钙离子阻断化合物的制作方法

专利名称：钙离子阻断化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的钙离子阻断化合物(calcilytic compound)，含有该化合物的组合物及其作为钙受体拮抗剂的应用。
在哺乳动物中，细胞外Ca2+处于严格的体内平衡控制下，调节着诸如凝血、中枢和肌肉的兴奋性、适当的骨形成等多种过程。细胞外Ca2+抑制了甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素(“PTH”)，抑制了碎骨细胞的吸收，并且刺激了C-细胞分泌降钙素。钙受体蛋白能够使得某些特异性细胞来响应细胞外Ca2+浓度的改变。
PTH是血液和细胞外液中调节体内Ca2+平衡的主要内分泌因子。PTH，通过作用于骨和肾细胞，增加了血液中Ca2+的水平。这种细胞外Ca2+的增加会起负的反馈信号的作用，抑制PTH的分泌。细胞外Ca2+和PTH分泌之间的这种成反比的关系形成了一个重要的维持体内Ca2+平衡的机理。
细胞外Ca2+直接作用于甲状旁腺细胞来调节PTH的分泌。检测细胞外Ca2+的变化的甲状旁腺细胞表面蛋白的存在已经得到确认。见Brown等，Nature 366574，1993。在甲状旁腺细胞中，这种蛋白即钙受体起细胞外Ca2+受体的作用，能检测到细胞外Ca2+离子浓度的改变，引发细胞的响应功能，即PTH的分泌。
细胞外Ca2+影响多种细胞功能，综述在Nemeth等的Cell Calcium 11319，1990文献中。例如，细胞外Ca2+在滤泡旁(C-细胞)和甲状旁腺细胞中起重要作用。参见Nemeth的Cell Calcium 11323，1990。已经研究了细胞外Ca2+对碎骨细胞的作用。参见Zaidi的Bioscience Reports 10493，1990。
已经发现多种化合物可模仿出细胞外Ca2+对钙受体分子的效果。钙离子阻断化合物是能够抑制钙受体活性，导致由细胞外Ca2+引起的一个或多个钙受体活性降低的化合物。钙离子阻断化合物在钙受体调节剂的发现、发展、设计、修饰和/或构造中用作先导(lead)分子，其对Ca2+受体表现出活性。钙离子阻断化合物可用于治疗多种疾病，这些疾病的特征为一种或多种成分的量异常，这些成分例如为多肽，如激素，酶或生长因子，它们的表达和/或分泌受在一个或多个Ca2+受体上的活性的调节或影响。钙离子阻断化合物的目标疾病或失调包括骨和矿物质的体内平衡异常(abnormall bone and mineral homeostasis)。
钙体内平衡异常的特征为具有一个或多个下列活性血清中钙的异常增加或减少；排泄尿中钙的异常增加或减少；骨钙水平(例如，按照骨矿物质密度测量得到的)的异常增加或减少；饮食中钙的异常吸收；影响血清中钙量的信使如PTH和降血钙素的产生和/或释放的异常增加或减少；由影响血清中钙量的信使引起的响应中的异常改变。
因此，钙受体拮抗剂提供了一种独特的对与骨或矿物质体内平衡异常有关的疾病或失调的药物治疗方法，所述疾病或失调例如甲状旁腺功能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折康复、骨关节炎、风湿性关节炎、Paget氏疾病，恶性肿瘤和骨折康复所致的体液性血钙过多以及骨质疏松。

发明内容
本发明包括下文通式(I)表示的新的钙受体拮抗剂，以及其作为钙受体拮抗剂在治疗与骨或矿物质体内平衡异常有关的疾病中的应用，所述疾病包括但不限于甲状旁腺功能减退、骨肉瘤、牙周病、骨折康复、骨关节炎、风湿性关节炎、Paget氏疾病，恶性肿瘤和骨折康复所致的体液性血钙过多以及骨质疏松。
本发明还提供一种拮抗哺乳动物(包括人)体内钙受体的方法，其包括给有所需要的动物服用有效量的下文所述的通式(I)化合物。
本发明还提供一种增加哺乳动物(包括人)体内血清中甲状旁腺量的方法，其包括给有所需要的动物服用有效量的下文所述的通式(I)化合物。
发明详述本发明的化合物选自下述通式(I)
其中A是芳基或稠合的芳基、二氢或四氢稠合的芳基、杂芳基或稠合的杂芳基、二氢或四氢稠合的杂芳基，它们是未取代的或被选自OH、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-6环烷基、CF3、OCF3、CN和NO2的基团取代的；D是C或N，在环中具有1-2-N，条件是当D为N时，X1-X5不存在；X1和X5独立地选自氢、卤素、CN和NO2，条件是或者X1或者X5是氢；另外条件还有当D为N时，X1和X5不存在；X2、X3和X4选自氢、卤素、O-C1-4烷基和J-K，其中J是共价键、亚烷基、O-亚烷基或亚烯基；和K选自CO2R5、CONR4R4’、OH、NR4R4’和CN，条件是当D是N时，X2、X3和X4不存在；R4和R4’独立地是氢、烷基、芳基或杂芳基；R5是氢、烷基、烷基-(O-烷基)m-O-烷基、芳基或杂芳基；n是0-4的整数；和，m是1-3的整数。
本文中所述“烷基”指的是任选取代的由碳-碳单键连接形成的并且含有1-20个碳原子的烃基。烷烃可以是饱和的或不饱和的直链、支链或环状。优选的，任选取代的烷基上的取代基选自芳基、CO2R、CO2NHR、OH、OR、CO、NH2、卤素、CF3、OCF3和NO2，其中R是H、C1-4烷基、C3-6环烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、杂环烷基或芳基。另外的取代基选自F、Cl、Br、I、N、S和O。优选取代基不多于3个。更优选，烷基具有1-12个碳原子并且是未取代的。优选烷基是直链烷基。
本文中所述“环烷基”指的是任选取代的3-7元碳环，除非另外说明，其中的取代基选自F、Cl、Br、I、N(R4)2、SR4和OR4。
本文中所述“芳基”指的是任选取代的具有至少一个共轭π电子体系的环的芳族基团，该芳族基团最多包含两个共扼或稠合的环系。芳基包括碳环芳基和双芳基基团，均可被任选取代。优选的芳基包括苯基和萘基。更优选的芳基包括苯基。优选的取代基选自卤素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6环烷基。
本文中所述的“杂芳基”指的是含有1、2或3个诸如N、S或O杂原子的芳环。
本文中所述的“烯基”指的是任选取代的包含至少一个碳-碳双键并且含有多至5个碳原子的烃基。烯烃链可以是直链、支链或环状。任意的取代基选自卤素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6环烷基。
本文中所述的“炔基”指的是任选取代的包含至少一个碳-碳三键并且含有多至5个碳原子的烃基。炔烃链可以是直链、支链或环状。任意的取代基选自卤素、C1-4烷基、OCF3、CF3、OMe、CN、OSO2R和NO2，其中R是C1-4烷基或C3-6环烷基。
本发明的化合物可以包括一个或多个不对称碳原子，也可以消旋或立体活性形式存在。所有这些化合物及其非对映异构体均在本发明范围之内。
本发明的优选化合物包括3-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满(indan)-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸乙酯；3-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；和
3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸。
药学上可接受的盐是在其服用时数量和浓度下没有毒性的盐。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，如硫酸盐、盐酸盐、富马酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐。优选的盐是盐酸盐。药学上可接受的盐可以通过如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸和奎尼酸获得。
药学上可接受的盐也包括当存在酸性官能团如羧酸或羟基时，与诸如苄星(benzathine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、甲葡胺(meglumine)、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌形成的碱加成盐。
本发明提供的通式(I)化合物可以采用标准的工艺来制备。制备优选化合物的方法可以按照下述内容进行。接下来的实施例举例说明了具体化合物的合成方法。根据本文所描述的方案，将其作为模型，本领域普通技术人员可以容易地生产出本发明所述的其他化合物。
本文中所用的试剂和溶剂都是购得的，起始材料可以通过标准工艺和步骤合成得到。
流程

图1
流程图2 一般制备方法按照流程图1，根据该一般的步骤，可以合成许多本发明的化合物杂芳基酚的丙酮溶液用适当的碱如碳酸钾处理，加热15分钟。加入R-缩水甘油基-O-SON(R-glycidyl nosylate)，持续反应过夜，得到相应的缩水甘油基醚(流程图1)。取代的缩水甘油基醚和过量的胺(例如1，1-二甲基-2-(4-甲氧苯基)乙胺)在无水乙醇、乙腈、THF、二氧六环(dioxane)、甲苯或其他类似溶剂中形成的溶液，在LiClO4等合适的催化剂的存在下，搅拌、回流过夜。产品通过色谱纯化。盐酸盐可以通过向相应的碱中加入氯化氢气体或氯化氢的4M的二氧六环溶液来制得，或也可以采用其他标准方式制得。流程图2说明了杂芳基酚的典型制法。2-溴-吡啶-3-酚与异丁烯的二氯甲烷溶液在硫酸的作用下反应得到相应的叔丁醚，将其和氰化锌Zn(CN)2在钯催化剂下作用得到3-叔丁氧基-吡啶-2-腈。进行选择性溴化得到6-溴-3-叔丁氧基-吡啶-2-腈。用丙烯酸乙酯进行进行Heck偶合，然后进行选择性还原，得到3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯，接着用TFA脱保护得到3-(5-羟基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯。
为了将通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐用于人和其他哺乳动物，采用标准的制药操作，按照一般的方法将其配制成药物组合物。
钙离子阻断化合物可以通过不同的途径给药，包括静脉、腹膜、皮下、肌内、口服、局部(经皮)或粘膜给药。对于全身给药，优选口服方式。对于口服给药，化合物例如能够配制成常规的口服剂型如胶囊、片剂和液体制剂形式如糖浆、酊剂和滴剂等。
可选的，注射剂(非肠胃给药)可以用于例如肌内、静脉、腹膜和皮下。作为注射剂，本发明的化合物配制成溶液，优选配制在生理上相容的缓冲剂或溶液如生理盐水、Hank溶液或Ringer溶液中。另外，化合物也可以配制成固体形式，使用前重新溶解或悬浮后，然后立即使用。冻干剂(lyophilizedform)也可以应用。
全身服用(systemic administration)也可以通过经皮或粘膜方式给药。对于经皮或粘膜给药，在制剂中加入适宜将药物透过要穿透的屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域已知的，例如包括；用于粘膜给药的胆汁酸盐和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物。另外，净化剂也可用来促进渗透。粘膜给药可以通过诸如鼻喷雾器、直肠栓剂或阴道栓剂等方式。
对于局部给药，本发明的化合物可以配制成本领域常用的药膏(ointment)、软膏(salve)、凝胶(gel)或乳膏(cream)等剂型。
各种钙离子阻断化合物的用量可以通过标准步骤，考虑到如化合物的IC50、EC50、化合物的生物半衰期、病人的年龄、身高和体重以及病人所患病症的因素来确定，这些因素以及其他要考虑的因素的重要性对于本领域普通技术人员而言是已知的。
服用剂量也依赖于服用方式和生物利用度。例如，对于口服生物利用度低的化合物，服用时所用的剂量将相应的增加。
组合物优选是单位剂量形式。对于口服方式，可以采用片剂或胶囊，对于鼻用方式，可采用可计量的气雾剂剂型，对于经皮给药，可以采用局部用制剂或贴片，对于粘膜给药方式，可以采用口腔贴片。对于每一种情况，制剂都要使得患者能够服用一个剂型。
对于口服给药，每个剂量单位适宜包含0.01-500mg/Kg，优选0.1-50mg/Kg的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐，按游离碱计算。对于肠胃外给药、鼻内给药、口服吸入给药、粘膜给药或经皮给药途径，每日剂量适宜包含0.01-100mg/Kg的通式(I)化合物。局部用制剂适宜包含0.01-5.0％的通式(I)化合物。活性成分可以每天给服例如1-6次，优选一天一次，要足以产生所需的活性，这对于本领域技术人员来说是清楚的。
本文中所述的“治疗”疾病包括但不限于防止、延缓和预防疾病。
可被治疗或预防的疾病和失调，基于受侵袭的细胞，包括与骨和矿物质有关的疾病或失调；甲状旁腺机能减退；中枢神经系统疾病，如发作()、发作综合征(stroke)、头部创伤、脊髓损伤、缺氧引起的神经细胞受损如心动停止或新生儿呼吸窘迫(neonatal distresss)时发生的那些情况、癫痫、神经退化疾病如阿尔茨海姆疾病、亨廷顿病和帕金森氏症、痴呆、肌肉紧张、抑郁、焦虑、恐慌(panic disorder)、强迫观念和行为的疾病，外伤后紧张性刺激(post-traumatic stresss disorder)，精神分裂症、抗精神病药的恶性综合征和Tourette综合征；涉及过量水由肾吸收的疾病如ADH分泌失调综合症(SIADH)、(肝)硬化、充血性心力衰竭和肾(变)病；高血压；预防和/或减少来自阳离子抗生素(例如氨基糖苷类抗生素)的肾脏毒性；消化道能动性失调(gut motility disorders)如腹泻和结肠痉挛(spastic colon)；GI溃疡；具有过量钙吸收的GI疾病例如肉状瘤病(sarcoidosis)；自身免疫系统疾病和器官移植的排斥反应；鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)；以及胰腺炎(pancreastitis)。
在本发明的优选实施方案中，本发明的化合物被用于增加血清中甲状旁腺激素(“PTH”)水平。增加血清中PTH水平有助于治疗诸如甲状旁腺功能失调(hypoparathyroidism)、骨肉瘤(osteosarcoma)、牙周病(periodontaldisease)、骨折愈合、骨关节炎、关节复位(joint replacement)、风湿性关节炎、Paget氏疾病、体液性血钙过多(humoral hypercalcemia)、恶性肿瘤(malignancy)和骨质疏松等疾病。
在本发明的优选实施方案中，本发明的化合物与抗吸收剂(anti-resorptive agent)联合应用。这种药剂包括但不限于雌激素、1，25-二羟基维生素D3、降血钙素(calcitonin)、选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogen recaptor modulators)、血浆糖蛋白(vitronectin)受体拮抗剂、V-H+-ATP酶抑制剂、src SH2拮抗剂、二膦酸类(bisphosphonates)和组织蛋白酶(cathepsin)K抑制剂。
本发明的另一方面还公开了一种治疗患者的方法，该方法包括给患者服用足以增加血清中PTH水平量的本发明化合物。优选，该方法是给患者服用有效量的化合物，以有效增加血清中PTH水平的持久性和/或数量，从而产生治疗效果。
在各种实施方案中，给患者服用的本发明化合物可以使血清中PTH水平持续增加高至1小时，约1-约24小时，约1-约12小时，约1-约6小时，约1-约5小时，约1-约4小时，约2-约5小时，约2-约4小时，或者约3-约6小时。
在本发明可供选择的实施方案中，给患者服用的本发明化合物可以使血清中PTH水平增加持续约24小时以上，条件是本发明的化合物和抗再吸受剂联合给药。
在另外的不同的实施方案中，给患者服用的本发明化合物使血清中PTH水平比病人的血清中PTH最高值增加高至2倍，2-5倍，5-10倍，以及至少10倍。血清中PTH最高值是在病人没有进行治疗的时候测定的。
通式(I)化合物及其药学上可接受的盐作为活性物质在口服服用时，可以制成糖浆、片剂、胶囊和锭剂等剂型。糖浆剂通常是化合物或盐在液体载体中的悬浮液或溶液，其中的液态载体例如乙醇，花生油，橄榄油，甘油或水，其中还含有矫味剂或着色剂。当组合物是片剂形式时，通常用于制备固体剂型的药物载体都可以应用。这些载体的实例包括硬脂酸镁，高岭土(terra alba)，滑石，明胶，阿拉伯胶，硬脂酸，淀粉，乳糖和蔗糖。当组合物是胶囊形式时，任何常规的包封材料都是可用的，例如在硬明胶壳时使用上述载体。当组合物是软明胶壳胶囊形式时，常规的用于制备分散体或悬浮液的任何药用载体都是可用的，例如含水(树)胶，纤维素，硅酸盐或油，将它们加入到软明胶胶囊壳中。
典型的非肠胃给药的组合物的组成为化合物或其盐在一种灭菌的含水或不含水的载体中的溶液或悬浮液，其任选地含有肠胃外可接受的油，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂(lecithin)、花生油(arachis oil)或芝麻油。
典型的用于吸入的组合物是溶液、悬浮液或乳液的形式，它们可以通过干粉形式给药，或者采用诸如二氯二氟甲烷或三氯氟代甲烷的常规推进剂的气雾剂形式给药。
典型的栓剂含有在以这种形式给药时作为活性物质的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及粘合剂和/或润滑剂，例如聚二醇类，明胶，可可脂或其他低熔点的植物蜡或脂肪或它们的合成的类似物。
典型的真皮(dermal)和经皮剂型含有常规的水或非水载体，例如乳膏、药膏、洗液或糊剂形式，它们是药用的膏药、贴剂或膜剂形式。
优选，本发明的组合物为单位剂量形式，例如片剂、胶囊或可计量气雾剂形式，这样病人可以服用单一的剂量。
当根据本发明进行给药时，本发明的化合物没有不可接受的毒性作用。
通式(I)化合物的生物活性可以通过下列试验证明(I)钙受体拮抗剂试验钙离子阻断化合物的活性可以通过测定待测化合物阻断稳定表达人钙受体的HEK 293 4.0-7细胞中的由细胞外Ca2+引起的细胞内Ca2+的增加所致的IC50来进行确定。HEK 293 4.0-7细胞可以通过Rogers等人在J.Bone Miner.Res.10 Suppl.1S483，1995(在此引入作为参考文献)中记载的方法构建。细胞内Ca2+的增加可以由细胞外Ca2+的浓度从1到1.75mM的增加而引起。细胞内Ca2+可以采用荧光-3(fluo-3)，一种荧光性钙指示剂来测定。
方法如下1.在T-150烧瓶中，将细胞在5％二氧化碳95％空气中，37℃下，采用选择培养基(DMEM中补充10％胎牛血清和200ug/ml的潮霉素B)培养，融合生长到高达90％。
2.保持温度在37℃，缓慢倒出培养液，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞单层两次。第二次洗后，加入6mL的0.02％EDTA的PBS溶液，在37℃培养4分钟。培养以后，通过缓慢搅拌来分散细胞。
3.集中2或3个烧瓶中的细胞，球化(pellet)(100xg)，将细胞球(cellularpellet)再次悬浮在10-15mL的SPF-PCB+中，通过离心分离再次球化。洗涤两次。
无硫酸或磷酸的甲状旁腺细胞缓冲剂(SPF-PCB)含有20mM为pH7.4的Na-Hepes、126mL的氯化钠、5mM氯化钾和1mM氯化镁。SPF-PCB在4℃制备和储存。使用的当天，补充加入1mg/mL的D-葡萄糖和1mM氯化钙，然后分成两部分。一部分中加入5mg/mL(SPF-PCB+)的牛血清蛋白(BSA；部分V，ICN)。该缓冲液被用来洗涤、载荷和保持细胞。没有BSA的部分用来稀释试管中的用于荧光检测的细胞。
4.用10mL含有2.2uM的荧光-3(分子化探针)的SPF-PCB+将细胞球重新悬浮，在室温下培养35分钟。
5.培养后，通过离心分离将细胞球化。得到的细胞球用SPF-PCB+洗涤。洗毕，用SPF-PCB+将细胞球再次悬浮，密度为1-2×106细胞/mL。
6.为了记录荧光信号，用1.2mL含有1mM氯化钙和1mg/mL的D-葡萄糖的SPF缓冲液稀释300uL的细胞悬浮液。荧光的测量是在37℃恒速搅拌下用分光荧光计(spectrofluorimeter)测得。激发和发射波长分别在485和535nm测得。为了校正荧光信号，加入洋地黄皂苷(digitonin)(在乙醇中浓度为5mg/mL)得到Fmax，通过加入Tris-EGTA(2.5M Tris-Base，0.3M EGTA)得到表观Fmin。细胞内钙的浓度通过下式计算得到细胞内钙浓度＝(F-Fmin/Fmax)×Kd；在此Kd＝400nm。
7.为了确定待测化合物潜在的钙离子阻断化合物活性，在将细胞外Ca2+浓度从1增加到2mM之前，将细胞和待测化合物(或作为对照物的载体)共同培养90秒钟。以浓度依赖性方式，测定钙离子阻断化合物阻断由细胞外Ca2+引起的细胞内Ca2+浓度增加的能力。
通常，在钙受体拮抗抑制剂试验中具有较低的IC50值的化合物是更优选的化合物。认为IC50值大于50uM的化合物是没有活性的，IC50值为10uM或更小的化合物是优选的，更优选的是IC50值为1uM，最优选的是IC50值为0.1uM或更小的化合物。
(II)钙受体结合作用试验被人甲状旁腺钙受体(“HuPCaR”)稳定转染的HEK293 4.0-7细胞在T180组织培养烧瓶中成倍放大。在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4，1mMEDTA，3mM氯化镁)中，在包含1μM Leupeptin、0.04μM Pepstatin和1mMPMSF的蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)的存在下，通过多元均浆作用(polytron homogenizeation)或玻璃杜恩斯匀浆作用(glass douncing)获得血浆薄膜。等份的薄膜被速冻，在-80℃保存。3H标记的化合物经放射性同位素示踪为44Ci/mmol的放射性活性(radiospecific activity)，为了维持放射化学的稳定性，将其等分并储存在液氮中。
在0.5mL的反应容器中，在含有0.1％明胶和10％乙醇的均浆缓冲液中，典型的反应混合物含有2nM3H化合物((R，R)-N-4′-甲氧基-t-3-3′-甲基-1′-乙基苯基-1-(1-萘基)乙胺)，或3H化合物(R)-N-[2-羟基-3-(3-氯-2-氰基苯氧基)丙基]-1，1-二甲基-2-(4-甲氧基苯基)乙胺4-10ug薄膜。培养在冰水浴中进行，采用12×75聚乙烯试管。向每个试管中加入25μL的测试样品的100％乙醇溶液，接着加入400uL冷的培养缓冲液和25μL的40nM3H-化合物的100％乙醇溶液，最终浓度为2nM。结合反应通过加入50uL的用培养缓冲液稀释的80-200ug/mL HEK 293 4.0-7薄膜而启动，在4℃培养30min。洗涤用缓冲液是含有0.1％PEI的50mM Tris-HCl。通过加入100倍过量的未标记的同族的配体(homologous ligand)产生非特异性结合，通常其是总结合量的20％。结合反应使用Brandel Harvestor，通过快速过滤到1％PEI预处理的GF/C过滤器(filter)中而终止反应。。将过滤器放在闪烁液体中，并通过液态闪烁计数器来评估其放射性。
实施例核磁共振波谱采用Bruker AM 250或Bruker AM 400波谱仪，相应地在250或400MHz频率下测得。CDCl3是氘代氯仿，DMSO-d6是六氘代二甲基亚砜，CD3OD是四氘代甲醇。化学位移以四甲基硅烷为内标物，以每百万分之一(*)来定义。NMR数据中的缩写采用如下方式s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，app＝锐峰(apparent)，br＝宽峰。J代表NMR中采用Hertz测得的偶合常数。连续红外波谱(IR)通过Perkin-Elmer 683红外分光光度计测定，傅里叶转换红外波谱(FTIR)在Nicolet Impact 400 D红外分光光度计中测定。IR和FTIR波谱测得的是发射模式，波段位置以波长的导数为单位标记。质谱是使用快速原子轰击(FAB)或电子喷雾(ES)离子化技术在VG 70 FE，PE Syx API III或VG ZAB HF仪器上测定。元素分析在Perkin-Elmer 240C元素分析仪上测定。熔点在Thomas-Hoover熔点仪上测定，并且没有经过校正。所有的温度指的是摄氏温度。
Analtech Silica Gel GF和E.Merck Silica Gel 60 F-254薄层板用于薄层色谱分析。在E.Merck Kieselgel 60(230-400目)的硅胶上进行快速和重力色谱(flash and gravity chromatogramph)。在Rainin或Gilson色谱仪上进行分析性和制备性的HPLC。ODS指的是十八烷基甲硅烷基衍生的硅胶色谱载体。5μApex-ODS指的是标称粒径为5μ的十八烷基甲硅烷基衍生的硅胶色谱载体(Jones Chromatography，Littleton，Colorado制备)。YMC ODS-AQ是一种ODS色谱载体(support)，是YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan的注册商标。PRP-1是一种聚(苯乙烯-二乙烯基苯)色谱载体，是Hamilton Co.，Reno，Nevada的注册商标。Celite是一种由酸洗硅藻土硅胶(acid-washed diatomaceous silica)构成的过滤助剂，是Manville Corp.，Denver，Colorado的注册商标。
根据上述一般的合成方法，合成了下列化合物实施例13-(5-羟基-6-氰基-吡啶-2-基)丙酸乙酯的制备a)2-溴-3-叔丁氧基吡啶在-78℃，硫酸的存在下，用异丁烯的二氯甲烷溶液处理2-溴-吡啶-3-酚，然后回流条件下搅拌18h。浓缩反应混合物，在乙酸乙酯中的残余物用5％的碳酸钠(水)洗涤，干燥，浓缩得到上述标题化合物。
b)3-叔丁氧基-吡啶-2-腈采用Maligres等(四面体快报》40，8193，2000)记载的方法，将在DMF中的实施例1(a)化合物与氰化锌Zn(CN)2、Pd2(dba)3和DPPF在120℃反应20小时。浓缩反应混合物，在乙酸乙酯中的残余物用5％的碳酸钠(水)洗涤，干燥，浓缩，通过快速色谱纯化得到上述标题化合物。
c)6-溴-3-叔丁氧基-吡啶-2-腈将在醋酸中的实施例1(b)化合物与1当量的溴(Br2)在0℃反应。在消耗掉所有的起始原料后，通过加入硫代硫酸钠淬灭反应。浓缩反应混合物，在乙酸乙酯中的残余物用5％的碳酸钠(水)洗涤，干燥，浓缩，通过快速色谱纯化得到上述标题化合物。
d)3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙烯酸乙酯将实施例1(c)化合物、丙烯酸乙酯、醋酸钯(Pd(OAc)2)、P(邻甲苯基)3和DIEA在DMF中的混合物脱气并在100℃加热2h。冷却反应混合物，用水稀释，用二氯甲烷提取。干燥有机部分，浓缩得到上述标题化合物。
e)3-(5-叔丁氧基-6-氰基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯将实施例1(d)化合物和10％Pd/C的乙醇溶液在60psi压力下加H2反应2h。滤除催化剂，浓缩滤液得到上述标题化合物。
f)3-(6-氰基-5-羟基-吡啶-2-基)-丙酸乙酯盐酸盐实施例1(e)的化合物的二氧六环(dioxine)溶液与4N的HCl的二氧六环溶液在室温下反应1h。浓缩反应液，得到上述标题化合物，为其盐酸盐。
实施例2
3-[6-氰基-5-((R)-1-环氧乙烷基甲氧基)-吡啶-2-基]-丙酸乙酯在干丙酮中的实施例1(f)的化合物与(2R)-脱水甘油基3-硝基苯磺酸酯的1∶1的混合物溶液，用碳酸钾(3当量)处理，并在氩气保护下，加热回流18h。冷却反应混合物，过滤，真空浓缩滤液，通过快速柱层析纯化残余物得到上述标题化合物。
实施例32-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙胺的制备a)茚满-2-基-乙酸甲酯在冰浴中，将茚满-2-基-乙酸(Lancaster，20g，0.11mol)的甲醇(200mL)溶液搅拌，并冷却到0-10℃，通过滴加亚硫酰(二)氯(14.8g，0.125mol)而进行反应。将混合物在室温搅拌16h，真空浓缩，用乙酸乙酯溶解油状残余物，用2.5N氢氧化钠，水和盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，真空浓缩得到固化的标题化合物(21g，97％)。
b)1-茚满-2-基-2-甲基-丙-2-醇在冰浴中，将实施例3(a)化合物(6.3g，33mmol)的乙醚(ether)(150mL)溶液搅拌下滴加到1.4 M甲基锂的乙醚(100mL，4.25eq)中。将混合物温热至室温，搅拌2h，通过滴加饱和氯化铵溶液(150mL)来小心地终止反应。分离出水相，用乙醚提取，合并乙醚层，用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，真空浓缩，得到油状的标题化合物，静置可结晶(～89％)。
c)N-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基)-乙酰胺在冰浴中，搅拌下，向浓硫酸(1.7mL)和乙腈(6mL)的混合液中，在45min内，滴加实施例3(b)化合物(3.3g，17.3mmol)的冰醋酸(5mL)溶液。将混合物放至室温，搅拌16h，倾倒进冰水中，用乙酸乙酯提取。合并有机相，用2.5N氢氧化钠、水和盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，真空浓缩，得到油状残余物，用己烷和几滴乙酸乙酯将其研磨(triturate)，加入晶种，冷却得到固体，过滤分离出固体，得到棕褐色固体标题化合物(1.9g，47％)。MS(ES)m/e 23 1.9[M+H]+。将滤液真空浓缩，另外得到油状标题化合物(1.5g，37％)。
d)2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙胺将实施例3(c)的化合物(6.5g，28mmol)在乙二醇(170mL)中的混合物用压碎的氢氧化钾球(pellets)(13g)处理，搅拌、加热到190℃，持续24h。将混合物倾倒进水中，用乙酸乙酯提取。合并有机相，用盐水洗涤，用1N盐酸提取。合并酸性提取液，用乙酸乙酯洗涤，用2.5N氢氧化钠碱化，用乙酸乙酯提取。合并有机提取物，用盐水洗涤，干燥(硫酸镁)，真空浓缩，得到上述标题化合物(3.2g，60％)。MS(ES)m/e 190.6[M+H]+。
实施例43-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-3-基}-丙酸乙酯盐酸盐的制备将在无水乙醇中的1∶1的实施例2化合物和实施例3(d)化合物的混合物搅拌，加热至回流进行8h，冷却，真空浓缩。用二氯甲烷溶解残余物，并用1.0N的HCl的乙醚溶液酸化，得到上述标题化合物。
实施例53-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-3-基}-丙酸的制备在室温、氩气保护下，将实施例4化合物在乙醇和水(3∶1)中的溶液与2.5N氢氧化钠(1.1当量)反应，搅拌过夜。真空除去乙醇，搅拌下，用1N盐酸调节pH到等电点。过滤收集沉淀出的固体，用水洗涤，真空干燥，得到上述标题化合物。
权利要求
1.具有下述通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐 其中A是芳基或稠合的芳基、二氢或四氢稠合的芳基、杂芳基或稠合的杂芳基、二氢或四氢稠合的杂芳基，它们是未取代的或被选自OH、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C3-6环烷基、CF3、OCF3、CN和NO2的基团取代的；D是C或N，在环中具有1-2-N，条件是当D为N时，X1-X5不存在；X1和X5独立地选自氢、卤素、CN和NO2，条件是X1或X5是氢；另外条件还有当D为N时，X1和X5不存在；X2、X3和X4选自氢、卤素、O-C1-4烷基和J-K，其中J是共价键、亚烷基、O-亚烷基或亚烯基；和K选自CO2R5、CONR4R4’、OH、NR4R4’和CN，条件是当D是N时，X2、X3和X4不存在；R4和R4’独立地是氢、烷基、芳基或杂芳基；R5是氢、烷基、烷基-(O-烷基)m-O-烷基、芳基或杂芳基；n是0-4的整数；和，m是1-3的整数。
2.按照权利要求1所述的化合物，所述化合物选自3-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸乙酯；3-{6-氰基-5-[(R)-2-羟基-3-(2-茚满-2-基-1，1-二甲基-乙基氨基)-丙氧基]-吡啶-2-基}-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-乙基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸；3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸乙酯；和3-(6-氰基-5-{(R)-2-羟基-3-[2-(4-甲氧基-苯基)-1，1-二甲基-丁基氨基]-丙氧基}-吡啶-2-基)-丙酸。
3.一种拮抗钙受体的方法，其包括给有所需要的受试主体服用有效量的权利要求1所述的化合物。
4.一种治疗特征为骨或矿物质体内平衡异常的疾病或失调的方法，其包括给有所需要的受试主体服用有效量的权利要求1所述的化合物。
5.按照权利要求4所述的方法，其中骨或矿物质疾病或失调选自骨肉瘤、牙周病、骨折愈合、骨关节炎、关节复位、风湿性关节炎、Paget氏疾病、体液性血钙过多、恶性肿瘤和骨质疏松。
6.按照权利要求5所述的方法，其中骨或矿物质疾病或失调是骨质疏松。
7.按照权利要求6所述的方法，其中化合物与抗吸收剂联合应用。
8.按照权利要求7所述的方法，其中抗吸收剂选自雌激素、1，25-二羟基维生素D3、降血钙素、选择性雌激素受体调节剂、血浆糖蛋白受体拮抗剂、V-H+-ATP酶抑制剂、src SH2拮抗剂、二膦酸和组织蛋白酶K抑制剂。
9.一种增加血清甲状旁腺量的方法，其包括给有所需要的受试主体服用有效量的权利要求1所述的化合物。
10.按照权利要求9所述的方法，其中化合物与抗吸收剂联合应用。
11.按照权利要求10所述的方法，其中抗吸收剂选自雌激素、1，25-二羟基维生素D3、降血钙素、选择性雌激素受体调节剂、血浆糖蛋白受体拮抗剂、V-H+-ATP酶抑制剂、src SH2拮抗剂、二膦酸和组织蛋白酶K抑制剂。
全文摘要
本发明提供了一种新的磷酸酯类化合物以及将其作为钙离子阻断化合物应用的方法。
文档编号A61K38/23GK1520401SQ01821324
公开日2004年8月11日 申请日期2001年10月25日 优先权日2000年10月25日
发明者普拉迪普·巴特纳加尔, 乔尔·L·伯吉斯, 詹姆斯·F·卡拉汉, 玛丽亚·A·拉戈, A 拉戈, F 卡拉汉, L 伯吉斯, 普拉迪普 巴特纳加尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司