专利名称：一种大黄鱼白细胞介素－1β(IL-1β)基因克隆方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大黄鱼白细胞介素一I β (IL-Ιβ)基因及其克隆方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
白细胞介素-I是1972年发现的一种细胞因子，由于其功能的多样性，又被称为淋巴细胞活化因子、白细胞内源性递质、内源性热原质等，是一种主要起免疫调节作用的激素样妝类物质，即促炎细胞因子[I. Bazan JF, Timans JC, Kastelein RA. A newly defined interleukin — I Nature 1996,379 f6566) :591]。IL-I β 是 IL-1 的主要分泌形式，与 IL-Ia相比，IL-I β能通过远距分泌作用于靶细胞，在炎症反应中的作用更为显著[Leon LR. Invited review cytokine regulation of fever studies using gene knockout mice. JAppl Physiol, 2002,92 (6) :2648— 2655]。IL-I β 一般无前体状态的储存，当产生IL-I β的细胞受到刺激后，启动IL-I β基因转录，此过程通常十分短暂，而且IL-I β 的mRNA极易降解。IL-I β 的生物学作用细胞内产生的IL-Ιβ以前体形式存在，须经 caspasel (又称IL-I β转化酶，ICE)裂解才具有生物活性并分泌至细胞外[Mariathasan S, Newton K, Monack DM, et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature,2004,430 (6996) :213-218]。活性形式的IL-I β可引发多种生物学反应.包括激活巨噬细胞、T细胞和信号级联反应，以及诱导环氧合酶一 2(C0X. 2)和发热反应[Sekiyama A, Ueda H, Kashiwamura S, et al. A stress-induced. superoxide—mediated caspase-1 activation pathway causes plasma IL-18 upregulation. Immunity, 2005,22 f6) :669—677]。大量研究发现 IL-I β在多种疾病的发生、发展中起重要作用[Dinarello CA. The IL-I family and inflammatory diseases. Clin Exp Rheumatol, 2002, 20 (5 Suppl 27) :S1_S13],但是，目前尚无大黄鱼IL-I β序列的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种大黄鱼白细胞介素一 1β (IL-Ιβ)基因及其克隆方法。本发明在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，并为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种大黄鱼白细胞介素一 I β (IL-1 β )基因，具有序列表中SEQ ID NO. I碱基序列及 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。一种大黄鱼白细胞介素一 1β (IL-1 β)基因的克隆方法，包括如下步骤
(I)从大黄鱼的肾脏组织中提取总RNA;(2)然后进行cDNA第一链合成；
(3)根据其他鱼类IL-Ιβ的保守序列设计引物进行PCR反应，得到大黄鱼 IL-I β基因片段，其中正向引物Fl 5，GYCAACCTCRTCATCGCC3，,反向引物Rl :5’ CTGCTCARCffTCffTGYTGGAG 3，；
(4)又用2 条基因特异性正向引物 F2 :5’ GTGCTGGAGAACATAGTGGAAG 3，, F3 :5’ GGGCTGAGAACCGCAAAG 3’ 进行大黄鱼 IL-I β cDNA 3’ 端快速扩增(3，RACE)；
(5)然后用3条基因特异反向引物R2 :5’ AGCCCAGTGTCTTGTTTG 3’和R3 :5’ AAGGTTGGGTCGTTGTCC _3’，R4 :5，GCCCTTGATACCCAGAGCC 3’ 对大黄鱼 IL-1 β cDNA 5，端进行克隆。本发明的有益效果为本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3，端cDNA快速扩增(3，— RACE)以及5’端cDNA快速扩增(5，— RACE)的方法，对大黄鱼IL-I β型基因全长cDNA进行了研究，首次从大黄鱼中克隆到了 IL-I β型基因全长cDNA序列，用于IL-Ιβ基因的重组表达和功能研究。采用本发明中所述方法，能够从大黄鱼肾脏中克隆到I种白细胞介素-I β基因(称为大黄鱼IL-I β基因)， 采用本发明对大黄鱼IL-I β基因的成功克隆和测序，首次得到了 I种大黄鱼的IL-I β基因，搞清了它们的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因(所以可以不用以上引物和方法)，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达。通过网上相似性和同源性检索，提示大黄鱼IL-I β可以激活大黄鱼的免疫反应,在大黄鱼的病害防治中具有广泛的应用价值。 采用本发明使通过重组表达，生产重组表达大黄鱼IL-Ιβ的重组蛋白药物，环境友好，无污染。在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
图I是本发明大黄鱼IL-I β基因与GST蛋白融合蛋白(GST_IL_1 β )的原核诱导表达。图2是对图I中得到的沉淀复性及纯化结果(第9条泳道)。
具体实施例方式实施例I
本实施例的一种克隆的大黄鱼白细胞介素一 I β基因，具有序列表中SEQ ID NO. I碱基序列。(I) SEQ ID NO I的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度1295碱基对 *类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA(C)假设否
(d)反义否
(e)最初来源:卞歲jtXPseudosciaenacrocea)。本实施例的一种克隆的大黄鱼白细胞介素一I β基因，具有序列表中SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列
(2)SEQ ID NO. 2的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度255氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链 *拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质
其中大黄鱼白细胞介素一 1β基因的克隆方法为
I.总RNA提取用手术剪刀解剖活的大黄鱼，取其肾脏，迅速放到液氮中冷冻，用于RNA 的提取。总RNA的提取使用Invitrogen (中国，上海)生物公司的Trizol RNA提取试剂， 提取方法参照使用说明书。2. cDNA第一链合成据上海生工生物工程技术服务有限公司cDNA合成试剂盒说明书进行。3.大黄鱼白细胞介素一 I β基因cDNA片段克隆
(I)根据GenBank中报道的鱼类IL-I β的保守序列设计引物，用于PCR扩增，得到大黄鱼IL-I β基因片段。正向引物Fl :正向引物 Fl 5，GYCAACCTCRTCATCGCC3，,反向引物 Rl :5’ CTGCTCARCffTCffTGYTGGAG 3，，
聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件
IOxTaq DNA聚合酶缓冲液(Mg2+浓度为20mM) 2 μ I 模板 cDNAI μ I
正向引物(ΙΟμΜ)1μ I
反向引物(ΙΟμΜ)I μ I
脱氧核苷酸混合物(dNTP，IOmM)1.6μ I
ExTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)O. 2 μ I
灭菌水13. 2 μ I
PCR反应程序为94°C预变性3min，然后进入下列循环94 °C 45s，56 °C 30s, 50°C (15个循环)30s ;72°C 40s ；72°C lOmin，I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。(2)反应产物纯化利用德国 QIAGEN 公司产品(QIAquick Gel Extraction Kit), 操作步骤按产品说明书进行。(3)基因片断的克隆纯化的PCR产物与pMD 18_T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化TOP 10 (天根公司)菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后， 提取质粒，以F1、R1为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。4.大黄鱼 IL-I β cDNA 3’ 端快速扩增(3，一 RACE)根据得到的大黄鱼IL-Ιβ基因片段序列，又设计一条特异性正向引物F2 :F2:5’_ GTGCTGGAGAACATAGTGGAAG 3’,讲行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’ 一 RACE试剂盒说明书进行。取肾脏总RNA约20yg，其他试剂的配制和反应条件按说明书进行。用特异性引物 F2 与 3’ 接头引物 AOLP (5’ GGCCACGCGTCGACTAGTACT16 (A/G/C) 3’)，进行 3’ 端 PCR 扩增，采用57°C退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。PCR第一轮扩增后，在20 μ L PCR反应体系中，加入1:20稀释的首轮PCR 扩增产物I μ L，基因特异性引物3F (F3:5，GGGCTGAGAACCGCAAAG 3’)和锚定引物AP (5’ GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3’)各O. 5 μ L，进行第二轮PCR扩增，退火温度改为58°C，其它反应条件同前。5.大黄鱼 TLR9A cDNA 5’ 端快速扩增(5，- RACE)
(I)第一链cDNA合成
以 RNA 为模板，IL-I β 5’r2 (R2 :5’ AGCCCAGTGTCTTGTTTG 3’)为引物进行反转录得到第一链cDNA。反应体系为20 μ I :无RNase水9 μ 1，I. 5 μ g/ μ I DNase处理过的总RNA
2μ 1，10 pmol/L AP 引物 I μ 1，(GGCCACGCGTCGACTAGTAC) 5 X 反转录酶 buffer 4 μ 1， 10 pmol/μ L dNTPs 2μI 40 U/μ I RNase inhibitor I μ I，200U/L M-MLV Reverse Transcriptase I μ I。反应条件先将无Rnase的超纯水、RNA和引物加入薄壁管,70°C 6 min使RNA变性,冰上放置5 min。然后依次加入反转录buffer、dNTPs、RNase inhibitor 和反转录酶，42°C温浴2 h，95°C 5 min使反转录酶失活。(2)加尾:
合成的cDNA经DNA纯化试剂盒(上海华舜)纯化后，用末端转移酶(TdT，Fermentas) 在新合成的cDNA末端加上poly C尾。(3 )第一轮 PCR 扩增
以加尾的 dC-cDNA 为模板,用接头引物 AAP(5’GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG 3’ ) 和基因特异性引物IL-I β 5’r3 (R3 :5’ AAGGTTGGGTCGTTGTCC _3’)，扩增序列的5’末端。 20 μ L 反应体系中包括10 X Taq buffer (Mg2+浓度为 2O mM) 2 μ L, dNTP (IOmM) I. 6 μ L，正向引物(10 μΜ) 0.5 μ L，反向引物(10 μ Μ) O. 5 μ L，模板(cDNA3’端加尾产物)I yL，rTaq 酶(5 U/μ L) O. 2 μ L，灭菌双蒸水 14. 2 μ L。PCR 反应条件94°C 3 min ；94°C 45 s ；50°C 30 s ；72°C 45s ;35 个循环；最后 72°C 10 min。(3)半巢式PCR扩增
PCR第一轮扩增后，在20 UL PCR反应体系中，加入I μ L首轮PCR扩增产物，基因特异性引物 IL-I β 5’r3 (R3 :5’ AAGGTTGGGTCGTTGTCC 3’)和锚定引物 AP 各 O. 5 yL，进行第二轮PCR扩增，退火温度改为56 V，其它反应条件同前。(4)第二次半巢式PCR扩增
PCR第二轮扩增后，在20 UL PCR反应体系中，加入I μ L第二轮PCR扩增产物，基因特异性引物 IL-I β 5’r4 (R4:5，GCCCTTGATACCCAGAGCC 3)和锚定引物 AP 各 O. 5 yL，进行第三轮PCR扩增，退火温度改为60°C，其它反应条件同前。(5)反应产物纯化、克隆和测序同前。
大黄鱼IL-I β cDNA序列验证根据拼接得到的大黄鱼IL-I β cDNA全序列的5’ 和3’端特异性序列，设计I对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。通过网上相似性和同源性检索，提示大黄鱼IL-Ιβ与其他鱼类的IL-Ιβ的序列相似性较高。大黄鱼IL-I β cDNA可以编码255个氨基酸的蛋白质，预测分子量为 28. 64kDa，等电点为5. 50，酸性蛋白质。其二级结构组成为α -螺旋(Alpha helix)38. 82%， 延伸主链(extended strand) 18. 04%,随机卷曲(random coil) 43. 14%。使用 TMHMM 软件 (http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)对蛋白进行跨膜预测,显不IL-I β基因不含有跨膜区。不含有信号肽序列。氨基酸序列用SMART软件分析发现该蛋白具有一个结构域， 为白细胞介素I同源区(ILl domain)，从92到245个氨基酸。大黄鱼的IL-Ιβ可以受到LPS，病原菌等激活，被激活后，可以激发产生炎症反应，在大黄鱼疾病防治、鱼药受体方面及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。实施例2
本实施例采用实施例I克隆方法得到的大黄鱼白细胞介素-Iβ基因，具有提升大黄鱼抗病力的功能。 首先根据原核表达载体PGEX-4T-2 (购自Amersham公司)的多克隆位点及大黄鱼IL-I β基因ORF中的酶切位点分析，在该基因的上下游引物分别设计BamH I和 EcoR I两个酶切位点，BamH I为GGATCC，EcoR I为GAATTC (引物序列中下划线部分)， 并添加保护碱基(下面序列中的下划线序列前面的CG)，引物序列为上游引物F-ex 5’ CGGGATCCATGGAATCTGAGATGAAATGC _3 ’，下游引物序列为 R_ex 5 ’ CGGAATTCTCAGGCCTGACCCT CAGTT3，。扩增IL-I β 基因片段的 PCR 反应体系为10 X Taq buffer 2 μ L, dNTP 1.6 μ L, 正向引物和反向引物各I UL，模板(大黄鱼cDNA) I μL，rTaq酶0·2 μ L，其余用灭菌双蒸水补齐。PCR 反应条件94 V 3 min ；94 V 45s，退火温度 57°C 30 s，72 V lmin, 35 个循环；72 V 7 min。PCR产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并利用凝胶回收试剂盒(天根公司) 回收目的片段，用BamH I和EcoR I两个限制性内切酶分别双酶切目的DNA片段和质粒， 反应体系如下
10 X Tango buffer4 μ L
BamH I2 μ L
EcoR II μ L
质粒/或目的DNA片段700 ng
超纯水补足至20 μ L
37 1水浴酶切4 h。双酶切之后用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物并测定DNA量， 根据最终换算加入DNA的总量为O. 3pmol。取O. 03 pmol的质粒双酶切产物与O. 3 pmol的上述目的DNA片段双酶切产物混合，加入双蒸水至终体积17 μ L，45°C孵育5 min ;然后加入2 μ L IOX连接酶缓冲液和I μ L Τ4连接酶，在10 °C连接4 h。连接转化产物与pMD 18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化TOP 10(天根公司)菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，以FeX、ReX为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行下一步实验。随机挑选单克隆菌落于I mL LB (Amp 60 μ g/mL)液体培养基中扩大培养。然后以菌液为模板，以和扩增出目的条带相同的体系和反应程序来检测PCR产物，同时用BamH I和EcoR I两个限制性内切酶双酶切重组表达载体，将5管经菌液PCR鉴定和双酶切都鉴定都为阳性克隆的菌液送至上海华大公司测序，序列与序列表中SEQ ID No. I中编码区碱基序列及序列表中SEQ ID No. 2中氨基酸序列相同。将验证正确的阳性重组质粒从克隆菌株TOPlO中提取出来，将重组表达质粒转化进表达菌株BL21中，挑取含有重组质粒的单菌落于5 mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100 μ g/mL), 37 °C摇培过夜。分别吸取50 μ L菌液于新的5 mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100 μ g/mL), 37。C，250 rpm培养。至A600=O. 6-0. 8时，各吸取ImL菌液做对照，并向其余9 mL菌液中加入I. 13 μ L O. 8mol/L IPTG至其终浓度为O. I mmol/L,24 °C摇动(250 rpm)培养。吸取的菌液4°C, 12000 g,离心2 min,收集沉淀，向沉淀中加入10 μ L蛋白质上样缓冲液，99 °C变性5 min，-20°C保存。取菌液I mL，4 V 7700 g离心10 min收集菌体，并用冰冷的I XPBS洗涤三次菌落，后用O. 8 mL冷的IXPBS悬浮菌体；母液加入IPTG 培养10 h后，于4 h、6 h、8 h、10 h各吸取ImL菌液。将吸取的菌液4 °C, 12000 g,离心
2min,弃去上清,加入I mL PBS重悬沉淀,4 °C, 12000 g,离心2 min,重复3次。沸水浴
5min, 5000 g离心3 min。将沉淀用300 μ L PBS重悬，于冰上进行超声波破碎，振幅50， 破碎10s，间隔20 s，5次，至菌液有不透明转为半透明。将破碎后菌液4 °C, 12000 g,离心5 min，分离上清和沉淀。吸取80 μ L上清加入20 μ L蛋白质上样缓冲液，99 °C变性5 min。向沉淀中加入10 μ L蛋白质上样缓冲液，99 °C变性5 min。将处理好的诱导前，诱导后蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12%，检测目的蛋白的表达，表达结果见图1， 表达载体PGEX-4T-2本身编码25kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，大黄鱼IL-Ιβ基因所编码的蛋白大小为29kDa，因此融合蛋白理论大小应该为54kD，可见大黄鱼IL-I β重组蛋白明显受到IPTG诱导(图I. GST-IL-I β的原核诱导表达，Μ:蛋白质Marker ;I :非重组菌诱导前；2:非重组菌经I mM IPTG诱导；3:重组菌诱导前；4 :重组菌经ImM IPTG诱导后4h总蛋白；5 :重组菌经ImM IPTG诱导后4h破碎菌体离心得到的上清；6 :重组菌经ImM IPTG诱导后4h破碎菌体离心得到的沉淀；7 :重组菌经ImM IPTG诱导后6h总蛋白；8 :重组菌经ImM IPTG诱导后6h破碎菌体离心得到的上清；9 :重组菌经ImM IPTG诱导后6h破碎菌体离心得到的沉淀)。选择重组菌经ImM IPTG诱导后4h破碎菌体离心得到的沉淀；， 经浓度为Triton-XlOO洗漆,洗漆后的蛋白质上Glutathione Sepharose 4FF亲和层析柱 (GE)洗脱，获得单一条带的重组蛋白，结果见图2 (lanel，蛋白质标准分子量，单位kDa; lane2,经 O. 5%Triton_X100 洗漆后的蛋白质过 GST 亲和层析(Glutathione Sepharose 4FF，GE)，lane3，重组蛋白采用O. 5% Triton-XlOO洗涤复性后为单一条带)。采用GST抗体做Westernblot分析,鉴定重组蛋白为GST-IL-I β重组蛋白。采用浓度为2mg/L重组IL-1 β的海水浸浴大黄鱼鱼苗(发育至Icm长)24h后(每组50尾)，人工加入大黄鱼副溶血弧菌至l*107ml，实验设3组重复,实验组大黄鱼在72h 时死亡率分别为22，18和25尾，对照组分别为45，39和43尾，实验组死亡率显著低于对照组。结论为大黄鱼IL-I β重组蛋白可以显著提高大黄鱼鱼苗抵抗副溶血弧菌的感染能力。
权利要求
1.一种大黄鱼白细胞介素一 10 (IL-1P )基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO. I喊基序列及SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列。
2.一种如权利要求I所述的大黄鱼白细胞介素一 IP (IL-IP)基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤(1)从大黄鱼的肾脏组织中提取总RNA;(2)然后进行cDNA第一链合成；(3)根据其他鱼类IL-IP的保守序列设计引物进行PCR反应，得到大黄鱼 IL-I @基因片段，其中正向引物Fl :5’ GYCAACCTCRTCATCGCC 3’,反向引物Rl :5’ CTGCTCARCffTCffTGYTGGAG 3，；(4)又用2 条基因特异性正向引物 F2 :5’ GTGCTGGAGAACATAGTGGAAG 3，, F3 :5’ GGGCTGAGAACCGCAAAG 3’ 进行大黄鱼 IL-1 ^ cDNA 3’ 端快速扩增(3，RACE)；(5)然后用3条基因特异反向引物R2 :5’ AGCCCAGTGTCTTGTTTG 3’和R3 :5’ AAGGTTGGGTCGTTGTCC 3’，R4:5’ GCCCTTGATACCCAGAGCC 3’ 进行对大黄鱼 IL-13 cDNA 5’端克隆。
3.—种如权利要求I所述的大黄鱼白细胞介素一 IP (IL-1P )基因的应用，其特征在于所述的大黄鱼白细胞介素-I & (IL-1 & )基因,具有提升大黄鱼抗病力的功能。
全文摘要
本发明公开一种大黄鱼白细胞介素－1β(IL-1β)基因，具有序列表中SEQIDNO.1碱基序列及SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其克隆方法。本发明在大黄鱼疾病防治及进一步开发为医药产品方面具有良好应用前景，在为大黄鱼分子标记辅助选育的抗病育种、鱼类健康状态的检测奠定基础。
文档编号C12N15/25GK102586263SQ201210059220
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2011年3月9日
发明者姚翠鸾, 王志勇, 黄雪娜 申请人:集美大学