例的逻辑框架如图I所示，具体实验如下：
[0045] 实施例1-和厚朴酪快速特效降解M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病细胞 AMLl-ETO蛋白实验：
[0046] 方法；
[0047] A)在不同时段，用不同浓度和厚朴酪化onokiol，HNK)处理M2型AMLl-ETO阳性的急 性髓细胞白血病细胞KASUMI-I (RPMI 1640培养基，20 %胎牛血清，5 % C02和95 %加湿空气 37°C培养），然后采用W下两种方式处理，再用蛋白质印迹法（免疫印迹试验，即Western 81〇1，胖8)及逆转录?0?片日￥日'36化日邮沈1911〇11?0?，1?1'斗0〇检测细胞411^-61'0融合蛋白 及mRNA表达情况(Western Blot-律取细胞浓度2 X IO5个/毫升，RNA取2 X IO6个/毫升，流式 细胞技术取5 X IO5个/毫升处理）；
[004引一种方式是用40yMHNK加入到KASUMI-I中，分别在0、4、8、16、24和48小时后通过 Western Blot检测AMLl-ETO融合蛋白表达情况及其mRNA水平。
[0049] 另一种方式是用不同浓度HNK(0、10、20和40iiM)加入KASUMI-I培养基中，分别在24 和48小时后通过Western Blot检测AMLl-ETO融合蛋白表达情况及其mRNA水平。
[00加]B)在Pon A诱导表达AMLl-ETO的U937细胞化937T，RPMI 1640培养基，10%胎牛血 清，5%C02和95%加湿空气37°C培养)培养基中加入加 M的pon A作用48小时，诱导U937T细 胞产生大量外源性的AMLl-ETO融合蛋白，然后采用W下两种方式处理：
[0051 ] 一种方式是用40測的HNK加入诱导后的细胞系和KASUMI-I细胞，分别在0、8、16、24 和48小时后检测AMLl-ETO融合蛋白水平。
[0052] 另一种方式是用不同浓度HNK(0、10、20和40咖)加入诱导后的细胞系和KASUMI-I 细胞，分别在24和48小时后检测AMLl-ETO融合蛋白水平。
[0053] 试验结果：对于内源表达AMLl-ETO的KASUMI-I细胞系和外源ponasterone A诱导 表达AMLl-ETO的U93n细胞系（如图5)，如图2和图6所示，图中可见经40iiMHNK分别处理0、4、 8、16、24和48小时后，AMLl -ETO融合蛋白浓度均呈时间依赖性降低；如图3和图7所示，图中 可见经不同浓度(0、10、20、4化M)处理2地和48小时后，AMLl-ETO融合蛋白浓度降低，并且 HNK浓度越高，融合蛋白浓度越低；如图4所示，经HNMOiiM处理24h和48小时后，其mRNA水平 没有明显改变。
[0054]实施例2-和厚朴酪快速特效降解AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病原代细胞 AMLl-ETO融合蛋白实验：
[0化日]方法:经40iiM浓度和厚朴酪处理AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病细胞24小时 后，用蛋白质印迹法及逆转录PCR检测细胞AMLl-ETO融合蛋白及mRNA表达情况；
[0化6] 试验结果：如图8和图9所示，图中可见原代细胞经40iiMHNK处理24小时后，AMLl- ETO融合蛋白浓度降低;其mRNA水平同样没有明显改变。
[0057] 实施例3-和厚朴酪快速特效降解M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病AMLl- ETO融合蛋白调亡相关实验：
[0化引方法：用不同浓度(0、10、20和40iiM)HNK加入到M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞24 小时，用蛋白质印迹法及流式细胞技术，检测其调亡相关蛋白表达情况及早期细胞调亡情 况，40iiMHNK和化M蛋白酶体抑制剂MG132共同处理后，用蛋白质印迹法检测MLl-ETO融合蛋 白表达情况，
[0059] 试验结果：如图10所示，图中可见KASUMI-I细胞分别经不同浓度(0，10，20，40咖） HNK处理24小时和40iiMHNK分别处理24小时后，早期调亡信号AnnexinV融合蛋白浓度略有升 高，并且HNK浓度越高，AnnexinV越高，细胞有一定的调亡反应。
[0060] 如图11所示，图中可见细胞调亡相关蛋白caspase3没有明显变化，如图12所示，图 中可见与只有HNK处理组相比，用蛋白酶体抑制剂MG132和HNK同时处理KASUMI-I细胞24小 时后AMLl-ETO蛋白降解受到抑制，证明HNK通过泛素-蛋白酶体通路降解AML1-ET0。
[0061 ] 实施例4-和厚朴酪快速特效促进M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病AMLl- ETO融合蛋白泛素化相关验证实验
[0062] 方法：用40咖和厚朴酪加入到M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病细胞系，24 小时后提取RNA进行基因忍片筛选，用蛋白质印迹法检测UBC册化be册是人的泛素结合酶基 因 UBE2L6编码的蛋白，属于主要包含师C结构域的第一类泛素结合酶家族(ClassIE2s)成 员），再用逆转录PCR检测UBC册的mRNA水平;在使用特异性ShRNA干扰UBC册表达后，检测和 厚朴酪降解AMLl-ETO融合蛋白情况。
[0063] 试验结果:KASUMI-I基因忍片结果显示(如下表1)
[0064] 表 1
[0066] 经HNK处理后UBC册/UBE2L6蛋白表达明显提高，同时如图13-15所示，图中可见其 内源，外源W及原代细胞WB和RT-PCR结果证明了 UBC服水平随着HNK处理的时间变长而增 局。
[0067] 当UBC册表达经ShRNA干扰后，同时如图16所示，图中可见HNK降解AMLl-ETO融合蛋 白能力受到抑制。由此可见，和厚朴酪通过UBC册介导的泛素化机制降解AMLl-ETO融合蛋 白。
[006引实施例5-和厚朴酪快速特效降解M2型AMLl-ETO阳性的急性髓细胞白血病AMLl-ETO融合蛋白的斑马鱼相关实验：
[0069] 方法:使用显微注射仪，将准备好的悬浮于活细胞染色剂CM-DIL红色巧光标记的 KASUMI-I细胞植入受精后4.5-5.化斑马鱼胚胎的卵黄中部，每个鱼卵注射约5nL，总共注射 约200细胞。注射后转入E3培养液(每1000 L去离子水中含292.5g氯化钢、12.67g氯化钟、 36.63g氯化巧和39.6g硫酸儀.调节PH只7.2)，33°C解箱下培养，待受精后24h换含有PTU的 E3培养液继续培养，并持续观察至受精第=天后进行碱性憐酸酶染色法染色(3ml碱性憐酸 酶液，10微升BCIP，20微升NBT)，观察斑马鱼血管增生情况并拍照记录(分组为正常对照组， 正常HNK处理组和造模后对照组，造模HNK处理组）。
[0070] 将准备好的悬浮于CM-DIL的红色巧光标记的KASUMI-I细胞植入受精后4她斑马鱼 胚胎肠下血管的卵周膜间隙，每条鱼注射10化，约400个细胞。注射后转入含有PTU的E3培养 液33°C解箱下培养并加入化M HNK，持续观察48小时，用巧光显微镜观察其巧光标记细胞转 移情况并拍照记录(分组为造模后对照组与造模HNK处理组，W上分组为获得统计学上有意 义的结果，每组必须超过50条）。
[0071] 实验结果:KASUMI细胞植入受精后4.5-5.化斑马鱼胚胎卵黄中部后，于受精后第 =天观察血管增生，如图17所示，图中可见与正常组相比，注射细胞并经HNK处理4她组血管 增生高于未注射细胞组，但明显低于注射细胞后处理组。
[0072] 同时观察KASUMI-I细胞植入受精后4她的斑马鱼胚胎肠下血管的卵周膜间隙，如 图18所示，图中可见与造模后对照组相比，注射细胞并经HNK处理4她组的细胞迁移率下降。
[0073] 由此通过上述实施例细胞株、原代细胞、动物模型全方位验证可见，本发明将和厚 朴酪用于快速特效祀向降解AMLl-ETO融合蛋白W用于治疗和制药，并提出其作用及其泛素 化机制，能降低急性髓细胞白血病的发病和致病几率。
【主权项】
1. 和厚朴酚在治疗或预防白血病和制备白血病药物中的应用和用途。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述和厚朴酚在白血病中快速降解AML1-ET0 融合蛋白的应用和用途。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述和厚朴酚用于特效靶向降解AML1-ET0蛋 白。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述和厚朴酚通过UBCH8泛素化途径特效靶 向降解AML1-ET0蛋白。5. 如权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于:所述和厚朴酚为3 '，5-二-2-丙烯基-1，1 '_联苯_2，4 ' -二酸，5，3 ' -Dial ly 1-2，4 ' -dihydroxybipheny 1，分子式为 Ci8Hi8〇2，分子量 为266.33。6. 如权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于:所述白血病为M2型急性髓细胞白血 病。7. -种治疗白血病的药物，其特征在于其成份中包含和厚朴酚。8. 如权利要求7所述的药物，其特征在于:所述白血病为M2型急性髓细胞白血病。
【专利摘要】本发明公开了一种和厚朴酚在急性髓细胞白血病中的应用。和厚朴酚用于治疗白血病和制备白血病药物，和厚朴酚通过UBCH8泛素化途径特效靶向降解AML1-ETO蛋白，可用于M2型急性髓细胞白血病的应用。本发明将和厚朴酚用于快速特效靶向降解内源及外源表达的AML1-ETO融合蛋白，提出其作用及其泛素化机制，在分子生物学和斑马鱼模型应用上已经证明，和厚朴酚能降解AML1-ETO蛋白，从而达到抗白血病治疗效应。
【IPC分类】A61P35/02, A61K36/575, A61K31/05
【公开号】CN105560217
【申请号】CN201610115198
【发明人】周斌, 高申孟
【申请人】周斌
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月1日