和厚朴酚在急性髓细胞白血病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及了一种中药在白血病中的应用，尤其是设及了一种和厚朴酪在急性髓 细胞白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白的应用及其泛素化机制，和厚朴酪是能够特效祀 向降解AMLl-ETO蛋白的化学药物。
【背景技术】
[0002] 急性髓细胞白血病是髓系造血干细胞恶性疾病。W骨髓与外周血中原始和幼稚髓 性细胞异常增生为主要特征，传统治疗W联合化疗为主，患者的完全缓解率和长期无病生 存率均不高。
[0003] M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病（Acute myeloid Ie址emia，AML)约占所 有AML的10-15% 型AML存在特异的染色体易位t(8;21)。该易位使21号染色体上的AMLl 和8号染色体上的ETO融合形成AMLl-ETO融合基因。AMLl-ETO融合蛋白是染色体易位t(8; 21)(q22; q22)的产物，见于15 %的急性髓细胞性白血病。该融合蛋白全长含有752个氨基 酸，其N端为RUNXUrunt-related hanscription factor 1)也称为AML1，由染色体21q22 编码，是造血分化过程中的一个重要的转录因子，含有结合DNA的结构域。C端为RUN XlTl [runt-rel曰ted transcription factor I;translocated to,!(cyclin D-rel曰te d)]，由 染色体8q22编码，也称为ETO。目前普遍认为，AMLl-ETO蛋白主要通过抑制野生型AMLl的转 录激活功能，阻断正常的造血干细胞分化，从而促进白血病的发生。用特异性SiRNA抑制 AMLl-ETO表达后，白血病细胞增殖减少，同时伴随分化增多。因此，AMLl-ETO融合蛋白是M2 型白血病最主要的致病因素，抑制或快速降解AMLl-ETO蛋白具有重要的临床治疗意义。
[0004] 泛素-蛋白酶体通路是细胞内蛋白降解的重要途径，泛素启动酶系统负责活化泛 素，并将其与待降解的蛋白结合，形成祀蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可W识 别已泛素化的蛋白并将其降解。其中，泛素连接酶E3具有底物的多样性和选择性，决定了蛋 白降解的特异性。泛素介导的蛋白质降解途径的异常与肿瘤的发生密切相关。Kramer等报 道:组蛋白去乙酷化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)通过增强UBC册和SIAH-I表达降 解AMLl-ETO蛋白。冬凌草甲素(Oridonin)通过诱导调亡，快速剪切并降解AMLl-ETO融合蛋 白，呈现出良好的体外抗白血病活性。
[0005] 前期实验也证明和厚朴酪通过抑制组蛋白去乙酷化酶活性，诱导白血病细胞调 亡，抑制白血病细胞增殖。和厚朴酪在急性髓细胞白血病中通过上调胞质酪氨酸憐醋酶 (SHPl)表达水平，抑制JAK2/STAT信号通路。同样，在实体肿瘤中，和厚朴酪通过多种机制抑 制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移。然而，和厚朴酪在细胞内的独特祀标至今未有报道。和厚朴酪 作为木兰科植物厚朴的主要活性成分，历代主要本草中所载正品厚朴其药用部位均为树 皮。然而据调查发现国内大量厚朴叶未加利用，任其调落腐烂。
[0006] 和厚朴酪具有多种药理作用，包括抗炎，抗屯、律失常，抗癒痛，抗血小板，抑制肌肉 收缩和抗菌，此外还抑制肿瘤坏死因子a的表达活性等。由于上述药理作用，现有技术中和 厚朴酪常用于直接和间接治疗癌症，国内外均有许多针对和厚朴酪的抗肿瘤作用进行的研 究，但现有技术中没有人提出将和厚朴酪在细胞内的独特祀标设及用于疾病等领域的应 用。
【发明内容】
[0007] 为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明所提供了一种和厚朴酪在急性髓细胞白 血病中的应用和用途，在急性髓细胞白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] -、和厚朴酪在治疗或预防白血病和制备白血病药物中的应用。
[0010]所述和厚朴酪在白血病中快速降解AMLl-ETO融合蛋白的应用和用途。
[0011]所述和厚朴酪用于特效祀向降解AMLl-ETO蛋白来治疗或预防白血病。
[001。具体地，所述和厚朴酪通过UBC册泛素化途径特效祀向降解AMLl-ETO蛋白。
[0013] 所述和厚朴酪为CAS号35354-74-6，全称为3 '，5-二-2-丙締基-1，1' -联苯-2，4 ' -二酪，5,3 ' -Dial Iy 1-2,4 ' -dihy 化 oxybipheny 1，分子式为 Cl 抽 18〇2，分子量为 266.33。
[0014] 上述，所述白血病为M2型急性髓细胞白血病，和厚朴酪针对于M2型急性髓细胞白 血病通过UBC册泛素化途径特效祀向治疗。
[0015] 二、一种治疗白血病的药物，其成份中包含和厚朴酪。
[0016] 所述白血病为M2型急性髓细胞白血病，和厚朴酪针对于M2型急性髓细胞白血病通 过UBC册泛素化途径特效祀向治疗。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 多种研究证明AMLl-ETO融合蛋白是M2型白血病发病的关键因素。然而，目前为止， 能够特效祀向降解AMLl-ETO蛋白的化学药物未能进入临床实践。和厚朴酪作为中药小分子 常用于治疗癌症，由于其多重药理功能，和厚朴酪被认为是一种功能众多，祀点"模糊"的活 性小分子。而本发明将和厚朴酪用于快速特效祀向降解AMLl-ETO融合蛋白，提出其作用及 其泛素化机制，具有降低急性髓细胞白血病的发病和致病几率的作用。
[0019] 本发明的和厚朴酪是一味具有广泛药效作用的中药厚朴的主要作用成分，在国内 外用于多种疾病的治疗，新的药效又不断被发现尤其是其较好的抗病毒、抗肿瘤、防離、抗 菌的药效，越来越受到人们的重视，且厚朴的分布地区较广，栽培简便，资源丰富。
[0020] 本发明通过在体外筛选系列小分子天然化合物后发现和厚朴酪化onokiol，HNK) 能够快速降解内源及外源表达的AMLl-ETO融合蛋白，并进一步通过表达谱基因忍片发现和 厚朴酪明显增强E2泛素结合酶UBC册表达水平。通过UBC册敲除实验，在细胞株、原代细胞、 动物模型全方位验证和厚朴酪降解AMLl-ETO融合蛋白的机制。
[0021] 本发明的和厚朴酪特效祀向降解AMLl-ETO融合蛋白，并在细胞株、原代细胞、动物 模型全方位验证和厚朴酪降解AMLl-ETO融合蛋白的机制。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例的逻辑框架。
[0023] 图2为实施例1不同时间40測HNK处理KASUMI-I细胞后，western blotting(WB)检 测AMLl-ETO融合蛋白。
[0024] 图3为实施例1不同浓度HNK处理KASUMI-I细胞24和48小时后，WB检测AMLl-ETO融 合蛋白。
[0025] 图4为实施例1中40yM HNK处理KASUMI-I细胞24或48小时后，RT-PCR法检测AMLl-ETO转录水平。
[00%] 图5为实施例1中扣M Pon A诱导U937T细胞24和48小时后，WB检测AMLl-ETO融合蛋 白。
[0027] 图6为实施例1不同时间40yM HNK处理U937T后，WB检测AMLl-ETO融合蛋白。
[002引图7为实施例1中Pon A诱导表达的U937T细胞经40yM HNK24和48小时后，WB检测 AMLl-ETO融合蛋白。
[0029] 图8为实施例2中40iiM HNK处理两位临床M2型白血病患者原代细胞24小时后，WB检 测AMLl-ETO融合蛋白。
[0030] 图9为实施例2中40iiM HNK处理两位临床M2型白血病患者原代细胞24小时后，RT-PCR法检测AMLl-ETO转录水平。
[0031] 图10为实施例3中不同浓度HNK处理KASUMI-I后，流式细胞技术检测早期调亡信号 Annexin V水平。
[0032] 图11为实施例3中不同浓度HNK处理KASUMI-I细胞24小时后，WB检测capaseS蛋白。
[0033] 图12为实施例3中化M蛋白酶体抑制剂MG132和40咖HNK同时处理KASUMI-I后，WB 检测AMLl-ETO融合蛋白。
[0034] 图13为实施例4中40測HNK处理KASUMI-I细胞和如M Pon A诱导后的U937T细胞24 小时后，WB检测UBC册融合蛋白。
[0035] 图14为实施例4中40iiM HNK处理原代细胞24小时后，WB检测UBC册蛋白。
[0036] 图15为实施例4中40測HNK处理KASUMI-I细胞和如M Pon A诱导后的U937T细胞24 小时后，RT-PCR法检测UBC册转录水平。
[0037] 图16为实施例4中40咖HNK处理特异性ShRNA抑制UBC服表达的KASUMI-I细胞后， WB检巧阳BC册和AMLl-ETO融合蛋白。
[003引图17为实施例4中IiiM HNK处理斑马鱼白血病模型48小时后，斑马鱼血管增生情 况。
[0039] 图18为实施例4中化M HNK处理斑马鱼白血病模型48小时后，KASUMI-I细胞在斑马 鱼体内迁移情况。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并 不仅限于此。
[0041] 本发明的内容为发现和厚朴酪快速特效降解AMLl-ETO蛋白及其泛素化机制，是能 够特效祀向降解AMLl-ETO蛋白的化学药物，为治疗AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病提供 相关药物依据。
[0042] 和厚朴酪，3'，5-二-2-丙締基-1,1 联苯-2,4'-二酪，5,3'-Diallyl-2,4'-dihyhowb i地eny 1分子式及分子量Cl抽18〇2，266.33，溶于DMS0。
[0044] 本发明实施