专利名称：一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及ー种定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及ー种实时荧光定量RT-PCR检测人糖基转移酶，Lc3合成酶3 3Gn-T5的试剂盒，是ー种通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，精确定量检测标本中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞 是单克隆性的，即ー个肿瘤中的所有瘤细胞均是ー个突变的细胞的后代。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)。目前肿瘤的发生率与死亡率居高不下，并且有愈演愈烈的趋势，已经成为威胁我国及世界人民健康的一大类疾病。对于肿瘤的治疗一直是大家研究的热点，但是就目前的情况来看，恶性肿瘤的治愈还有很大的难度，然而如果能对肿瘤患者进行早期的诊断，对进一歩制定治疗方案有非常重要的意义，是提高肿瘤治愈率的重要途径之一。而肿瘤的早期诊断有赖于肿瘤特异性标记的发现，肿瘤特异性标记是目前肿瘤领域的研究热点之一，肿瘤相关的蛋白有80%是糖蛋白，多种糖脂亦与肿瘤密切相关，所以控制糖脂的糖基转移酶也受到关注。急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是ー种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速，其特点是由造血干细胞恶变而形成的原始细胞克隆取代了正常骨髄造血。由于白血病细胞代替了正常血细胞，它们不具备正常血细胞的功能，由此导致贫血，血小板和粒细胞減少而引发一系列并发症。若不经过治疗，存活期一般不超过半年。有的病例从诊断到死亡，甚至不过一周，死亡的主要原因是出血和感染。目前标准化疗可以获得约70 80%的完全缓解(Complete Remission，CR)率，但大部分CR后的患者终将复发，甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病，治疗无效而死亡。分子生物学从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质，近年来，随着分子生物学的迅速发展及其在医学领域的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在临床组织样本中进行肿瘤特异性标记的检测已成为可能并被尝试。RT-PCR比传统的检测方法具有较高的灵敏度及特异性，能够在复杂的生物样本中检测到极其微量的肿瘤特异性标记物，对于肿瘤的早期诊断以及长期的预后具有十分重要的价值。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，提高检测的特异性、灵敏度和准确率。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，包括逆转录体系和PCR扩增体系；所述逆转录体系包括T重复寡核苷酸OlogodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs ;所述PCR扩增体系包括SYBRGreen聚合酶链反应体系、引物对；
其中，所述逆转录反应液含有焦炭酸ニこ酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液；
所述SYBR Green聚合酶链反应体系含有PCR缓冲液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green荧光染料；所述模板cDNA包括正常人骨髓样本cDNA和急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA，其中，正常人骨髓样本cDNA作为阴性对照，急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA作为阳性对照；
所述引物对为可扩增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物对，本领域技术人员可以根据引物设计的常规技术设计；优选的技术方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中上游引物具有SEQ ID No. I所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3';下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5' -cggctgtgtagtcagggtaag-31 ;人 P-actin 上游 引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3';下游引物具有 SEQID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。上述技术方案中，所述焦炭酸ニこ酯处理的水的制备方法为将焦炭酸ニこ酯原液与超纯水按照体积I : 1000稀释，搅拌12 24小时，取该混合均匀的溶液进行高压湿热灭菌即制得焦炭酸ニこ酯处理的水。上述技术方案中，所述M-MLV逆转录酶缓冲液包括250mM PH8. 3的Tris-HCl，375mM 的 KCl，15mM 的 MgCl2，50mM 的 DTT。上述技术方案中，所述RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为E. coli表达的非竞争性抑制RNase的重组蛋白酶。上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选的技术方案中，所述PCR缓冲液包括25mM的KCl，终浓度2. 5mM的MgCl2, 200mM的(NH4)2S04。上述试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。上述试剂盒的使用方法包括以下步骤
(1)逆转录配置逆转录反应体系，每20y L的逆转录反应体系包括10 y L的待测样品的RNAUiiL的Ologo dT共浴70°C 10分钟，取出立即置于冰上2分钟，再加入2iiL的dNTPs、liiL的RNA酶抑制剂、5 ii L的逆转录反应液及Iii L的M-MLV逆转录酶，共浴420C 60分钟，然后700C 10分钟，得到cDNA，4°C保存；
(2)在荧光定量PCR仪上进行扩增检测配置PCR扩增反应体系，每25yL的PCR扩增反应体系包括SYBR Green聚合酶链反应体系12. 5 u L,上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 ii L ;反应条件为50°C 2分钟，95°C 10分钟，95°C 15秒、60°C 60秒共40个循环；得到待测样品的荧光定量PCR扩增结果；
(3)采用步骤(2)的方法对试剂盒中的模板cDNA进行荧光定量PCR扩增，得到阳性对照和阴性对照的荧光定量PCR扩增结果；然后分析上述待测样品、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增结果的Ct值(P 3Gn-T5)和Ct值(P -actin)，通过公式^ 3Gn_T5的mRNA相对水平=计算得到待测样品、阳性对照、阴性对照的P 3Gn-T5的mRNA相对水平，以待测样品的P 3Gn-T5的mRNA相对水平值和阳性对照、阴性对照的P 3Gn_T5的mRNA相对水平相比，即可判断待测样品是否取自AML患者。
上述技术方案中，DEPC水溶液是ー种g在通过焦碳酸ニこ酯(DEPC)处理，以彻底清除RNA酶的无离子水溶液；酰化剂ニこ基焦碳酸酯(diethylprocarbonate,DEPC),是RNA酶的化学修饰剂，和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，还可灭活其它各种蛋白质。本发明的主要原理是Lc3合成酶P 3Gn-T5是控制鞘糖脂合成的关键的糖基转移酶，是与AML相关的特异性较高的肿瘤特异性标记。在AML患者骨髓组织中检测出Lc3合成酶P 3Gn-T5的高表达，可以对AML的诊断及治疗提供有力证据。通过RT-PCR进行微量肿瘤特异性标记的检测，可以较准确地进行定量，相比传统方法具有较高的灵敏度。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
I.本发明建立了利用SYBR Green技术检测Lc3合成酶P 3Gn_T5的表达的方法，并提供一种可以方便准确灵敏地诊断急性髓细胞白血病的试剂盒。2.由于本方法采用了 PCR扩增技术，使得表达的检测敏感度大大提高，而且由于荧光染料的应用，使其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得检测人员可以在极少的标本中获得足够的信息。3.本发明中设计的引物以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。
图I为实施例中正常人的骨髓样本中提取RNA同样经过逆转录和PCR扩增曲线； 图2为实施例中正常人骨髓样本与AML病人骨髓样本中Lc3合成酶P 3Gn-T5表达对比图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进ー步描述
实施例一诊断人AML发生的荧光RT-PCR方法
(I)材料
Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，Ologo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、SYBR Green聚合酶链反应体系、PCR缓冲液均购自美国Fermentas公司，ABI 7500荧光定量系统为美国Applied Biosystems公司产品。(2)引物设计与合成
以全长cDNA序列为模板，使用Prime5软件分析引物位点，并根据同时考虑基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。检测人Lc3合成酶@ 3Gn-T5用上游引物序列为
5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 ';检测人 Lc3 合成酶 P 3Gn_T5 用下游引物序列为5 ' -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;检测人P-actin用上游引物序列为 5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';检测人 P-actin 用下游引物序列为5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'，均由上海生エ公司合成。(3)标本检测
从12例AML患者骨髓样本和6例正常人骨髓样本提取总RNA，经逆转录总体积20 u L，、其中IOuLRNA与IuL Ologo dT共浴70°C 10分钟，取出马上置于冰上2分钟，再加入2 u LdNTPsUuL RNA酶抑制剂、5uL逆转录反应液及IuL M-MLV逆转录酶，共浴42 °C 60分钟，然后70°C 10分钟，4°C保存。在荧光定量PCR仪上进行，总体积25 u L，其中SYBR Green聚合酶链反应体系12. 5 u L，上下游引物各0. 25 u L，cDNA2 u L，DEPC水10 uし反应条件50°C 2分钟，95。。10分钟，95°C 15秒、60°C 60秒共40个循环。进行Real time PCR实验，得到图1，从图I可
知实验可靠，得到合格的扩增曲线。通过ABI 7500 System软件导出Ct值，得到表1， 从表I可知P 3Gn_T5和^ -actin的Ct值，表中No. 1-6是正常对照，No. 7 18是AML患者。表I. P 3Gn_T5 和 & -actin 的 Ct 值
No. Jct 值(P 3Gn-T5) ICt 值(g -actin)
122.3114.81
222.9414. 14
322. 6014. 58
420. 9015. 32
521.1913.28
630. 0021. 25
728. 2020. 72
832. 6230. 27
927. 7023. 32
1026. 2022.05
1133.1425. 47
1228. 8727. 14
1328. 1824. 17
1427. 1024. 63
1534.1626. 75
1630. 1928. 15
1732.1927. 00
18[26. 04123. 15
将正常人和AML患者的Ct值结果进行分析，通过公式P 3Gn-T5的mRNA相对水平=，得到表2，表中No. 1-6是正常对照(平均值为0. 0065)，No. 7 18是AML患者(平均值为0. 1055)
表2. Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相对水平
No.丨g3Gn-T5 INo. I》3Gn-T5 [No. [g3Gn-T5
10.0055 7 0.0056 13 0.0622
20.0022 8 0. 1953 14 0. 1801
30.0039 9 0.0481 15 0.0059
40.0209 10 0.0561 16 0.2426
50.0042 11 0.0049 17 0.0275
6jo. 0023 112 10. 3022 [18 Jp. 1353
从表2可知急性髓细胞白血病患者和正常对照中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA相对水平。对比正常人骨髓样本与AML病人骨髓样本中Lc3合成酶P 3Gn_T5表达结果，得到图2，从图2可知急性髓细胞白血病患者骨髓中Lc3合成酶P 3Gn-T5的mRNA水平高于正常对照。
权利要求
1.一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，包括逆转录体系和PCR扩增体系；其特征在于，所述逆转录体系包括重复T寡核苷酸Ologo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs ;所述PCR扩增体系包括SYBR Green聚合酶链反应体系、引物对； 其中，所述逆转录反应液含有焦炭酸ニこ酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液；所述SYBR Green聚合酶链反应体系含有PCR缓冲液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green荧光染料；所述引物对为可扩增人Lc3合成酶P 3Gn-T5和人P -actin的引物对。
2.根据权利要求I所述诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，其特征在于，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中人Lc3合成酶P3Gn-T5上游引物具有SEQ IDNo. I 所示序列5' -ttttggattggtcgtgttcat-3 1 ;下游引物具有 SEQ ID No. 2 所示序列5 1 -cggctgtgtagtcagggtaag-3 1 ;人 P -actin 上游引物具有 SEQ ID No. 3 所示序列5 ' -CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3 ';下游引物具有 SEQ ID No. 4 所示序列5' -GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3'。
3.根据权利要求I所述诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，其特征在于，所述模板cDNA包括正常人骨髓样本cDNA和急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA，其中，正常人骨髓样本cDNA作为阴性对照，急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA作为阳性对照。
全文摘要
本发明公开了一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，包括逆转录体系和PCR扩增体系；其特征在于，所述逆转录体系包括重复T寡核苷酸OlogodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述PCR扩增体系包括SYBRGreen聚合酶链反应体系、引物对；其中，所述逆转录反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液；所述SYBRGreen聚合酶链反应体系含有PCR缓冲液、模板cDNA、dNTPs、SYBRGreen荧光染料；所述引物对为可扩增人Lc3合成酶β3Gn-T5和人β-actin的引物对。本发明建立了利用SYBRGreen技术检测Lc3合成酶β3Gn-T5的表达的方法，并提供一种可以方便准确灵敏地诊断急性髓细胞白血病的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102643899SQ20121005845
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者李云森, 王征, 王艳萍 申请人:苏州大学