浓度为l_2mg/ml，用SDS-PAGE测定； 所述羊抗鼠IgG抗体浓度为l-3mg/ml ； 所述 鼠抗 人 IgM 单抗 浓度 为 5-30Mg /mL，用 SDS-PAGE 测定。
2.根据权利要求I所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)反应膜的制备用磷酸盐缓冲液将重组Cpn-Ag稀释到包被浓度为1.0mg/ml，将羊抗鼠IgG抗体稀释成浓度为2. Omg/ml，将两种包被液分别划到硝酸纤维素膜上，将已包被的硝酸纤维素膜干燥后保存； (2)鼠抗人IgM单抗金结合物垫的制备将标记浓度为5-30iig/ml的鼠抗人IgM单抗与胶体金进行偶联制得胶体金标记鼠抗人IgM单抗溶液，以转速为12000r/min离心40min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/2，然后用混合液浸泡金标垫，制备成Cpn — IgM金结合物垫,将Cpn — IgM金结合物垫干燥保存； (3)切割装配在反应膜所在胶板的上部揭去I.5cm宽的不干胶纸，粘贴上粗纤维滤纸，使纸的下部压住反应膜，揭去反应膜下部的0. 9cm的不干胶纸，贴上Cpn — IgM金结合物垫，并且金结合物垫的上部压住反应膜1mm，再揭去金结合物垫下部的的不干胶纸，贴上样品垫，样品垫的上部压住金结合物垫的下部1_，制成反应板，再用切条机切成4_试纸条，进行装卡后，装入铝箔袋内制成产品。
3.根据权利要求2所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤(I)和(2)的干燥条件为37°C干燥3小时。
4.根据权利要求2所述的肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的鼠抗人IgM单抗的标记浓度为15ii g/ml。
全文摘要
本发明公开了一种肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒，包括硝酸纤维素膜检测线上包被的重组肺炎衣原体抗原、质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体和金标垫上包被的胶体金标记的鼠抗人IgM单抗，肺炎衣原体抗原浓度为1-2mg/ml，用SDS-PAGE测定；羊抗鼠IgG抗体浓度为1-3mg/ml；鼠抗人IgM单抗浓度为5-30g/mL，用SDS-PAGE测定。本发明的有益效果为肺炎衣原体IgM抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需几十分钟就可以判读结果。胶体金快速检测试纸条，以多表位的重组抗原为原料，具有操作更加简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高的特点，可单份检测，易于普及，对于肺炎衣原体IgM的检测和控制效果明显。
文档编号G01N33/531GK102749446SQ201210252950
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月21日 优先权日2012年7月21日
发明者李习荣 申请人:北京中检安泰诊断科技有限公司