基于脂肪酸合成酶的基因型判断牛肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少的方法和基于该结果...的制作方法

专利名称：：基于脂肪酸合成酶的基因型判断牛肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少的方法和基于该结果...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过基于脂肪酸合成酶(Fattyacidsynthase;FASN)的基因型，判断肌肉内脂肪所含脂肪酸的组成中尤其是油酸的多少，从而判断是否是具有好味道的牛或牛肉的方法。而且，还涉及基于相同判断结果，选择并育种可以获得具有好味道的牛肉的牛的方法。本发明提供了特别是在畜产(牛的饲养，繁殖，育种和改良等)和牛肉生产加工等领域中有效的技术。
背景技术：
：牛肉的肌肉内脂肪所含的脂肪酸中包含最多的是具有l8个碳原子的l价不饱和脂肪酸(油酸)，尤其是，据报道黑毛日本品种的肉与外国品种的肉相比，油酸含量显著高(参照非专利文献l)。一般而言，可以说黑毛日本品种的肉与外国品种相比，具有日本人喜好的好口味，人们认为其中一个重要原因是与日本牛肉所含的油酸含量比外国品种的肉要高相关(参照非专利文献2)。为了测定包含油酸的牛肉的脂肪酸组成，需要通风装置等大规模的实验设备，而且为了获得正确的数据，熟练的技术必不可少。而且，还包括以下诸多问题由于这种测定需要许多时间，因此难以在短时间内处理大量试样，而且由于在脂肪酸提取等阶段中使用大量有机溶剂，因此无法忽视对测定者的健康的不良影响等。另一方面，现在，日本国内的肉用牛育种是基于日本食用肉分级协会(日本食肉格付协会)规定的胴体等级进行的。但是，与食用味道相关的脂肪酸组成等特性，由于必须经历上述复杂的理化分析，因此与胴体等级不同，无法容易地获得数据。因此，迄今为止，并没有以这种特性作为改良目标，只要这种状况一直延续，不难想象今后在其中采用的可能性很低。因此，现在需要开发出用简单的装置就可以实施，而且不需要熟练的技术，基于基因的碱基序列判断牛肉的脂肪酸组成的方法。迄今为止，已经将通过利用硬脂酰-CoA去饱和酶(SCD)的基因型来确定牛肉的脂肪融点和脂肪酸的不饱和度，从而评价牛肉的食用味道的技术专利化(专利文献1)。记栽于专利文献l中的利用SCD基因对牛肉食用口味的判断，是基于与牛肉中所含脂肪的融点之间的关系，以及与脂肪酸的不饱和度的关系进行的。此时的脂肪酸组成的不饱和度，是通过牛肉中所含脂肪酸的饱和脂肪酸总含量与1价不饱和脂肪酸总含量的比计算得到的，无法得知脂肪酸各个种类有多少。可是，作为合成牛肌肉内的脂肪酸的酶，已知有脂肪酸合成酶(FASN)基因。该酶是承担脂肪酸合成的酶中的一种，其牛(Bostaurus)来源的全基因序列和推定的氨基酸序列记载于下述非专利文献3中。但是，到目前为止并不了解基于脂肪酸合成酶的基因型进行脂肪酸组成的确定方法。非专利文献1:MayS.G.etal.，ComparisonofsensorycharacteristicsandfattyacidcompositionbetweenWagyucrossbredandAngussteers.,MeatScience35,289-298(1993)非专利文献2:松原等人，市售牛肉的等级划分分析评价和消费倾向，兵库县农业技术中心研究报告(畜产编)34，10-10-15(1998)非专利文献3:DDBJ/EMBL/GenBank数据库登录号AF285607专利文献l:特开2004-261014号公报
发明内容发明要解决的问题如上所述，牛的肌肉内脂肪的脂肪酸组成与牛肉的食用味道相关，可以说这其中尤其是油酸含量高的牛肉的食用味道好，因此如果可以基于牛特定基因的碱基序列确定油酸的多少，则可以容易地检测该牛肉的食用味道，而且，通过将该信息利用于育种选择中，还可以改良以前几乎不可能的牛肉的食用味道。本发明鉴于上述事实而形成，其目的在于提供一种基于牛的基因型判断肌肉脂肪中所含脂肪酸组成的方法，尤其是用于简单且高精度地判断油酸含量的多少的判断方法，而且还提供一种基于上述判断结果更为客观地判断牛肉的食用味道的方法。用于解决问题的方法
技术领域：
：本发明人鉴于上述问题，尤其是着眼于前述脂肪酸合成酶基因，对相同基因与牛肌肉内脂肪中所含脂肪酸組成，尤其是与油酸含量的多少的关系进行了积极的研究，其结果发现(1)在上述基因的2个位置存在单核苷酸多态性(SNP)，(2)这些单核苷酸多态性在它们之间只相隔14个碱基，非常接近，且存在2种单倍型，而且(3)这两个单倍型之间，牛肌肉脂肪中所含油酸含量显著不同，从而完成了本发明。记载于专利文献l中的利用SCD基因的牛肉的食用味道的判断中，无法了解前述脂肪酸的各个种类的多少。与之相对，如果根据本发明的利用FASN基因的基因型的方法，不仅可以确定牛肉中所含脂肪酸的不饱和度，还可以确定脂肪酸的各种类的多少。也就是说，可以判定提示了例如与牛肉的食用味道之间的关系的以油酸为代表的具有18个碳原子的1价不饱和脂肪酸的含量的多少，而且还可以判断其它的脂肪酸(C14，C16的各脂肪酸；包括饱和和不饱和)的各自的含量。在牛的身体中可以生物合成的脂肪酸中，现在提示了上述油酸与牛的食用味道之间的关系，伴随今后的研究的进展，也可能会逐渐了解被认为影响食用味道的油酸之外的脂肪酸，或对人类健康好(或不好)的脂肪酸等。本发明中，在可以判断这种脂肪酸的各个种类的多少这一方面，可以说比专利文献1的发明更好。也就是说，本发明包括作为产业上有用的方法和产品的下述发明。权利要求1中涉及的本发明是基于通过检测下述<1>和/或<2>的碱基测定的脂肪酸合成酶的基因型判断牛的肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少的方法。<1>相当于序列表序列号1所示的碱基序列中的多态位点的第16024位的碱基，即腺噪呤(A)或鸟嘌呤(G)<2>相当于相同碱基序列中多态位点的第16039位的碱基，即胸腺嘧咬(T)或胞嘧咬(C)权利要求2所涉及的本发明是脂肪酸为油酸的权利要求1所述的方法。权利要求3涉及根据本发明的权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于含有下述工序(a)和(b):以从被检体牛中制备的基因组DNA或cDM作为模板，通过基因扩增反应，扩增含有上述<1>和<2>的碱基的基因区域的工序通过用限制性内切酶消化通过前述工序(a)获得的扩增片段，根据其是否切断判断脂肪酸合成酶的基因型的工序。权利要求4涉及的本发明是根据权利要求3所述的判断方法，其特征在于上述工序(a)的基因扩增反应，使用由序列表的序列号3中所示的碱基序列构成的正向引物和由序列表的序列号4所示的碱基序列构成的反向引物，通过聚合酶链式反应进行，而且在上述工序(b)中使用Hhal和Ncil作为限制性内切酶。权利要求5涉及的本发明是权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于使用DNA芯片检测上述<1>和/或<2>的碱基。权利要求6涉及的本发明是权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于使用具有热循环仪和荧光检测器的聚合酶链式反应装置检测上述<1>和/或<2>的碱基。权利要求7涉及的本发明是权利要求1-6中任一项所述的判断方法，所述牛是肉用品种。权利要求8涉及的本发明是权利要求1-6中任一项所述的判断方法，所述牛是作为肉用也可以被利用的奶牛。权利要求9涉及的本发明是可以在权利要求1，2,5-8中任一项所述的判断方法中使用的基因多态性检测用试剂盒，其含有与序列表的序列号1所示的碱基序列中的含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域特异性结合的核苷酸探针。权利要求10涉及的本发明是可以在权利要求l-8中任一项所述的判断方法中使用的基因多态性检测用试剂盒，其含有用于通过基因扩增反应特异性扩增序列表的序列号1所示的碱基序列中的含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的引物。权利要求11涉及的本发明是用于通过基因扩增反应特异性扩增含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的引物。权利要求12涉及的本发明是特异性结合舍有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的核苷酸探针。权利要求13涉及的本发明是基于权利要求1-8中任一项所示的判断方法的结果判断是否是可以获得具有良好食用味道的牛肉的牛的方法。权利要求14涉及的本发明是基于权利要求1-8中任一项所示的判断方法的结果选择和育种可以获得具有良好食用味道的牛肉的牛的方法。发明效果如果根据本发明，基于脂肪酸合成酶(FASN)基因型，不仅可以判断牛肉中所含脂肪酸的不饱和度，还可以检测脂肪酸的各种类的多少。而且，还提供了基于此判断是否是产生食用味道优异的牛肉的牛等，进而进行牛的育种和品种改良等的方法，其具有很多有用性。而且，相比以往的牛肉的脂肪酸组成测定又复杂又需要熟练，根据本发明，只要使用热循环仪，电泳槽等操作简便，操作不怎么需要熟练的实验器具，就可以判断脂肪酸含量的多少。而且，可以有效且高精度地判断大量试样。而且，现在为了测定现在脂肪酸组成，需要屠宰后釆集试样，但是如果根据本发明，则可以从活体(通过采血或毛根采集等)得到DNA试样，不用等肉牛的伺养时间到达大概30个月时，就可以判断脂肪酸组成。附图简述图1:是说明牛脂肪酸合成酶基因的第34外显子处发现的2个位的图。X'"''、^图2:是表示使用PCR-RFLP法的本发明的判断方法中的电泳结果的图。符号说明图1中，向右方向的白色箭头表示正向引物(序列表的序列号1)，向左方向的白色箭头表示反向引物(序列表的序列号2)。本发明的最佳实施方式以下，就本发明的具体实施方式，技术范围等进行详细的说明。(l)本发明的判断方法权利要求l中记载的方法提供一种如上所述，基于脂肪酸合成酶的基因型判断牛的肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少的方法。本说明书中，所谓"牛"是指欧洲牛(Bostaurus)。这种欧洲牛包括黑毛日本品种(JapaneseBlack)等日本牛，和荷斯坦(Holstein)种，海福特(Hereford)种，阿伯丁安格斯(AberdeenAngus)种，利木赞(Limousin)种等欧洲家养牛。作为判断对象(被检体)的"牛"可以是肉用品种(肉牛)或可作为肉用利用的乳用品种(奶牛)中的任一种。而且，在本说明书中所谓"脂肪酸合成酶(FattyAcidSynthase:以下也存在简称为"FASN"的情况)"是在生物体中合成脂肪酸的牛来源的酶。序列表的序列号1中显示非专利文献3所示的FASN基因的全基因DNA序列，序列号2中显示由相同序列编码的FASN蛋白质的氨基酸序列。序列号1的DNA序列和序列号2的氨基酸序列与非专利文献3所示的序列相同，但在后述的单核苷酸多态性(SNP)的注释上不同。图1示包括上述FASN基因的第34外显子和第35外显子的基因组DNA部分序列的模式图。图中大矩形表示各外显子，小矩形表示其所夹的各内含子区域。图中的各数字表示以序列表的序列号1所示的FASN基因的基因组DNA序列的第l位的核苷酸作为基点，各位置相当于第几位的核苷酸。图1的下侧显示本发明人进行详细的调查研究的结果是，伴随FASN基因(不含非翻译区域)上发现的2个氨基酸取代的单核苷酸多态性(SNP)。本发明人关注并详细分析了相同基因，因为通过对源自黑毛日本品种和利木赞(Limousin)种的F2代群体的遗传分析，将有关脂肪酸组成的基因区域定位在牛第19号染色体上。在相同区域中FASN基因存在于与更强性状连锁的部分，根据其功能推测与脂肪酸组成的关联。因此在分析相同基因时，测定F2代群体的P世代(作为始祖的世代)黑毛日本品种和利木赞(Limousin)种各两头总计4头中的FASN基因cDNA的全序列，详细研究其差异。图1下侧所示的2个位点的单核苷酸多态性(SNP)因而在这4头中最先被观察到。以下，这两个位点的单核苷酸多态性(SNP)按照从5，端起始的顺序分别称为以下<1>、<2>的碱基。<1>相当于序列表序列号1所示的碱基序列中的多态位点的第16024位的碱基即腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)<2>相当于相同碱基序列中多态位点的第16039位的碱基即胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)序列表的序列号1的碱基序列中，上述2个多态部位的碱基用通用代码"r"或"y"表示。而且，分配给上述<1>，<2>的碱基的编号表示从序列表的序列号1所示的FASN基因的基因组DM序列的第l位的核苷酸开始计数相当于第几位。另一方面，由于cDNA序列中不含内含子部分，处于只有外显子部分相连的状态，FASN基因的cDNA序列中相当于上述<1>，<2>碱基的碱基编号与上述<1>，<2>中记载的编号当然不同。因此，在本发明的判断方法中，在使用判断对象牛的cDNA作为判断试样时，要解释表示上述<1>,<2>的碱基的各位置的编号，需考虑第34外显子以前的内含子序列。而且，非专利文献3的作者已经调查了序列表的序列号1所示的序列，该序列是从任意一种欧洲牛品种中分离的FASN基因的基因组DM序列，在其它的牛品种中，也存在序列号1所示的序列中通过突变等发生1-数个碱基的缺失或插入等的可能性。此时，要解释表示上述<1〉、<2>碱基的各个位置的编号，需考虑这种碱基的缺失或插入等。如图1所示，可知上述<1>、<2>的碱基均包含于第34外显子中，一起包含于开放阅读框中。认识到根据<1>的碱基对应于腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，导致编码氨基酸发生取代。上述〈1〉的碱基为腺嘌呤(A)时，编码的氨基酸为苏氨酸(Thr),所述碱基为鸟嘌呤(G)时，编码的氨基酸为丙氨酸(Ala)。而且，认识到根据〈2〉的碱基为胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，也导致编码氨基酸发生取代。上述〈2〉的碱基为胸腺嘧啶(T)时，编码的氨基酸为色氨酸(Trp)，所述碱基为胞嘧啶(C)时，编码的氨基酸为精氨酸(Arg)。如此，上述<1>、<2>的碱基取代使氨基酸取代发生。而且，以下多个基因分析的结果表明，上述<1>、<2>的单核苷酸多态性(SNP)并非相互独立的关系，它们实质上连锁。即上述的〈1〉的碱基为腺噪呤(A)时，上述〈2〉的碱基为胸腺嘧啶(T)，与之相对上述〈1〉的碱基为鸟嘌呤(G)时，上述<2>的碱基为胞嘧啶(0。本发明人，为了方便起见，随着各个碱基取代，用编码的氨基酸的单个字符表示这两种单倍型。也就是说，将(i)的单倍型称为苏氨酸(Thr-T)-色氨酸(Trp-W)型(TW型)，而且将(ii)的单倍型称为丙氨酸(Ala-A)-精氨酸(Arg-R)型(AR型)。但例外的是，似乎也存在<1>的碱基和<2>的碱基的组合并非如上所述的个体。非专利文献3中记载的FASN基因碱基序列中，相当于上述〈"的部分的碱基为腺嘌呤(A)纯合子，与之相对，相当于上述<2>的部分的碱基是胞嘧啶(C)纯合子。由于在本发明人的调查范围内，这种情况不存在，因此不能确定与具有这种单倍型时的性状的相关性。因此，如果存在具有这种单倍型的牛时，无法判断牛肉的肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少。但是，本发明人对于国内的黑毛日本品种和荷斯坦(Holstein)种的各种雄牛组，黑毛日本品种肥育牛组以及国内圏养的肉用外国品种组等，总共超过1000头的样品进行了FASN基因型的分类，由于并没有检测出在<1>的碱基和<2>的碱基间发生重组的个体，尽管不能断言一定不存在，但人们认为可以想象日本国内检测出具有发生这种重组的FASN基因型的牛的可能性极低(非专利文献3的作者是海外的研究组，但他们难以想到测定日本国内的牛的碱基序列，并将它们登录)。因此，作为本发明中成为判断对象(被检体)的牛，优选国内养殖的牛，也就是国内出生并饲养的牛。而且，本发明人由于只调查国内养殖的牛，因此无法了解海外养殖的外国品种中FASN基因型的频度等，但当海外养殖的外国品种的单倍型与日本国内观察到的相同(也就是说，TW或AR型)时，可以成为本发明的判断对象(被检体)。而且，如上文所述，由于没有检测到在<1>和<2>的碱基间发生重组的例子，因此在本发明中，通过检测〈1〉或〈2〉的碱基，可以测定FASN基因型，但优选一起检测<1>和<2>。这样，分析了FASN基因的基因型中存在2个单倍型，进一步调查研究的结果发现在上述FASN基因的基因型与牛的肌肉内脂肪中所含的脂肪酸中油酸的含量的多少之间存在特别显著的关系。也就是说，清楚了在上述"TW型"和"AR型"之间，牛的肌肉内脂肪中所含的油酸等的脂肪酸含量有显著差异。结果的详细内容在后述的实施例中进行说明，油酸含量的比例，按具有TW型的FASN基因的纯合子(TW/TW)，具有TW型和AR型FASN基因的杂合子(TW/AR),具有AR型的FASN基因的纯合子(AR/AR)的次序呈现高值。因此，在本发明中，通过检测判断对象牛所具有的FASN基因中<1>和/或<2>的碱基，确定基因型是否是上述TW/TW型，TW/AR型和AR/AR型中的某一种，可以判断牛的肌肉内脂肪中的脂肪酸含量的多少。对于可以通过本发明判断的脂肪酸没有特別的限制，可以是不饱和脂肪酸，也可以是饱和脂肪酸。作为不饱和脂肪酸，可以例举油酸，反油酸，异油酸等具有18个碳原子的一价不饱和脂肪酸等。作为饱和脂肪酸，可以例举肉豆蔻酸等具有14个碳原子的饱和脂肪酸，也可以是棕榈酸等具有16个碳原子的饱和脂肪酸等。如前所述，牛肌肉内脂肪中所含脂肪酸中油酸是含量最多的脂肪酸，而且也是示意与牛肉的食用味道之间的关系的脂肪酸。因此，FASN基因的基因型为TW/TW型的牛，可以被评价为具有比AR/AR的牛食用味道更好的肉质。如此，通过调查FASN基因的基因型，不仅可以判断牛肌肉内脂肪中所含的脂肪酸组成，还可以判断是否是可以获得具有更好的食用味道的牛肉的牛。而且，各脂肪酸含量可以用例如以下的方法测定。在约lg试样的牛肉中加入40ml甲醇氯仿溶液，均化后震荡提取7分钟。然后，用旋转蒸发器对上清进行减压干燥，形成脂质试样。然后，按照基本油脂分析法，皂化后，甲酯化。也就是说，在试样中加入1当量氢氧化钾甲醇溶液，在水浴上环流加热，皂化，然后加入三氟化硼曱醇试剂，曱基化。转溶于己烷后，分离，用无水硫酸钠脱水，进行气相色镨。气相色谱的条件如下所示。(气相色谱的分析条件)柱CP-Sil88Wcot0.25mmx50m载气氦注入温度220X:柱温度16ox:恒温检测FID在本发明的判断方法中，对研究FASN基因的基因型的方法没有特别的限定，可以使用能够直接或间接研究FASN基因上的上述〈》的碱基是腺嘌呤(A)还是鸟嗓呤(G)，以及上述〈2〉的碱基是胸腺嘧啶(T)还是胞嘧啶(C)的现有的公知方法。通过使用PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)法检测前述〈1X2〉的碱基，研究FASN基因的基因型的方法最为简便，而且精确度良好，因此以下对该方法进行简要说明。(2)通过PCR-RFLP法对FASN基因的基因型判断方法所谓PCR-RFLP法，是通过PCR法扩增含有要检测的变异部位的基因区域，用识别该变异位点的限制性内切酶消化PCR产物后，通过电泳研究DM片段的分子量，检测通过限制性内切酶进行的切断的有无，即有无变异的方法。首先，从被检体的牛中制备基因试样。供判断的基因试样，可以是基因组DNA,也可以是cDNA。基因组DNA的情况是，可以从被检体的牛(不论是屠杀前还是后)的任意器官，组织和细胞(包括血液，羊水中的细胞，培养采集的组织等的细胞)中，按照常规方法纯化并提取DNA。在后述的实施例中，从肌肉组织中制备基因组DNA。cDNA的情况是，可以从被检体的牛(不论是屠杀前还是后)的任意器官，组织和细胞(包括血液，羊水中的细胞，培养采集的组织等的细胞)中，按照常规方法纯化并提取mRNA后，通过逆转录酶合成cDM。然后，为了鉴定单核苷酸多态性(SNP)中的碱基(SNP分型)，以用上述方法制备的基因组DM或cDNA作为模板进行PCR法，扩增含有前述<1>和/或<2>,优选<1>和<2>这两个位点的碱基的基因区域。然后，用适当的限制性内切酶消化所获得的扩增片段，根据其切断的有无判断FASN基因的基因型。上述PCR法中的各条件，使用的试剂和引物以及限制性内切酶等没有特别的限定，以下就后述实施例中使用的条件等，分利用基因组DNA或利用cDNA作为基因试样的情况进行说明。[A]基因试样为DNA的情况作为PCR反应液，可以使用通过以下方式制备的物质在20ng基因组DNA中加入0.25单位的AB基因Taq聚合酶，1.5p110><Taq聚合酶緩冲液，1.25jul10mMdNTPmix,正向引物(6.25pmol)和反向引物(6.25pmol)各0.25jj1，再用超纯水混合至15yl。这里，作为前述正向引物和反向引物，可以是能够特异性扩增含有前述<1>和/或<2>，优选<1>和<2>这两个位点的碱基的基因区域的寡核普酸。例如，正向引物是序列表的序列号1所示的碱基序列的一部分，而且可以是位于比要检测的变异部分更靠近5，末端的任意的碱基序列构成的寡核苷酸。而且，反向引物是序列表的序列号1所示的碱基序列的一部分，而且可以与位于比要检测的变异部分更靠近3，末端的任意的碱基序列互补的碱基序列构成的寡核苷酸。上述引物对优选由15-50个，更优选由18-27个核苷酸构成，而且就通过PCR法获得的扩增产物的长度而言，没有特别限制，优选为100-500个碱基。具体而言，可以例举序列表的序列号3所示的正向引物(FASN一F)和序列表的序列号4所示的反向引物(FASN—R)。该正向引物以FASN基因第34外显子内的碱基序列，反向引物以FASN基因的第35外显子内的碱基序列作为基础制作。PCR的反应条件，可以设定为首先(1)941C4分钟，然后(2)以94C30秒，60X:30秒，72X:30秒为一个循环，进行35个循环，最后(3)721C7分钟。通过使用序列表的序列号3，4所示的引物对的上述PCR法，可以获得336bp的PCR扩增产物。在多态性的检测中使用的限制性内切酶等，根据检测前述<1>还是<2>的碱基，有如下差异。检测前述〈》的碱基的情况如果用限制性内切酶Hhal处理上述获得的PCR扩增产物，前述〈1〉的碱基为腺噪呤时，PCR产物的〈1〉的多态性部位没有被相同限制性内切酶切断。此时，编码的氨基酸相当于苏氨酸，因此基因型可以判断为T型。另一方面，前述<1>的碱基为鸟噤呤时，PCR产物的<1>的多态性部位被相同限制性内切酶切断。此时，编码的氨基酸相当于丙氨酸，因此基因型可以判断为A型。检测前述〈2〉的碱基的情况如果用限制性内切酶Ncil处理上述获得的PCR扩增产物，前述〈2〉的碱基为胸腺嘧啶时，PCR产物的<2>的多态性部位没有被相同限制性内切酶切断。此时，编码的氨基酸相当于色氨酸，因此基因型可以判断为W型。另一方面，前述<2>的碱基为胞嘧啶时，PCR产物的<2>的多态性部位被相同限制性内切酶切断。此时，编码的氨基酸相当于精氨酸，因此基因型可以判断为R型。基因试样为cDNA的情况作为PCR反应液，与基因組DM的情况一样，可以使用通过以下方式制备的物质在20ngcDNA中加入O.25单位的AB基因Taq聚合酶，1.5pl10xTaq聚合酶緩冲液，1.25|li110mMdNTPmix,正向引物(6.25pmol)和反向引物(6，25p迈o1)各0.25jn1，再用超纯水混合至15"。此时，使用的引物可以采用与基因组DNA时完全相同的引物。即，可以是特异性扩增含有前述<1>和/或<2>，优选<1>和<2>这两个位点的碱基的基因区域的引物。具体而言，可以使用序列表的序列号3记载的碱基序列构成的寡核苷酸作为正向引物，且使用序列号4记栽的碱基序列构成的寡核苷酸作为反向引物。如前所述，序列表的序列号3记栽的正向引物基于第34外显子内的碱基序列制成，序列表的序列号4记栽的反向引物基于第35外显子内的碱基序列制成，但在使用cDNA作为基因试样时，通过剪切切取内含子部分，与使用基因组DNA作为基因试样时相比，其PCR扩增片段更短。由此，要是基因组DNA没有被消化而残留于使用的cDM中时，在PCR反应后，在l个泳道中会检测出2个扩增片段。也就是说，使用cDNA作为基因试样时，通过使用该正向和反向各引物进行PCR，还可以确认基因组DNA的污染。PCR的反应条件，与基因组DM的情况一样，可以设定为首先(1)94匸4分钟，然后(2)以94C30秒，60。C30秒，72"C30秒为一个循环，进行35个循环，最后(3)72C7分钟。通过使用序列表的序列号3，4所示的引物对的上述PCR法，可以获得226bp的PCR扩增产物。图1中用白色箭头分别模式化表示这些PCR反应中使用的序列号3和序列号4所示的引物的各个位置。向右方向的白色箭头表示正向引物，向左方向的白色箭头表示反向引物。使用基因组DM作为基因试样时，这些白色箭头所夹的片段整体(含有引物的部分)被扩增，与之相对，使用cDNA作为基因试样时，切取第34外显子和第35外显子所夹的内含子部分的结果是，扩增了比使用基因组DNA作为基因试样时更短的片段。在多态性的检测中使用的限制性内切酶根据检测前述<1>还是<2>的碱基而不同，与上述[A]中的[A-l]和[A-2]记载的相同，而且就处理方法和检测方法而言，可以以完全相同方式进行。结果的判断方法也完全相同。而且，基因试样为基因组DNA和cDNA的情况中的任意一种情况下，PCR-RFLP处理可以按以下方式进行。也就是说，使用Hhal时，在5p1PCR产物中加入0.5n1緩沖液，1u1BSA和5UHhal之后再用超纯水混合至lOjal，作为反应液。而且，使用Ncil时，在5ylPCR产物中加入0.5)i1緩冲液和5UNcil之后再用超纯水混合至10ju1，作为反应液。然后，使这些反应液于37C反应一晚。电泳的条件采用2%琼脂糖凝胶，以100V,进行30分钟电泳。电泳的结果示于图2，这些结果为使用序列表的序列号3,4所示的引物对和Hhal检测前述〈l〉的碱基的情况，泳道l-3表示使用cDM作为基因试样的结果，泳道4-6表示使用基因组DNA作为基因试样的结果。如图的泳道1和4所示，只出现分子量大的条带(分别为226bp和336bp)时，前述<1>的碱基为腺嘌呤的纯合子，如果由所编码的氨基酸表示，则可以判定为T纯合子。而且，如图的泳道3和6所示，只出现分子量小的条带(分别为74bp，152bp和262bp)时，前述<1>的碱基为鸟嘌呤的纯合子，如果由所编码的氨基酸表示，则可以判定为A纯合子。而且，如泳道2和5所示，出现上述大小的两个条带时，可以判断基因型为杂合子。这样一来，根据PCR-RFLP法，可以简单且高精度地研究FASN基因的基因型。而且，如前所述，由于FASN基因的2个单核苷酸多态性(SNP)之间仅相隔14个碱基，十分接近，因此可以认为由它们形成的单倍型大部分被固定，因此，基本上如果检测到任意一者的变位，自然就已经可以判断另一者的型。但是，如上所述，由于无法完全排除存在TW型和AR型以外的单倍型的可能性，即2个单核苷酸多态(SNP)之间发生重组的个体存在的可能性，在FASN基因型的判断中，通过一起确认2个位点的单核苷酸多态性(SNP)，可进一步提高正确性。(3)本发明的判断方法的改进方式如前所述，本发明的判断方法并不限于上述(2)的PCR-RFLP法。例如，即便通过PCR-RFLP法进行的判断，也可对各反应条件，使用的试剂和引物以及限制性内切酶等进行各种改变。当然，在本发明的判断方法中，可以使用PCR-RFLP法之外的方法。只要是可以直接或间接检测FASN基因上的前述〈l〉和/或〈2〉的碱基的方法，则可以适用检测碱基序列上的点突变的方法，检测单核苷酸多态性(SNP)中的碱基的方法(SNP分型)等现有公知的各种方法。作为一例，可以例举使用具有热循环仪和荧光检测器的可以同时进行变异检测和实时PCR(定量PCR)的PCR装置(例如，有RocheDiagonostic公司开发的商品名为"lightcyclersystem")的判断方法。该方法中，分别适当设计用于通过PCR法扩增含有前述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的引物对和3'末端经焚光物质FITC(异硫氛酸荧光素)标记的用于检测变异的探针和5，末端经荧光物质LC-RED(Lightcyclerred)标记的且3，末端被磷酸化的锚定探针。它们也可以委托适当的技术人员制备。然后，将这些引物，用于检测变异的探针和锚定探针与来自于被检体的试样DNA—起与含有DNA合成酶的适当试剂混合，利用lightcyclersystem进行扩增反应。由于此时使用的用于检测变异的探针被设计成覆盖目的变异区域，因此如果存在变异时，与不变异时相比，DNA的变性温度上产生差异，故可利用这一点检测多态性。作为可以在上述判断方法中使用的用于检测变异的探针，可以是特异性结合含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域且3，末端被荧光物质FITC标记的核普酸探针。其中尤其优选由20-30个核苷酸构成的探针。该核苷酸探针的序列，可以使用例如序列表的序列号1所示的碱基序列的一部分且含有上述<1>和/或<2>的碱基的序列或其互补序列。此外，作为本发明的判断方法的一种方式，可以例举采用DNA芯片等的基因多态性检测器具的判断方法，使用PCR-SSCP(单链构象多态性)法等点突变检测法的方法。而且，其中所谓"DNA芯片"主要是指以合成的寡核苷酸作为探针的合成型DM芯片，但也包括使用PCR产物等的cDNA作为探针的附着型DNA微阵列。为了使用DNA芯片检测上述<1>和/或<2>的碱基，制成在基板上配置用于检测任意一个碱基的探针的DNA芯片(或者同种器具)，使用这种DNA芯片等进行来自于被检体牛的基因试样和探针的杂交，根据杂交信号的有无可以进行单核苷酸多态性的分型。可以使用特异性结合含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的核苷酸探针作为在上述DM芯片等中使用的探针，具体而言可以使用序列表的序列号1所示的碱基序列的一部分且含有上述<1>和/或<2>的碱基的碱基序列或其互补序列。其中尤其优选由20-30个核苷酸构成的序列。而且，在使用PCR-RFLP法的本发明的判断方法中，还可以使用代替PCR法的其它扩增方法(例如RCA(滚环扩增)法等)，而且还可以在DNA扩增后，作为RFLP法的替代，通过碱基序列测定装置(DNA测序仪)等直接测定扩增片段的碱基序列，进行单核苷酸多态性(SNP)的分型。而且，FASN基因的碱基序列，在属于欧洲牛(Bostaurus)的动物间，还存在发生除前述<1>、〈2〉的单核苷酸多态性(SNP)之外的变异的可能性。总之，严格来说，有存在具有与序列表的序列号1所示的碱基序列不同的FASN基因序列的牛的可能性，对这样的牛，通过使用前述的本发明的判断方法研究FASN基因的基因型，也可以判断肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少，并且基于此可以判断牛肉的食用味道的好坏。而且，被检体牛是通过基因重组法等人工制备的牛时，也存在FASN基因被人为导入变异的可能性，此时，与上述一样也可以使用本发明的判断方法。从被检体牛中制备的基因试样可以是DNA,也可以是RNA。而且，就基因试样的制备方法而言，也可以通过常规方法进行，并没有特别的限定。(4)本发明的利用领域(实用性)本发明的判断方法，是基于FASN基因的基因型，可以判断牛的肌肉内脂肪中所含的脂肪酸组成，尤其是油酸含量的多少的方法，可以用于畜产(牛的饲养，繁殖，育种和改良等)，牛肉的生产加工等领域中。如前所述，已知牛的肌肉内脂肪中所含的脂肪酸中含量最多的是油酸，尤其是黑毛日本品种的肉，与外国品种的肉相比，其油酸含量显著高，这提示这大大影响日本人所喜欢的牛肉的良好的食用味道。因此，通过本发明的判断方法，黑毛日本品种等肉用品种(肉牛)或也作为肉用提供的荷斯坦(Holstein)种等乳用品种，可以评价是否是具有更好食用味道的肉质的牛。进而，基于该评价结果，通过使根据基因型分类的具有更好食用味道的优异的肉质的牛之间交配等，可以进行一直以来近乎不可能的牛肉的食用味道改良。进而，使用基因重组法等进行牛的品种改良，进行对畜产等领域有用的基因实验时，可以在作为实验对象的牛或精子、受精卵等的选择中利用本发明的判断方法。此外还可以进行出产前判断，例如可以从子宫的羊水中采集牛胎儿来源的细胞，从该细胞中制备基因试样，判断是否是产生食用味道更好的牛肉的牛等。实施例以下通过例举实施例对本发明进行具体的说明。在下述的实施例中，使用从被检体的牛(黑毛日本品种，利木赞(Limousin)种，海福特(Hereford)种，安格斯(Angus)种，荷斯坦因组DNA作为基因试样，通过前述的PCR-RFLP法进行判断。而且，在下述的实施例中，通过研究前述<1>的碱基，判断FASN基因的基因型(单倍型)是TW型还是AR型。在PCR法中使用的试剂，反应条件等如上文所示，这里省略其说明。而且，PCR法中的引物对使用序列表的序列号3,4所示的序列。(1)FASN基因型与各脂肪酸含量的关联性下表1中分别显示了通过上述判断方法进行前述黑毛日本品种和利木赞(Limousin)种构成的基因分析用F2代群体中FASN基因的基因型判断的结果，和各个基因型中肌肉内脂肪所含的脂肪酸的平均值，标准偏差。而且，基因型由伴随各个碱基取代的编码的氨基酸类型构成的单倍型表示。而且，在表l中，C14:0表示肉豆蔻酸，C16:0表示软脂酸，C18:1表示油酸。其中，各种脂肪酸含量用以下的方法测定。将约lg试样牛肉装入玻璃离心管中，在底部分别加入20ml生理盐水和40ml甲醇氯仿溶液(氯仿，甲醇，丁基羟基甲苯按2升，l升，15mg混合的原液)，通过均化器均化。将其导入分液漏斗中，搅拌7分钟，通过无水硫酸钠过滤。用蒸发器对其减压干燥，作为脂质试样。然后，在试样中加入5ml的1当量的氢氧化钾曱醇溶液，在95°C水浴上环流加热，皂化，然后加入10ml乙醚，搅拌，去掉上清。在其中加入lml的6当量硫酸和10ml的石油醚进行搅拌，将上清转移到其它试管中。用蒸发器对其減压干燥，在其中加入lml的三氟化硼甲醇溶液，在95'C水浴上回流加热，进行曱基化。加入已烷转溶后，分离，用无水硫酸钠脱水，提供给气相色镨，进行脂肪酸组成的测定。而且，气相色谱的条件如下所示。(气相色傳的分析条件)柱CP-Sil88Wcot0.25mmx50m<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如上所述，进行以FASN基因型作为主要因素的一元配置分散分析的结果是，肌肉内脂肪中脂肪酸含量根据单倍型的分类，各种脂肪酸种类各不相同。具有14和16个碳原子的各饱和脂肪酸中，各含量按AR/AR型、TW/AR型、TW/TW型的顺序显示出高值。与之相对，具有18个碳原子的1价不饱和脂肪酸(油酸)其含量按TW/TW型、TW/AR型、AR/AR型的顺序显示出高值。如前所述，提示出油酸含量与日本牛肉的食用味道之间的关系，根据该结果，清楚了FASN基因的2个等位基因中，具有TW型的等位基因的牛比具有AR型的等位基因的牛的油酸含量高，相反，其它脂肪酸含量显示出变低的倾向。也就是说，这表明通过研究FASN基因的基因型，可以判断牛肉的食用味道的好坏。而且，表1中，上标文字a，b，c为p<3.93xi(T2。，而且d，e，f为p〈0.002,g，h，i为p〈2.4xl(^时，可以发现各有显著差异。(2)黑毛日本品种A的半同胞群体中FASN基因型和油酸含量的相关性但是，由于上述(1)获得的结果始终是黑毛日本品种和肉用外国品种利木赞(Limousin)种之间的种间差异，因此还需要确认国内的黑毛日本品种中，对FASN基因型的肌肉内脂肪所含的油酸含量的影响。于是，收集山形县内养殖的黑毛日本品种肥育牛中有名的种雄牛A的半同胞群体试样，提取基因组DNA，进行FASN基因型的研究。在有名的种雄牛A的半同胞群体试样中进行FASN基因型判断的结果和肌肉内脂肪所含的油酸含量的平均值和标准偏差分别示于下表2中。而且，油酸含量的测定按与上述(l)同样方式进行。FASN基因型头数C18:1含量(％)平均值曹TW7653.05±2.098TW/AR9850.86±2.55bAR/AR3150,31±1.99°如上所述，与表1中在基因分析用F2组中发现的一样的倾向在黑毛日本品种有名种雄牛A的半同胞群体中也可以确认。也就是说，肌肉内脂肪所含的油酸含量按TW/TW型、TW/AR型、AR/AR型的顺序显示出高值。表2中不同的上标文字表示在p<2.2x10—"时显示出显著差异。根据该结果表明FASN基因型对黑毛日本品种的肌肉内脂肪中所含的油酸含量也有效果。而且，在该有名种雄牛A的半同胞试样中，与上述表l所示的基因分析用F2组的结果同样，也发现了与油酸之外的多个脂肪酸种类中FASN基因型的显著关系，上表2中只显示了尤其是提示出与牛肉的食用^^未道之间的关系的与油酸含量的关系。(3)3只黑毛日本品种的半同胞群体中FASN基因型与油酸含量的相关性然后，连续重复山形县内养殖的黑毛日本品种肥育牛组的试样收集，其结果与前述的有名种雄牛A不同，可以确保3头有名种雄牛构成的半同胞群体试样。对它们，与上述(l)一样提取基因组DNA进行FASN基因型的研究。下表3分别显示了3只有名的种雄牛的半同胞群体试样中进行FASN基因型判断的结果和肌肉内脂肪所含的油酸含量的平均值和标准偏差。表3FASN基因型头数C18:1含量(W平均值曹TW20553.91±2.19a曹AR16153.02±2.64bAR/AR0---如表3所示，与上述(l)(2)中显示出迄今为止所确认的相同的倾向。但是，在该组中具有AR型的纯合子个体1头都不存在。就这一点来说，判明了使用的半同胞群体的父牛即3头有名雄牛其FASN基因型偶然地均为TW型的纯合子，清楚了这就是原因。表中的不同的上标文字表示以p<5.7x10—4显示出显著差异。而且，在此时，也发现了与油酸之外的多个脂肪酸种类中FASN基因型的显著关系，上表3中只显示了尤其是提示出与牛肉的食用味道之间的关系的与油酸含量的关系以上，如表l-3所示，进一步清楚了FASN基因型对黑毛日本品种的肌肉内脂肪中所含的油酸含量的多少具有效果。(4)FASN基因的基因型频度和基因频度中的种间差异然后，对FASN基因的伴随氨基酸取代的2个单核苷酸多态性(SNP)构成的单倍型中显示的基因型频度和相同的单倍型中显示的等位基因频度的种间差异进行调查。也就是说，使用通过常规方法从下表4所示的各品种的牛的种雄牛冷冻精液提取的基因组DNA作为试样，进行与上述(l)相同的FASN基因型的研究。而且，其中使用的黑毛日本品种和荷斯坦(Holstein)种的种雄牛冷冻精液全部使用在国内流通的冷冻精液。结果示于表4.表41壯夂基因型频度基因频度单倍型n%单倍型n%黑毛日本品种TW/TW3147.0TW8866.7(66头)TW/AR2639.4AR4433.3AfVAR913.6荷斯坦种TW/TW34.3TW2417.1(70头)曹AR1825.7AR"682.9AR/AR4970.0:阿伯丁安格斯种TW/TW00.0TW21.5(65头)曹AR23.1AR12898.5AR/AR6396.91海福特种TW/TW00.0TW27.1(14头)曹AR214.3AR2692.9AR/AR1285.7如上所述，在黑毛日本品种和乳用品种荷斯坦种，以及肉用的外国品种之间发现了FASN基因型频度和基因频度均有较大差异。即，清楚了具有使肌肉内脂肪中油酸含量增多的效果的FASN单倍型，即TW型，在黑毛日本品种中比其它品种分布更多。一般，人们广泛认为黑毛日本品种的肉与荷斯坦种和肉用的外国品种相比具有日本人喜好的好味道，而且，这提示其与油酸含量的多少有关，可以说上述发现的FASN基因型频度和基因频度的差异证明了这种黑毛日本品种生产具有好味道的牛肉的能力。权利要求1、基于通过检测下述<1>和/或<2>的碱基测定的脂肪酸合成酶的基因型判断牛的肌肉内脂肪中脂肪酸含量的多少的方法<1>相当于序列表序列号1所示的碱基序列中的多态位点的第16024位的碱基即腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)的任一个<2>相当于相同碱基序列中多态位点的第16039位的碱基即胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的任一个。2、根据权利要求1所述的方法，所述脂肪酸为油酸。3、根据权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于含有下述工序(a)和(b):(a)以从被检体牛中制备的基因组DM或cDNA作为模板，通过基因扩增反应，扩增含有上述<1>和<2>的碱基的基因区域的工序(b)通过用限制性内切酶消化通过上述工序(a)获得的扩增片段，根据其是否切断判断脂肪酸合成酶的基因型的工序。4、根据权利要求3所述的判断方法，其特征在于上述工序(a)中的基因扩增反应，使用由序列表的序列号3中所示的碱基序列构成的正向引物和由序列表的序列号4所示的碱基序列构成的反向引物，通过聚合酶链式反应进行，而且在上述工序(b)中使用Hhal和Ncil作为限制性内切酶。5、根据权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于使用DNA芯片检测上述<1>和/或<2>的碱基。6.根据权利要求1或2所述的判断方法，其特征在于使用具有热循环仪和荧光检测器的聚合酶链式反应装置检测上述<1>和/或<2>的7、根据权利要求l-6中任一项所述的判断方法，所述牛是肉用品种。8、根据权利要求1-6中任一项所述的判断方法，所述牛是可作为肉用被利用的奶牛。9、在权利要求l，2,5-8中任一项所述的判断方法中使用的基因多态性检测用试剂盒，其包含与含有上迷<1>和/或<2>的碱基的基因区域特异性结合的核苷酸探针。10、在权利要求1-8中任一项所述的判断方法中使用的基因多态性检测用试剂盒，其包含用于通过基因扩增反应特异性扩增含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的引物。11、用于通过基因扩增反应特异性扩增含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的引物。12、特异性结合含有上述<1>和/或<2>的碱基的基因区域的核苷酸探针。13、基于权利要求1-8中任一项所示的判断方法的结果判断是否是能获得具有良好食用味道的牛肉的牛的方法。14、基于权利要求1-8中任一项所示的判断方法的结果选择和育种能获得具有良好食用味道的牛肉的牛的方法。全文摘要本发明的目的在于提供一种基于牛的基因型判断肌肉内脂肪中所含脂肪酸组成的方法，尤其是简便又高精度地判断油酸含量的多少的判断方法，以及根据此判断结果更为客观地判断牛肉的味道的方法。本发明提供了基于通过检测下述<1>和/或<2>的碱基而测定的脂肪酸合成酶的基因型，判断牛肌肉内脂肪中的脂肪酸含量的多少的方法和基于该结果判断是否是可以获得具有优良味道的牛肉的牛的方法<1>相当于序列表序列号1所示的碱基序列中的多态位点的第16024位的碱基，即腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，<2>相当于相同碱基序列中多态位点的第16039位的碱基，即胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)。文档编号C12N15/09GK101490256SQ20078002642公开日2009年7月22日申请日期2007年9月4日优先权日2006年9月7日发明者中岛宏明,佐分淳一,小林荣治,庄司则章,阿部刚申请人:独立行政法人家畜改良中心;山形县