专利名称：一种快速筛选钙离子通道拮抗剂的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高通量筛选钙离子通道拮抗剂的方法。
背景技术：
钙离子通道是常见的药物靶器官，钙离子通道拮抗剂广泛应用于心血管疾病，如高血压、心率失常和心衰等各种疾病。因其作用显著，受到各大医药公司的青睐，每年对大量化合物进行筛选以求证其对钙离子通道的作用，其中绝大部分是对其拮抗作用的筛选。传统的钙离子通道拮抗剂的筛选方法用的是结合法(Binding Assay)，这种方法是化合物和已知钙离子通道的结合位点结合，根据其结合的强弱来判断化合物的拮抗性。 这种方法的缺点是结合位点已知，也就是说无法对未知的阻断结合点进行药物筛选，一般需要同位素作为检测手段，对人体和环境具有潜在的危害，更由于其筛选出的阳性化合物虽有和钙离子通道结合的能力但并不一定有拮抗的效果，因而逐渐淘汰。取以代之的以荧光为基础的Flippr Assay法，钙离子通道开放引起的钙离子向细胞内涌入，进而结合事先置入的荧光蛋白。这类荧光蛋白可根据细胞内钙离子的强弱而发出不同强弱的荧光，从而检测荧光的强弱可判断进入细胞的钙离子的多少。最近几年兴起的I^atchXpress，Qpatch 和IonWorks等仪器建立在传统的电生理的基础上，从而克服了结合法(Binding Assay)和荧光法(Flippr Assay)的缺点，使药物筛选过程更接近于生理状态，缺点是成本很高。无论以上哪种方法，操作人员都需要一定的专业知识，长期的训练；更重要的是筛选成本都比较高。药物筛选领域追求的是低成本高速度，即多少美元一个数据点和一天多少数据点。关于能采集多少数据点一天，以上各方法并不相同，但至少达到半高通量的要求，然而，成本却居高不下，便宜也要$50 —个点左右。
发明内容
本发明针对现有技术的成本高缺陷提供一种利用细胞毒性高频筛选钙离子通道拮抗剂的方法，该方法并不需要昂贵的实验仪器，操作人员只需要简单训练即可掌握，而且也达到或超过半通量的要求，具有高效、易学、易用和廉价等优点，可快速筛选钙离子通道拮抗剂。本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的 一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法，该方法包括以下步骤
1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株；
2)剂量效应标准曲线的制备将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂，以此同时加入ΙμΜ Bay K,培养至少M 小时后测量细胞的存活率，以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Mtrendipine的浓度绘制曲线，得到剂量效应标准曲线；
3)筛选将带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，每个孔内带钙离子通道的细胞株的量与步骤幻中带钙离子通道的细胞株的量的加入量相同，再向孔内加入待筛选化合物，得到的数值与剂量效应标准曲线对照，确定其是否对钙离子通道有阻断作用。本发明是利用钙离子内流至细胞内，可引起细胞死亡这一原理而设计的。一般情况下，细胞膜内外两侧有一个在-70到-90毫伏之间的电压差(膜电压)，如心肌细胞和神经细胞等。HEK293细胞相对特殊，它的膜电压在-20到-40毫伏之间。钙离子通道是一种电压敏感性通道，在处于-70之-90毫伏的静息电位时，离子通道是关闭的；细胞内外的钙离子并不交流；而电压上升到一定程度时，也就是说在某一特定的电压段，离子通道会被打开 (激活状态)。-40毫伏的膜电压正好达到了钙离子通道的开放域值；HEK293细胞的膜电位真好在-20到-40毫伏之间。那么，钙离子克隆在这类细胞株上，钙离子通道将处于持续激活状态，即连接细胞内外的，在细胞膜上的钙离子通道一直处在开放状态。从单个钙离子通道来说，钙离子通道开放后会迅速失活。失活的概念指的是在离子通道开放的条件继续存在的条件下，离子通道不再开放的一种状态。克隆了钙离子通道的HEK293细胞上有很多钙离子通道，作为特定的单个离子通道，它在开放后，迅速失活；但以整个细胞的钙离子通道来说，始终会有一些通道在一定条件下处于开放状态；而这个特定条件就是细胞膜之间的膜电压在-20到-40毫伏左右。有实验证明在-40毫伏到-20毫伏之间，始终有一定数量的钙离子通道处于开放状态。由于钙离子在细胞内外存在浓度差， 细胞外的钙离子浓度要远远高于细胞内的钙离子浓度，这样在钙离子通道开放的情况下， 钙离子顺着离子浓度梯度从细胞外进入细胞内。钙离子在细胞内浓度升高，可引起各种生理现象，也可引起细胞自然死亡。如果能阻止钙离子的内流，细胞就不会死亡。这样，一个化合物是否对钙离子通道有阻断作用，就可以在细胞的死亡率上表现出来。这种不同的死亡率，就可以用来对钙离子他的的阻断剂进行筛选。这个专利就是利用离子通道的这一特点进行药物筛选。在实验中用到的Bay K，可以增加钙离子通道的开放。虽然原理上有待进一步探讨，但一般认为它作用在钙离子通道的失活期，从而使离子通道开放时间大大延长。实验中使用Bay K可以使细胞死亡率增高以增加筛选的敏感度。这个发明的高效是和IonWorks以及PatchXpress，Qpatch相比较的，Molecular Devices公司的IonWorks Quattro是目前速度最快的仪器，其网站认为在6小时内可获 2300个资料点。这个数据并不反映实际情况，Quattro用的是384孔板，除去阳性和阴性对照后是320个空，即百分之百成功一次可得320个数据点。一个实验程序一般需要70 到120分钟，加上每次实验前的一些必须准备(如处理细胞等)，一天8小时最多能完成4个实验，即1280个数据点，钙离子通道的实验程序一般需要2小时，数据点更少。Molecular Devices公司的PatchXpress和Sophion的Qpatch属于同一类型的产品，采用16空板，即最多可得到16个细胞，属于半高通量的筛选仪器。由于这类产品在一个细胞上能得到多个点(可得到5个点一个细胞)，成功率可达50% ；—天8小时，可完成6次实验，即一天可获得240个点，但在实践中，很少有达到200个点的。本发明采用的是96空板，除去阳性和阴性对照后是80个空，即可获80个数据点一次。本方法可用多种测试方法，其速度也和测试方法相关。如果用目测法，按我的测试，每空平均需要25秒，不到半分钟，即一整个板不需要50分钟，一天测8个板或640个数据，不应有问题；也可以用Vi-Cell (Vi-Cell XR, Cell Viability analyzer, Beckman Coulter)来测量细胞的存活率，Vi-Cell 是专门用来测细胞存活率的仪器，一般好点的实验室都会有类似的仪器。Vi-Cell的测试速度并不快，和目测不相上下，一天可得640个数据或8个板；但它可节省很多人力。另外，各种扫描仪(microplate reader)也可以执行任务。比如，GE IN Cell Analyzer 1000 是用于 High content Analysis的仪器，也可在本发明中运用，它的扫描速度和曝光以及图像数量有关， 96孔板需要1到4小时，在本实验应用中只需1小时，8小时内，可得640个数据点。由于测试前细胞不需要进一步处理，如果再接上自动传递装置，理论上可进行M小时测试，从而达到近2000个数据点。在成本上，采用目测法，需要一台倒置显微镜，价格$1500左右， 一般细胞培养实验室均拥有这种仪器；Vi-Cell也是细胞培养室的常用仪器，好点的实验室均会拥有，它的价格在$45000左右；仪器GE IN Cell Analyzer 1000—般只有从事药物筛选的实验室才有，价格也较昂贵。和IonWorks Quattro，PatchXpress以及Qpatch 40到 50万美元一台相比，本发明可以说是成本低廉；另外，Ionfforks Quattro，PatchXpress和 Qpatch每次实验需要消耗一个板(chip)，每个chip需上百美元，而一个96孔板大约需要 1美元左右，所以消耗品成本也很低廉。作为优选，步骤1)具体为钙离子通道有4个亚单位，需要至少2个单位α和β 亚单位，其中α亚单位可组成离子通道的孔道而β对其有功能修饰作用，另两个亚单位 α2δ和Υ对钙离子通道的表达有增加作用。一般需要α，β和Ci2 δ同时表达以达到所需的表达量。与此同时，这三种亚型需要表达在三种带不同抗药性并可作哺乳动物细胞的质粒，这种不同的抗药性可选择性地保留三种亚单位在细胞中表达，同时杀死不带或少带抗药性的细胞，从而达到稳态表达离子通道的目的。通过抗药性的选择可将钙离子通道克隆到 HEK (human embryonic kidney cell)或 CHO (Chinese Hamster Oocyte)等细胞上， 得到Cavl. 2细胞株。作为优选，所述的质粒为可作哺乳动物细胞表达的质粒。钙离子通道细胞株的保存将钙离子通道阻断剂尼群地平溶于含10%小牛血清细胞培养液中，并在常规(X)2细胞培养箱中培养传代备用。本发明是利用钙离子对细胞的毒性对钙离子通道的拮抗剂和调节剂进行快速高频筛选，一天可获得几百甚至上千个实验数据，成本大大降低，操作人员在简单训练后即可掌握。因此，与现有技术相比，本发明的方法不仅在速度上具有较大的优势，而且可使成本由原来的一个数据点$50左右降至$1左右，具有很大的价格优势和发展前景。
图1是尼群地平(Nitrendipine)对细胞死亡的保护作用曲线。横坐标代表的是尼群地平浓度；纵坐标代表的是细胞死亡率。曲线是用逻辑回归拟合后得到的量效曲线。 其半数阻断剂量(IC5tl)为2. 4微摩尔。图2是用Ionworks获得的尼群地平对钙离子通道阻断作用曲线。本图采用的数据是对比用药前后的最大钙内流电流变化以及其相应的尼群地平浓度。曲线是用逻辑回归拟合后得到的量效曲线。其半数阻断剂量(IC5tl)为0. 9微摩尔。图3是维拉帕米(Verapamil)对细胞死亡的保护作用曲线。横坐标代表的是维拉帕米浓度；纵坐标代表的是细胞死亡率。曲线是用逻辑回归拟合后得到的量效曲线。其 IC5tl是观.7微摩尔。图4是地尔硫卓(Diltiazem)对细胞死亡的保护作用曲线。横坐标代表的是地尔硫卓浓度；纵坐标代表的是细胞死亡率。曲线是用逻辑回归拟合后得到的量效曲线。其 IC5tl是71. 6微摩尔。图5是显示8种未知化合物对细胞死亡率的影响曲线。A，B, C, D, E, F，G和 H代表的是10微摩尔的8中未知化合物。黑色的方块是各种浓度的尼群西平，曲线是用逻辑回归(logistic regression)模拟后得到的剂量效应标准曲线。图6是用Ionworks测量钙离子通道用药前后变化的电压命令程序。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例；这些实施例可以对本发明作进一步的补充和说明； 但本发明并不限于这些实施例。以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。如无特殊说明，本发明涉及的物质的含量均为质量含量。HEK293细胞株从Eton Bioscience有限责任公司购得。L型钙离子通道的HEK293细胞株的制备过程为常规技术，具体可以根据如下的步骤进行
1) L型钙离子通道的cDNA和PCMV-A-Puro表达载体(vector)均从Origene公司购买(α IC :#SC311958 ； β 2 :#SC122135 ； α 2 δ #SC124161 ;PCMV-A_Puro 表达载体 #PS100025) ；pcdna3. 1/Zeo (+)和 pcdna3. 1/hygro (+)表达载体是从 invitrogen 公司购买(pcdna3. 1(+) :V790020 ；pcdna3. 1/hygro (+) :V87020)。购买后由 Origene 公司负责将 cDNA更换到指定载体。2)按Roche公司的Fugene方法将三种cDNA转录到HEK293细胞株上，这一步在 96孔板进行。3)大约16小时后，将96孔板空中细胞培养液换成带有抗菌素的培养液。每7 到10天换液，一直到阴性对照细胞全部被抗生素杀死。这时可以进行克隆细胞。用酶 (Trypsinization)彻底将细胞悬浮并打开。测定细胞数量后，将细胞稀释到每100毫米培养皿1到5个细胞。让细胞长2星期左右，并在单克隆的菌落下做好标记。将菌落转移到 M孔板上继续生长到80%满时，再做电生理鉴定，以找到最佳克隆。从而得到L型钙离子通道的HEK293细胞株。其他试剂来源
小牛血清Jnvitrogen公司#16000 ； D-MEM/F-12 培养液hvitrogen 公司； Nitrendipine (尼群地平)西格马(Sigma)公司； 胰蛋白酶消化液(Trypsin/EDTA) Jnvitrogen公司； BayK :BayK-8644,西格马(Sigma)公司；
Vicell :Vi-Cell XR,细胞活性分析仪，Beckman Coulter 公司； Ionworks :Molecular Devices 公司。
1)本发明是利用钙离子对细胞的毒性对钙离子通道的拮抗剂和调节剂进行高频筛选，具体以HEK293为例来说明本发明方法的实施过程，HEK293细胞是一种生物研究中广泛用于细胞培养的细胞株，起源于人类胚胎肾细胞。首先，在HEK293细胞株上进行。这个克隆细胞株带有大量的L型钙离子通道，可以用来筛选针对钙离子通道的拮抗剂。2)由于钙离子可以不断通过钙离子通道进入细胞，造成细胞死亡，因而，带钙离子通道的HEK293细胞株需有钙离子通道阻断剂，如尼群地平(Nitrendipine) (10 μΜ)来保护进行传代。Nitrendipine是二氢吡啶类1，4_Dihydropryridine类L-型钙离子通道高效阻断剂。这类阻断剂能更有效地与处于失激活状态的钙离子通道结合，也是优先选择这类阻断剂的重要原因；L型钙离子通道也可用CHO进行表达，制成细胞株，但因为CHO抗死亡能力较强，所以不优先选择CHO细胞。将Nitrendipine溶于带有10%小牛血清细胞培养液中，使其浓度达到10 μΜ。在该混合液中，37°C，5%0)2的培养箱内HEK293细胞株培养传代直到实验的时候。HEK293细胞株在例行传代培养时，采用拌有L-型谷氨酸的D_MEM/F_12培养液，并加入10%的小牛血清以及G418 400μδ/πι1, Riromycin (嘌罗霉素)0. 625Pg/ml和 hygromycin (潮霉素)lOOPg/ml三种抗生素；以及10 μΜ的Nitrendipine (尼群地平)。每隔36小时到48小时，传代并重新更换培养液，确保细胞密度不超过80%。传代的步骤可按以下进行
a.去除所有的培养液并用5毫升37°C的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1次；
b.去除PBS并用37°C的胰蛋白酶消化液清洗后立即去除；
c.把培养皿放置在37°C的细胞培养箱里2到5分钟；
d.轻击培养皿使细胞脱离培养皿的底部，再加入新的37°C的细胞培养液并重新悬浮细胞；
e.用吸管把悬浮细胞加入15毫升的离心管中用震荡器摇勻；
f.取1 毫升用 Vicell 仪(Vi-Cell XR, Cell Viability analyzer, Beckman Coulter) 测细胞的数量和存活度；
g.经计算后，将两到三百万细胞加入175毫升的培养皿里进行培养。
3)在筛选实验时，HEK293细胞被放置在96孔板中，每孔含10万细胞。具体方法 a.细胞培养液，继续使用拌有L-型谷氨酸D-MEM/F-12培养液，加入10%的小牛血清； 并加入 μΜ的BayK和相应的三种抗生素。注意培养液中不含Nitrendipine。b.可按传代方法悬浮细胞，将10万个细胞加入96孔板的每个孔中，并加入200μΜ 的细胞培养液。c.在加入细胞后，含有ΗΕΚ293细胞株的孔板被转移到30 °C，5% C02的培养箱中培养。48小时后，取出并测试细胞存活率；具体测试方法按Vicell的说明书操作，细胞存活率见表1。表1 Bay K8644对带L型钙离子通道的HEK293细胞死亡率和存活率的影响
权利要求
1.一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株；2)剂量效应标准曲线的制备将等量的带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，再加入经梯度稀释的钙离子通道阻断剂，以此同时加入ΙμΜ Bay K,培养至少M 小时后测量细胞的存活率，以细胞存活率对钙离子通道阻断剂Nitrendipine的浓度绘制曲线，得到剂量效应标准曲线；3)筛选将带钙离子通道的细胞株滴入细胞培养板的各个孔内，每个孔内带钙离子通道的细胞株的量与步骤幻中带钙离子通道的细胞株的量的加入量相同，再向孔内加入待筛选化合物，得到的数值与剂量效应标准曲线对照，确定其是否对钙离子通道有阻断作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)具体为通过抗药性的选择可将钙离子通道克隆到HEK或CHO细胞上，得到Cavl. 2细胞株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的质粒为可作哺乳动物细胞表达的质粒。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高通量筛选钙离子通道拮抗剂的方法。一种高效筛选钙离子通道拮抗剂的方法，该方法包括以下步骤1)制作稳定的带钙离子通道的细胞株；2)剂量效应标准曲线的制备；3)筛选。本发明是利用钙离子对细胞的毒性对钙离子通道的拮抗剂和调节剂进行快速高频筛选，一天可获得几百甚至上千个实验数据，成本大大降低，操作人员在简单训练后即可掌握。因此，与现有技术相比，本发明的方法不仅在速度上具有较大的优势，而且可使成本由原来的一个数据点$50左右降至$1左右，具有很大的价格优势和发展前景。
文档编号C12Q1/02GK102260730SQ20111011341
公开日2011年11月30日 申请日期2011年5月4日 优先权日2010年5月28日
发明者陈渊, 陈滔 申请人:陈滔