专利名称：人心肌病理演变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与人心肌病理演变中mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。
背景技术：
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年心血管病的新增人数300多万，死亡人数近250万，患者900多万，全球每年新增心血管病患者1200多万，死亡人数接近1000 多万，患者约有I亿多万，根据世界权威机构预测，到2030年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。心血管病诊治成本越来越高，按患者的年治疗费用10万(贫穷地区可能偏高， 发达地区可能远远高出20万)，900多万患者，每年的花费是I. 8万亿人民币，扣除成本35% 约6多千亿，每年约有1.2万亿人民币白白消耗了。而且，患者死亡率非常高，在所有疾病中，心血管病的死亡率仍然是第一位。因此，现有的临床心血管病诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平心血管病的治未病。本发明人在长期研究中发现，导致心血管病死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊治。依照现有的实验室生化(心肌损伤相关的酶类得检测)指标来诊断，大部分都停留在心血管病形成后检测及病发后的疗效观察。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的筛查心血管病、治疗心血管病、以及预防心血管病，已取得长足进步。至今， 我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在心血管病变前期或心肌细胞损伤前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本，心肌损伤病人、高危人群(三高人群)、正常对照，对 CTnT基因mRNA与各种心肌病变的早期预警进行检测分析。发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，心血管病和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治未病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此， 发明人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本(正常人群、高危人群、心血管病患者)，突破了正常组织与病变组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发心血管病变前期的RNA水平，与心血管病早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上心血管病发后诊治模式变成的早期预防性诊治，争取了心血管病诊治的时间和空间，达到预防心血管病发生。人心肌肌钙蛋白T(CTnT)附着于心肌和骨骼肌的原肌球蛋白上，一旦心肌损伤时，存在于胞浆内的游离型CTnT很快进入血液内，能够较快、较早地反映心肌损伤程度。作为心肌损伤的高敏感和特异性标志物，肌钙蛋白对检测急性冠状动脉综合征患者心肌缺血及危险分级具有重要的临床意义。我们研发的人心肌特异性肌钙蛋白基因mRNA试剂盒，用于监测游离到人外周血血清中的CTnT基因，早期筛查心肌是否损伤以及损伤的程度，为急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性心肌炎、急性冠脉综合征、高血压中晚期、高血脂、糖尿病初期等疾病的发病前期做筛查和预防性检测。同时，肌钙蛋白基因浓度也可用于评判不稳定型心绞痛患者罹患心肌梗死和心源性死亡的危险率，也可判断冠心病患者是否应接受抗凝药物如血小板糖蛋白II b/ III a受体拮抗剂治疗。动态地检测CTnT基因的mRNA，随时观察其阳性反应，为提示预后不良及诊断治疗急性心肌梗塞(AMI)和急性缺血性冠脉综合征(AICS)等提供了及时可靠依据。从心肌损伤发生的病理生理学机制来分析，心肌肌钙蛋白基因的表达要比心肌肌钙蛋白翻译出来的时空要早，敏感性和稳定性更明确(因为，有时候mRNA和蛋白表达不同步，有时候有mRNA表达，不一定有蛋白表达)。因此，我们开发应用该肌钙蛋白基因的mRNA试剂盒的临床意义更重要，主要是对上述疾病发病前期筛查，其次是用上述疾病病理演变过程中心肌损伤的程度判断。心脏，是人体循环系统的动力。心脏推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物(如二氧化碳、尿素和尿酸等)，使细胞维持正常的代谢和功能。而心肌受损时会使心脏运作出现障碍，严重危害人们的生命健康。血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)及其同功酶(CK-MB)作为心肌病的标志物已被用于临床多年，不足之处为心肌酶组织特异性不高，酶活性检测精确度不高，且灵敏度不足以辅助确诊心肌梗死。随着对心肌损伤标志物的不断深入研究，逐渐发现若干灵敏性高，特异性较好的标志物。心肌肌钙蛋白(CTn)以其优异的灵敏性和特异性而被确立为诊断心肌损伤的新指标。与酶标志物的回归性诊断不同(> 6小时)，心肌肌钙蛋白能迅速检出心肌损伤，实时的反映心肌受损的全过程，其中CTnT在对心肌损伤的诊断、监测和预后上均优于CK-MB和同工酶而成为真正具有心肌特异性的标志物，也是独立于心电图之外可用于判断梗死灶范围大小及预后的重要血清学指标。血清CTnT是心肌细胞损伤的特异性和敏感性标志物。CTnT是一种结构蛋白，是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，参与调节心肌粗、细肌丝的滑行运动，心脏特异表达，细胞内浓度高，心肌受损时持续释放，血中半衰期短和敏感性高。而采用CTnT基因的mRNA检测方法比用心肌肌钙蛋白的ELISA方法能更早期反应心肌损伤病理过程。我们采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法相结合的试剂盒，对80例健康者对照组和17例急性心肌梗塞(AMI)患者、23例不稳定性心绞痛患者(UAP)、18例稳定性心绞痛(SA)及15例高血压患者的外周血血清肌钙CTnT基因的mRNA进行检测，同时检测AMI 组患者心酶谱(LDH、CK、CK-MB)三项指标和心肌肌钙CTnT基因试剂盒。数据表明，CTnT对 AMI的敏感度为98. 1%，特异性为100%，AMI组患者CTnT阳性率明显高于心酶谱和心肌肌钙蛋白的ELISA检测值，而且无一例的CTnT浓度超过正常健康组的上限浓度。因此，我们自主开发的该试剂盒可用于早期筛查和辅助诊断心肌损伤病理过程及预后。目前对CTnT基因的研究都采用高通量基因芯片分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上,mRNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(mRNA与蛋白转录有时候不同步,mRNA有表达, 蛋白没有转录)。根据现有的文献资料CTnT基因水平的检测技术及试剂盒未见报道。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的同源探针(RNA)和检测的靶RNA是采用碱基互补(杂交反向互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，只要洗脱完全启动和中止处得残基对检测的结果没有影响。鉴于目前临床上心血管病的诊断(生化指标物都是大部分心血管病发生后的诊断)是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治。采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法相结合检测心肌损伤病前期变mRNA表达变化，做了创新性的技术突破，提供心肌损伤病变早期mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的心肌损伤病变前期mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床心肌损伤的诊治争取时间和空间。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与各种心肌损伤病变前期筛查及患者治疗后早期预警相关的原位杂交检测方法。为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO. I所示序列的互补序列，靶基因的序列号AY277394，CTnT序列核苷酸序列长度是1102bp，⑶S 213...893bp，位于染色体lq32〃上。(本发明的探针序列是680bp，在探针标记技术上不存在问题，重复说明一下，探针为同源探针，探针的序列是CTnT基因mRNA的杂交互补碱基序列，探针标记的过程就是一个碱基反向互补过程)。本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。
本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。本发明的癌变前期CTnT筛查试剂盒应用价值在于，对各种心肌损伤病变前期筛查，尤其是心梗的前期筛查，及心肌损伤病发后或治疗后病程评判和预警，进一步配合临床治疗。本发明还提供一种CTnT原位杂交的检测方法，包括以下步骤
(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和
(2)检测所述杂交复合体。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16 - 24小时。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液标本。更优选地是，所述的血液标本来自各种心肌损伤前期患者、各种心血管病高危人群、健康正常人群。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的心肌损伤高危人群、心血管病好发家族、各种心血管病患者(特别是心梗早期病人)。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以CTnT为检测对象，合成探针是CTnT序列的互补序列，检测的底物是人体血液中mRNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供CTnT的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上mRNA的表达量，正常人CTnT不表达，即不显色，CTnT在心肌病人中表达或高表达，高危人群有一定量不大14-28%，和正常对照人群比较有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；
9).仪器自动弃去液体，自动清洗,显色；
10).取出封片镜检。本发明的一个优选实施例的方案是以CTnT合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液中的待测mRNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的mRNA的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的CTnT表达量，用来确定各种心肌病理演变前期(特别是心梗早期)的mRNA变化量，预警各种心血管病变(心肌梗塞)是否发生及各种心血管病患者治疗后的预后预测。因为CTnT在正常人中不表达，如果CTNT表达量增高，说明心肌损伤病理过程已开始，说明心肌损伤已发生，或心肌损伤病人经治疗后心肌病理机制的变化及疗效评判，从而获得心肌损伤的早期诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。本发明具有如下有益效果本发明的临床意义是更早期跟踪检测各种心血管病变(特别心梗)发生和病理演变过程中CTnT表达量的变化，预警各种心血管病发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与心血管病标志物，与临床上其他检查有显着不同。本发明可以在mRNA水平检测CTnT异常表达，心血管病生化指标(现有临床指标) 未产生异常之前，亦未发生心梗之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床心肌损伤患者一个真正的早期预警。这样才有可能实施心肌损伤的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治各种心血管病的致死性。此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
图I是本发明CTnT原位杂交技术流程图。图2是本发明实施例中心肌损伤病人CTnT表达增高图片。图3是本发明实施例中高危人群CTnT表达图片。图4是本发明实施例中正常人CTnT表达图片。
具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。实施例I
按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以CTnT设计的杂交探针、标记物、说明书，其中本实施例的探针标记物选用地高辛。试剂盒杂交液组成
消化液100 μ L/管I管/盒无色透明液体保护液100 μ L/管I管/盒无色透明液体预杂交液1300 μ L/ 管2管/盒无色透明液体正义杂交液10 μ L/ 管I管/盒无色透明液体反义杂交液10 μ L/ 管I管/盒无色透明液体封闭液1000 μ L/ 管I管/盒无色透明液体碱性磷酸酶抗体I U L/ 管I管/盒无色透明液体显色剂A175 μ L/ 管I管/盒黄色液体显色剂B320 μ L/ 管I管/盒无色透明液体缓冲液I90mL/ 瓶I瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液II80mL/ 瓶I瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液III2OmL/ 瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体缓冲液IV90mL/ 瓶I瓶/盒浅黄色或无色透明液体固定液90mL/ 瓶I瓶/盒无色透明液体阳性对照标本6片/盒
配制试剂使用浓度1)·将IOX缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成IX缓冲液I ;
2).将20X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2X缓冲液II；
按1:100稀释成O. 2 X缓冲液II ;按1:200稀释成O. IX缓冲液II ；
3).将IOX缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成IX缓冲液III；
4).IOX缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各IOmL,加水至IOOmL既可)ο实施例2
应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本CTnT表达量的实施过程
1).取待测标本两张；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液ΙΟΟμL加IX缓冲液I 99. 9ml,即为使用浓度)50 ml，37°C水浴预热lOmin，放进16张玻片，37°C处理12 min,再用IX缓冲液I洗5min ；
3).用O.2%的保护液(保护液Iml加I X缓冲液I，99ml即为使用浓度)洗lOmin，
三蒸水洗5min (以上过程都在玻璃缸进行)，取出玻片，让其自然干燥；
4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25μ L/片(加在有细胞的地方)，盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中3h以上；
5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min， 取出，自然干燥；
6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μ L/片，另一张加反义杂交液25 μ L/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内
在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min ；
在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min ；
在42°C恒温水浴箱中用0. IX缓冲液II洗两次，每次15min ；
8).用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9)·将玻片放入保湿盒内，加O. 5%封闭液(Iml封闭液加5ml I X缓冲液III) 100 μ L/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。(此步骤不需加盖玻片)；
10).取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；
11).将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入I.8ml IX缓冲液III) 100 μ L/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性(此步骤不需加盖玻片)；
12).取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;
13).用IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3 μ L，显色剂B157. 5 μ L加到 30mL IX缓冲液IV中，混匀)，室温避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混匀)封片镜检。本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察RNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。心血管病人20例，高危人群(三高人群)20例，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有心血管病患者CTNT表达量低，细胞染色浅；高危人群表达稍降低，小数染色；正常对照组CTNT表达量高，细胞大多数染色，具体结果见图2、图3、图4。
权利要求
1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO. I所不序列的互补序列。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6.一种CTnT基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)在权利要求I所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16 - 24小时。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人血液中的mRNA标本。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液mRNA成分选自心血管疾病、 闻血压、闻血脂、闻血糖及心梗如期的闻危人群、正常人标本。
10.CTnT基因在制备检测早期心肌坏死、损伤及各种心血管病原位杂交检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与早期心肌损伤病理演变有密切相关心肌肌钙蛋白T(CTnT)基因的mRNA的方法，包括以下步骤(1)同源互补杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测基因表达量，比现有的临床生化检测指标(蛋白检测指标)更早期，能实现真正的心肌病变前期RNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102605063SQ20121005970
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者张云福, 张玉丽, 裘建英, 裘霖 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司