含有纳米粒子的水凝胶的制作方法【专利摘要】本发明提供了一种含有纳米粒子的水凝胶，所述水凝胶包含金属纳米粒子和至少一种肽。所述含有纳米粒子的水凝胶可以具有抗细菌活性。还提供了一种用于制备所述含有纳米粒子的水凝胶的方法、以及其组合物和用途。【专利说明】含有纳米粒子的水凝胶
技术领域：
[0001]本发明大体上涉及含有纳米粒子的水凝胶、其组合物、它们的制备方法、以及其用途。所述含有纳米粒子的水凝胶可适用作抗微生物剂和/或抗细菌剂。【
背景技术：
】[0002]近年来，对具有固有的抗微生物活性的生物材料的关注在不断增加，并且已对包括局部施用以预防与大伤口相关的感染以及防止医疗装置中的生物膜形成在内的许多不同的应用进行了研究。由于抗生素抗性细菌的增加，因此对开发含有如银等抗细菌剂的生物材料的关注在日益增长。[0003]如硝酸银溶液的银化合物在传统上已被用于治疗人类疾病，如淋球菌眼部感染、烧伤及伤口（Kim等，2007;Klasen等，2000-a;Klasen等，2000-b)。银化合物与经典的抗生素相比具有某些优势，如对抗多达十二种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的广谱抗微生物活性(Leaper，2006)。此外，微生物内多种细胞靶标的存在降低了诱导对基于银的治疗的微生物抗性的倾向。已经开发了对抗生素抗性细菌菌株具有高活性的基于银的材料。具体来说，已对用银浸渍的生物材料就临床使用进行了测试，并且目前可商购获得含有Ag(I)或银纳米粒子(AgNP)的若干种产品（Leaper，2006;Alt等，2004;Wright等，2002)。在此背景下，应注意到，最近的研究比较了各种银化合物，如磺胺啼啶银(silversulfadiazine)和银纳米粒子的抗微生物有效性(Brandt等，2012)。有趣的是，得出的结论是银纳米粒子的杀细菌特性优于其它银化合物并且它们的功效随其尺寸的减小而增加(Martinez-Gutierrez等，2012)Jartinez-Gutierrez等（2010)具体地报道了20nm至25nm尺寸的银纳米粒子在抑制具有中等至高度抗生素抗性的临床相关细菌的生长方面最为有效。[0004]已经进行了一些尝试来开发含有银的水凝胶，但是迄今为止，这些生物材料当中没有一种是可商购获得的。最近，Messersmith等报道了含有反应性儿茶酚部分的水溶性聚乙二醇(PEG)聚合物，所述反应性儿茶酸部分可以将Ag(I)还原成Ag(0)NP(Fullenkamp等，2012)Jaraprasad等(2010)报道了使用硼氢化钠原位还原水凝胶中的银，从而使得形成水凝胶中的胶体银。在这两种所报道的方法中，在聚合物胶凝期间对银进行还原。Murali等(2010)利用了一种不同的方法，他们报道了银纳米粒子在预先形成的水凝胶网络内的受控形成。此外，Banerjee等报道了使用受Fmoc保护的二肽或单个氨基酸对硝酸银进行的UV光诱导的还原（Adhikari等，2010;Roy和Banerjee，2011)〇[0005]可商购获得两种含有银的伤口处理产品，即SilvazineT%PActicoatTM。Silvazine?含有具有0.2%氯己定（chlorhexidine)的1%磺胺啼啶银乳膏剂，并且被用作烧伤伤口治疗产品。Acticoat?在它的系列下具有多种产品，如Acticoat?7,其中使用银纳米结晶技术赋予它的产品范围以其抗微生物特性。然而，这些当前可商购获得的产品缺乏用于最佳伤口处理的一些条件，从而增大了对寻找更有效的伤口处理候选物的需要。[0006]对于有效的伤口控制，需要若干标准。首先，伤口治疗剂需要提供湿润的环境以使细胞更新，因为已经证实这会加速上皮形成。然而，Silvazine?、Acticoat?7及Acticoat?Flex需要外部润湿并且不能在一段持续时间内提供湿润的环境。[0007]其次，伤口治疗剂还应当具有抗微生物特性，优选地持续数日以预防感染。然而，Acticoat?产品只能够提供最多7天的抗微生物保护。[0008]第三，伤口处理产品应对皮肤具有最低程度的粘着性以帮助无创性伤口敷料去除并且使对新形成的皮肤层的损伤减到最小。然而，在Acticoat?系列下，只有Acticoat?吸收剂具有最低程度的粘着性，因为它的主要功能是吸收渗出液，这允许凝胶形成并防止附着到新形成的皮肤层上。然而，并不是所有的伤口均释放足量的渗出液。[0009]伤口治疗剂应当优选具有的其它标准是将生长因子吸引到损伤部位以刺激细胞再生的能力;具有柔性以帮助在别扭的位置上施用治疗剂;具有防水特征;并且能够以低成本合成。[0010]因此，需要提供克服了，或至少削弱了上文所述的一种或多种缺点的生物材料。【
发明内容】[0011]根据本公开，此目的是由含有纳米粒子的水凝胶解决的，所述水凝胶包含：[0012]金属纳米粒子，和[0013]至少一种具有以下通式的肽：[0014]Z-(X)a-(Y)b-Z，c[0015]其中[0016]Z是N末端保护基；[0017]X在每次出现时独立地选自由脂族氨基酸和脂族氨基酸衍生物组成的组；[0018]Y在每次出现时独立地选自由极性氨基酸和极性氨基酸衍生物组成的组；[0019]Z'是C末端保护基；[0020]a是选自1至6,优选地1至5的整数；[0021]b是0、1或2,优选地1;并且[0022]c是0或1。[0023]有利的是，所述一种或多种肽能够在水或生理相关缓冲液中自组装以形成水凝胶。[0024]进一步有利的是，所述水凝胶可以显示出优越的机械强度。所述金属纳米粒子可以使所述水凝胶的纤维结构稳定，因此需要降低浓度的一种或多种肽，所述肽显著更加昂贵。因此，有利的是，所公开的水凝胶可以具有成本效益。[0025]根据本发明，此目的是通过一种产生所公开的含有纳米粒子的水凝胶的原位方法来解决的，所述方法包括以下步骤：[0026](a)将至少一种所公开的肽溶解在水溶液中；[0027](b)添加金属纳米粒子的前体，优选地金属盐溶液；[0028](c)凝胶形成以获得肽水凝胶；[0029](d)对由步骤(c)得到的肽水凝胶进行辐照；以及[0030](e)获得含有纳米粒子的水凝胶。[0031]根据本公开，此目的是由通过所公开的原位方法制备的含有纳米粒子的水凝胶来解决的。[0032]根据本公开，此目的是通过使用所公开的含有纳米粒子的水凝胶来解决的：[0033]-将所述水凝胶用作用于金属递送，优选地用于持续释放或受控释放金属递送的装置；[0034]-将所述水凝胶用作抗微生物剂；[0035]-将所述水凝胶用于治疗感染性疾病的方法中，[0036]其中，优选地，所述感染性疾病是由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母或真菌所引起；[0037]-将所述水凝胶用作伤口敷料以及用于伤口愈合；[0038]-将所述水凝胶用于外科手术应用；[0039]-将所述水凝胶用于防止细菌附着和/或微生物生物膜的形成；[0040]-将所述水凝胶用于局部医疗施用；[0041]-将所述水凝胶用于生物成像(通过利用金属纳米粒子的荧光）；[0042]-将所述水凝胶与医疗装置组合使用，所述医疗装置如支架、假体、导管、牙科植入物、矫形装置、矫形用植入物；[0043]-将所述水凝胶用于其中将所述水凝胶用作(干燥)膜的应用，如过滤。[0044]有利的是，所公开的水凝胶可以不需要另外的化学修饰而显示出抗细菌和/或抗微生物特性。[0045]根据本公开，此目的是由用于金属递送，优选地持续释放或受控释放金属递送的装置来解决的，所述装置包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶。[0046]有利的是，所公开的水凝胶可以显示出金属纳米粒子在一段较长的时间，例如多于10天内的持续释放。[0047]进一步有利的是，所公开的水凝胶能够完全释放金属纳米粒子，甚至是在使用低浓度的金属盐前体时也是如此。[0048]还有利的是，所公开的水凝胶可能只需要低浓度的金属盐前体，所述金属盐前体在高含量下可为有毒的。[0049]根据本公开，此目的是通过包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶的抗微生物剂来解决的。[0050]根据本公开，此目的是通过包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶的伤口敷料或伤口愈合剂来解决的，所述水凝胶优选地用于预防微生物感染和/或微生物生物膜的形成。[0051]有利的是，所公开的水凝胶能够防止细菌附着，且因此防止生物膜的形成。[0052]有利的是，所公开的水凝胶能够包封多达99.9%的水。因此有利的是，来自所公开的水凝胶的水分可以在施用于伤口部位时防止不希望有的粘着，从而有助于无创性去除敷料。所公开的水凝胶提供了在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和较大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0053]根据本公开，此目的是通过包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶的药物组合物或化妆品组合物来解决的。[0054]根据本公开，此目的是通过一种治疗感染性疾病的方法来解决的，所述方法包括以下步骤:向有需要的个人或受试者施用有效量的所公开的含有纳米粒子的水凝胶或所公开的药物组合物，其中优选地，所述感染性疾病是由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母或真菌所引起。[0055]根据本公开，此目的是通过一种治疗伤口和用于伤口愈合的方法来解决的，所述方法包括以下步骤：向伤口施用有效量的所公开的含有纳米粒子的水凝胶或所公开的药物组合物。[0056]有利的是，所公开的水凝胶可以具有柔性，且因此，能够被施用于皮肤上别扭的或不平坦的位置上。[0057]根据本公开，此目的是通过包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶以供体外和/或体内使用，优选地用于口服、用于注射和/或用于局部施用的生物成像装置来解决的。[0058]根据本公开，此目的是通过使用所公开的含有纳米粒子的水凝胶来制造用于治疗感染性疾病的药物来解决的。[0059]根据本公开，此目的是通过使用所公开的含有纳米粒子的水凝胶来制造用于治疗伤口和/或用于伤口愈合的药物来解决的。[0060]根据本公开，此目的是通过一种试剂盒来解决的，所述试剂盒包括[0061](i)至少一种如本文所定义的肽，[0062]所述肽任选地处于水溶液中；[0063](ii)金属纳米粒子的前体，[0064]优选地金属盐溶液(如AgN03);[0065](iii)有关凝胶形成以获得肽水凝胶以及有关对由此得到的肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；[0066](iv)任选的赋形剂。[0067]根据本公开，此目的是通过一种试剂盒来解决的，所述试剂盒包括[0068](i)由至少一种如本文所定义的肽获得的水凝胶，[0069]所述水凝胶优选地处于免受辐射的容器中；[0070](ii)金属纳米粒子的前体，[0071]优选地金属盐溶液(如AgN03);[0072](iii)有关对所述肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；[0073](iv)任选的赋形剂。[0074]定义[0075]以下是可以帮助理解本发明的说明的一些定义。它们旨在作为一般定义，并且不应当以任何方式将本发明的范围仅限于那些术语，而被提出以更好地理解以下说明。[0076]除非上下文另有要求或明确有相反的说明，否则在本文被叙述为单数形式的整数、步骤或要素的本发明的整数、步骤或要素明确地涵盖了所叙述的整数、步骤或要素的单数形式和复数形式这两者。[0077]在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语"包含(comprise)"或诸如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"之类的变化形式将被理解成表示包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整数的组，但不排除任何其它步骤或要素或整数或者要素或整数的组。因此，在本说明书的上下文中，术语"包含"意指"主要，但并不一定仅仅包括"。[0078]本领域技术人员将了解，本文所述的本发明容许除所具体描述的那些变化和修改以外的变化和修改。应当了解的是，本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独地或共同提到或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。[0079]如本文所用的术语"氨基酸"指的是具有至少一个伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基和至少一个酸基的化合物或分子，其中所述酸基可以是羧酸、磺酸或膦酸、或其混合物。所述氨基相对于所述一个或多个酸基可以是"α"、"β"、"丫"至"ω"氨基。"氨基酸"的主链可以被选自以下各项的一个或多个基团取代：卤素、羟基、胍基、杂环基团。因此，术语"氨基酸"在它的范围内还包括甘氨酸、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、牛磺酸、甜菜碱、Ν-甲基丙氨酸等。氨基酸的（L)型和(D)型也被包括在本发明的范围中。[0080]如本文所用的术语"氨基酸衍生物"指的是上述氨基酸的各种衍生物。其实例包括不常见氨基酸、非天然氨基酸、氨基醇、或其中如末端羰基、末端氨基的氨基酸侧链被各种取代基中的任一个置换的氨基酸。所述取代基的实例包括烷基、酰基、羟基、氨基、烷氨基、硝基、横酰基、各种保护基等。举例来说，Val_NH2:缴氨酰胺;Val-〇l:缴氨醇（2-氨基-3-甲基-1-丁醇)等被包括在内。[0081]如本文所用的术语"极性氨基酸"或"极性氨基酸衍生物"指的是具有一个或多个极性基团的氨基酸。所述极性基团可以是羟基、醚、羧基、亚氨基、酰胺基、酯、氨基、硒基和/或碲基。举例来说，术语"极性氨基酸"或"极性氨基酸衍生物"包括但不限于天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、5-N-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸）、瓜氨酸、丝氨酸(Ser，S)、高丝氨酸、鸟氨酸(Orn)、苏氨酸(Thr，T)、左旋多巴、色氨酸(Trp，W)、甲状腺素、别苏氨酸、赖氨酸(Lys，K)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、N(6)_羧甲基赖氨酸、以及酪氨酸(Tyr，Y)。[0082]如本文所用的术语"烷基"在它的含义内包括单价（"烷基"）和二价（"亚烷基"）直链或支链饱和脂族基团，所述基团具有1个至12个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个碳原子。举例来说，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1，2_二甲基丙基、1，1_二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2_二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1，2_二甲基丁基、1，3_二甲基丁基、1，2,2_三甲基丙基、1，1，2_三甲基丙基、2_乙基戊基、3_乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2，2_二甲基戊基、3，3_二甲基戊基、4，4_二甲基戊基、1，2-二甲基戊基、1，3_二甲基戊基、1，4_二甲基戊基、1，2，3-二甲基丁基、1，1，2-二甲基丁基、1，1，3_三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基、^^一烷基、十二烷基等。烷基可以任选被取代。[0083]如本文所用的术语"烯烃"在它的含义内包括单价（"烯烃"或"烯基"）和二价（"亚烯基"）直链或支链不饱和脂族烃基，所述基团具有2个至10个碳原子，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个碳原子并且在烷基链中的任何地方在适用时具有至少一个E型、Z型、顺式或反式立体化学的双键。烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1_丁烯基、2_丁烯基、3_丁烯基、1，3_丁二烯基、1_戊烯基、2_戊烯基、3_戊烯基、4_戊稀基、1，3_戊二烯基、2，4_戊二烯基、1，4_戊二烯基、3_甲基_2_丁烯基、1-己烯基、2_己烯基、3-己烯基、1，3_己二烯基、1，4_己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。[0084]如本文所用的术语"炔烃"在它的含义内包括单价（"炔经"或"炔基"）和二价（"亚炔基"）直链或支链不饱和脂族烃基，所述基团具有2个至10个碳原子并且在碳链中的任何地方具有至少一个三键。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-甲基-2-丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1_辛炔基、2-辛炔基、I-壬炔基、I-癸炔基等。[0085]如本文所用的术语"胺"或"氨基"指的是形式_NRaRb的基团，其中RjPRb单独地选自包括但不限于以下各项的组:氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、以及任选取代的芳基。[0086]如本文所用的术语"酰胺"指的是含有与羰基的碳结合的氮原子的化合物或部分。所述术语包括"烷氨基羰基"或"烷基氨基羰基"，所述基团包括与氨基结合的烷基、烯基、芳基或炔基，所述氨基与羰基结合。它包括"芳基氨基羰基"和"芳基羰基氨基"，所述基团包括与氨基结合的芳基部分或杂芳基部分，所述氨基与羰基的碳结合。术语"烷基氨基羰基"、"烯基氨基羰基"、"炔基氨基羰基"、"芳基氨基羰基"、"烷基羰基氨基"、"烯基羰基氨基"、"炔基羰基氨基"、以及"芳基羰基氨基"被包括在术语"酰胺"中。酰胺还包括脲基(氨基羰基氨基)和氨基甲酸酯(氧羰基氨基）。[0087]如本文所用的术语"亚胺"在它的含义内包括胺或氨和醛或酮的反应产物。此反应产生具有至少一个C=N基团的分子。[0088]如本文所用的术语"脲类似物"指的是脲或碳酰二胺的各种衍生物，如苯甲酰基碳酰二胺、乙酰基碳酰二胺。并且在使用术语糠醛的情况下，希望将其理解为包括它的同系物、衍生物以及取代产物。[0089]如本文所用的术语"芳基"或如"芳族基团"或"亚芳基"的变体指的是具有6个至10个碳原子的芳族烃的单价（"芳基"）和二价（"亚芳基"）单个、多核、缀合以及稠合残基。这样的基团包括例如苯基、联苯、萘基、菲基等。芳基可任选被取代的。[0090]如本文所用的术语"任选取代"意指这个术语所涉及的基团可以是未取代的，或可以被独立地选自以下各项的个或多个基团取代:烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、齒基、駿基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、稀氧基、卤代烷氧基、卤代稀氧基、硝基、氣基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烧氣基、^?烷基氣基、烯基胺、炔基氣基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基硫基、烷基幾氧基、含憐基团，如勝醜基和憐醜基;芳基、杂芳基、烧基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(0)NH(烷基）、以及-C(0)N(烷基)2。[0091]如本文所用的术语"脂族"指的是特征为直链或支链结构或闭环结构的有机化合物或基团，其中任一个均可以含有饱和碳键和任选的一个或多个非共辄碳-碳不饱和键，如碳-碳双键。出于本发明的目的，术语"脂族"还包括下文所定义的"脂环族"化合物。脂族基团可以具有1个至24个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个碳原子。[0092]如本文所用的术语"金属纳米粒子"指的是包含金属和/或金属氧化物或由金属和/或金属氧化物组成的纳米粒子。术语"金属纳米粒子"还可以指的是异金属纳米粒子、异金属氧化物纳米粒子或其组合。[0093]如本文所用的术语"异金属纳米粒子"指的是在同一化合物中由一种金属和一种准金属原子组成或包含一种金属和一种准金属原子的纳米粒子。[0094]如本文所用的术语"异金属氧化物纳米粒子"指的是在同一化合物中由一种金属氧化物和一种准金属氧化物原子组成或包含一种金属氧化物和一种准金属氧化物原子的纳米粒子。[0095]如本文所用的术语"药学上可接受的盐"包括例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐、丁二酸盐、以及酒石酸盐。[0096]如本文所用的术语"药学上可接受的载体"意图包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。对于药学活性物质使用这些介质和试剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或试剂与所述化合物不相容，否则考虑将其用于治疗性组合物以及治疗和预防的方法中。还可以将辅助活性化合物并入到根据本发明的组合物中。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成单位剂型以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的"单位剂型"指的是适合作为单位剂量用于待治疗的个体的物理上离散的单位;含有预定量的一种或多种化合物的每个单位被计算以与所需的药物载体结合产生所期望的治疗作用。一种或多种化合物可以被配制用于以有效量在可接受的剂量单位中与合适的药学上可接受的载体一起进行方便和有效的施用。在含有辅助活性成分的组合物的情况下，通过参考所述成分的常用剂量和施用方式来确定剂量。[0097]在每种情况下适当时，本发明在它的范围内包括本文所公开的化合物的所有异构形式，包括所有非对映异构体、外消旋体以及对映体，例如所述化合物的E型、Z型、顺式、反式、（R)型、（S)型、（L)型、（D)型、（+)型和/或(_)型形式。[0098]在本发明的上下文中，术语"施用（administering)"以及该术语的包括"施用(administer)"和"施用(administration)"在内的变化形式包括通过任何适当手段使本发明的化合物或组合物接触、施用、递送或提供到生物体或表面。[0099]在本说明书的上下文中，术语"治疗"指的是以任何方式医治疾病状态或症状、预防疾病形成、或以其它方式预防、阻止、延缓、或逆转疾病或其它不希望有的症状进展的任何和所有应用。[0100]在本说明书的上下文中，术语"治疗有效量"和"诊断有效量"在它们的含义内包括本发明的化合物或组合物提供所期望的治疗作用或诊断作用的足够、但无毒的量。所需的确切量将在受试者之间变化，这取决于诸如以下各项的因素:所治疗的物种、受试者的年龄和一般情况、所治疗的病况的严重程度、所施用的具体药剂、施用方式等。因此，不可能指定确切的"有效量"。然而，对于任何给定的情况，适当的"有效量"可以由本领域的普通技术人员仅使用常规的实验来确定。[0101]词语"基本上"并没有排除"完全地"，例如"基本上不含"Y的组合物可以完全不含Y。在必要时，词语"基本上"可以从本发明的定义中被省去。[0102]如本文所用的术语"约"在制剂的组分浓度的背景下通常意指指定值+/-5%，更通常是指定值+/-4%，更通常是指定值+/-3%，更通常是指定值+/-2%，甚至更通常是指定值+/_1%，并且甚至更通常是指定值+/_〇.5%。[0103]在整个本公开中，某些实施方案可以范围的形式被公开。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所公开范围的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，对如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这均适用。[0104]某些实施方案也可以被宽泛地和一般性地描述于本文中。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明实施方案，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。【具体实施方式】[0105]现在将公开所公开的含有纳米粒子的水凝胶的示例性、非限制性实施方案。[0106]如上文所述，本公开提供了一种含有纳米粒子的水凝胶。[0107]所述含有纳米粒子的水凝胶包含：[0108]金属纳米粒子，和[0109]至少一种具有以下通式的肽：[0110]Z-(X)a-(Y)b-Z，c[0111]其中[0112]Z是N末端保护基；[0113]X在每次出现时独立地选自由脂族氨基酸和脂族氨基酸衍生物组成的组；[0114]Y在每次出现时独立地选自由极性氨基酸和极性氨基酸衍生物组成的组；[0115]Z'是C末端保护基；[0116]a是选自1至6,优选地1至5的整数；[0117]b是0、1或2,优选地1;以及[0118]c是0或1。[0119]所述金属纳米粒子可以是金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子、以及其组合。所述纳米粒子优选地选自银(Ag)纳米粒子、金(Au)纳米粒子、铜（Cu)纳米粒子、氧化铜（II)(CuO)纳米粒子、氧化铁（III)(Fe2〇3)纳米粒子、钼(Pt)纳米粒子、钯(Pd)纳米粒子或其组合。所述金属纳米粒子可以是异金属纳米粒子、异金属氧化物纳米粒子或其组合。[0120]所述金属纳米粒子在水凝胶中可以具有均匀的尺寸分布，优选地具有小于约Ιμπι，更优选地约1〇nm至约20nm的粒度。[0121]所述金属纳米粒子可以具有如下的粒度，所述粒度小于约Ιμπι、小于约0.8μπι、小于约0.7μηι、小于约0.6μηι、小于约0.5μηι、小于约0.4μηι、小于约0.3μηι、小于约0.2mm、小于约0.1Mi、小于约1OOnm、小于约80nm、小于约60nm、小于约40nm、小于约20nm、小于约1Onm、约1Onm、约20nm、约1Onm至约1OOnm、约1Onm至约50nm、约1Onm至约20nm。[0122]所述脂族氨基酸或脂族氨基酸衍生物可以是D-氨基酸或L-氨基酸。[0123]所述脂族氨基酸可以独立地选自丙氨酸(Ala，A)、高烯丙基甘氨酸、高炔丙基甘氨酸、异亮氨酸(Ile，I)、正亮氨酸、亮氨酸(Leu，L)、缬氨酸(Val，V)以及甘氨酸(Gly，G)，优选地选自由以下各项组成的组:丙氨酸(Ala，A)、异亮氨酸（Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、缬氨酸(Val，V)以及甘氨酸(Gly，G)。[0124]所述脂族氨基酸或脂族氨基酸衍生物全部或其一部分在从N末端到C末端的方向上可以按氨基酸尺寸递减的顺序排列，其中脂族氨基酸的尺寸被定义为I=L>V>A>G。[0125]所述脂族氨基酸或脂族氨基酸衍生物可以按氨基酸尺寸递减的顺序排列，具有选自以下各项的序列：LIVAG(SEQIDN0:1)、ILVAG(SEQIDN0:2)、LIVAA(SEQIDN0:3)、LAVAG(SEQIDN0:4)、IVAG(SEQIDN0:5)、LIVA(SEQIDN0:6)、LIVG(SEQIDN0:7)、IVA(SEQIDNO:23)以及IV(SEQIDNO:24)，其中，任选地，在N末端处在这样的序列之前存在A。还参见下表1。任选地，在N末端处在这样的序列之前可以存在A，如AIVAG。[0126]表1[0127][0128][0129]所述极性氨基酸或极性氨基酸衍生物可以是D-氨基酸或L-氨基酸。[0130]所述极性氨基酸或极性氨基酸衍生物可以具有独立地选自以下各项的极性基团：羟基、醚、羧基、亚氨基、酰胺基、酯、氨基、胍基、硒基以及碲基。[0131]极性氨基酸或极性氨基酸衍生物可以独立地选自天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(八8114)、谷氨酸(61114)、谷氨酰胺(6111，〇)、5-~-乙基-谷氨酰胺(茶氨酸）、瓜氨酸、丝氨酸(3從，5)、高丝氨酸、鸟氨酸(0?1)、苏氨酸(11^，1')、左旋多巴、色氨酸(1'印，1)、甲状腺素、别苏氨酸、赖氨酸(Lys，K)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、N(6)_羧甲基赖氨酸、或酪氨酸(Tyr，Y)，优选地选自由以下各项组成的组:天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、鸟氨酸(〇rn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、以及2,3_二氨基丙酸(Dap)。[0132]在具有以下通式的肽中：Z-(X)a-(Y)b-Z'c，部分-(X)a-(Y)b-可以选自LIVAGD(SEQIDN0:8)、ILVAGD(SEQIDN0:9)、LIVAAD(SEQIDN0:10)、LAVAGD(SEQIDN0:11)、AIVAGD(SEQIDN0:12)、LIVAGE(SEQIDN0:13)、LIVAGK(SEQIDN0:14)、ILVAGK(SEQIDN0.15)、LIVAGT(SEQIDN0:16)、AIVAGT(SEQIDN0:17)、LIVAD(SEQIDN0:18)、LIVGD(SEQIDN0:19)、IVAD(SEQIDN0:20)、IIID(SEQIDN0:21)、IIIK(SEQIDN0:22)、IVD(SEQIDN0:25)、IID(SEQIDN0:26)、LVE(SEQIDN0:27)、IVE(SEQIDN0:28)、LVD(SEQIDN0:29)、VIE(SEQIDN0:30)、VID(SEQIDN0:31)、VLD(SEQIDN0:32)、VLE(SEQIDN0:33)、LLE(SEQIDN0:34)、LLD(SEQIDN0:35)、IIE(SEQIDN0:36)、ID(SEQIDNO:37)、IE(SEQIDNO:38)以及H(SEQIDNO:39)。它们可以选自下表2:[0133]表2[0136]所述肽的C末端氨基酸可以选自赖氨酸(K)、鸟氨酸(0rn)、2,4_二氨基丁酸(Dab)、或2,3-二氨基丙酸(Dap)。[0134][0135][0137]在具有以下通式的肽中：Z-(X)a-(Y)b_Z'c，N末端保护基Z可以具有通式-C(0)-R，其中R选自由以下各项组成的组:H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。R可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。[0138]Z可以是乙酰基。[0139]Z可以是拟肽分子，包括天然的和合成的氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的N末端可以被选自由以下各项组成的组的官能团修饰:羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯、以及硅烷。[0140]在具有以下通式的肽中：Z-(X)a-(Y)b-Z'c，C末端保护基Z'可以是酰胺基。Z'可以具有式-C0NHR或-C0NRR'，其中R和R'选自由以下各项组成的组:H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。R和R'可以独立地是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。[0141]Z'可以是酯基。Z'可以具有式-C02R，其中R选自由以下各项组成的组:H、未取代或取代的烷基、以及未取代或取代的芳基。R可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。[0142]Z'可以是拟肽分子，包括天然的和合成的氨基酸衍生物，其中所述拟肽分子的C末端可以被选自由以下各项组成的组的官能团修饰:羧酸、酰胺、醇、醛、胺、亚胺、腈、脲类似物、磷酸酯、碳酸酯、硫酸酯、硝酸酯、顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜、叠氮化物、炔烃、烯烃、碳水化合物、酰亚胺、过氧化物、酯、芳基、酮、亚硫酸酯、亚硝酸酯、膦酸酯、以及硅烷。[0143]在根据第一方面的具有以下通式的肽中：Z-(X)a-(Y)b-Z'c，a可以是选自1至5,优选地2至5的整数。a可以是1、2、3、4或5。从所述肽的N末端到C末端，X的脂族氨基酸和脂族氨基酸衍生物可以表现出疏水性的整体降低。[0144]所述肽可以如下范围的浓度存在:相对于所述含有纳米粒子的水凝胶的总重量，约0·1%至约30.0%(w/w)，优选地0·1%至20%(w/w)，更优选地0·1%至10%(w/w)，更优选地0.1%至5%(w/w)，甚至更优选地0.1%至3%(w/w)。[0145]所述肽可以如下范围的浓度存在：约0.5%至约30.0%(w/w)、约1%至约30%(w/￥)、约2%至约30%(￥/\￥)、约3%至约30%(￥/'\￥)、约4%至约30%(￥/'\￥)、约5%至约30%(界/￥)、约6%至约30%(￥/\￥)、约7%至约30%(￥/'\￥)、约8%至约30%(￥/'\￥)、约9%至约30%(界/￥)、约10%至约30%(￥/\￥)、约11%至约30%(￥/\￥)、约12%至约30%(￥/\￥)、约13%至约30%(界/'\￥)、约14%至约30%(￥/'\￥)、约15%至约30%(￥/\￥)、约16%至约30%(￥/\￥)、约17%至约30%(￥/'\￥)、约18%至约30%(￥/\￥)、约19%至约30%(￥/'\￥)、约20%至约30%(￥/\￥)、约21%至约30%(￥/'\￥)、约22%至约30%(￥/'\￥)、约23%至约30%(￥/'\￥)、约24%至约30%(*/'\￥)、约25%至约30%(￥/'\￥)、约26%至约30%(￥/'\￥)、约27%至约30%(￥/'\￥)、约28%至约30%(界/w)、约29%至约30%(w/w)、约0·1%至约29%(w/w)、约0·1%至约28%(w/w)、约0·1%至约27%(￥/'\￥)、约0.1%至约26%(￥/'\￥)、约0.1%至约25%(￥/'\￥)、约0.1%至约24%(￥/\￥)、约0.1%至约23%(￥/'\￥)、约0.1%至约22%(￥/\￥)、约0.1%至约21%(￥/\￥)、约0.1%至约20%(￥/'\￥)、约0.1%至约19%(￥/'\￥)、约0.1%至约18%(￥/'\￥)、约0.1%至约17%(￥/'\￥)、约0.1%至约16%(w/w)、约0.1%至约15%(w/w)、约0.1%至约14%(w/w)、约0.1%至约13%(w/w)、约0.1%至约12%(w/w)、约0.1%至约11%(w/w)、约0.1%至约10%(w/w)、约0.1%至约9%(￥/\￥)、约0.1%至约8%(￥/\￥)、约0.1%至约7%(￥/\￥)、约0.1%至约6%(￥/\￥)、约0.1%至约5%(￥/'\￥)、约0.1%至约4%(￥/'\￥)、约0.1%至约3%(￥/'\￥)、约0.1%至约2%(￥/\￥)、约0.1%至约l%(w/w)、或约0.1%至约0.5%(w/w)。所述肽可以如下浓度存在：约0.1%(w/w)、约0.5%(w/w)、约1%(w/w)、约2%(w/w)、约3%(w/w)、约4%(w/w)、约5%(w/w)、约6%(w/w)、约7%(w/w)、约8%(w/w)、约9%(w/w)、约10%(w/w)、约ll%(w/w)、约12%(w/w)、约13%w)、约20%(w/w)、约21%(w/w)、约22%(w/w)、约23%(w/w)、约24%(w/w)、约25%(w/w)、约26%(w/w)、约27%(w/w)、约28%(w/w)、约29%(w/w)、或约30%(w/w)。[0146]所述含有纳米粒子的水凝胶可以进一步包含至少一种另外的物质。所述另外的物质可以由所述水凝胶封装、被固定在所述水凝胶的体相中、或与所述肽缀合。[0147]所述另外的物质可以选自由以下各项组成的组:染料、颜料、量子点纳米粒子以及半导体纳米粒子。[0148]如上文所述，本公开提供了一种产生所公开的含有纳米粒子的水凝胶的原位方法。[0149]所述方法包括以下步骤：[0150](a)将至少一种所公开的肽溶解在水溶液中；[0151](b)添加金属纳米粒子的前体，优选地金属盐溶液；[0152](c)凝胶形成以获得肽水凝胶；[0153](d)对由步骤(c)得到的肽水凝胶进行辐照；以及[0154](e)获得含有纳米粒子的水凝胶。[0155]所述金属盐可以选自由以下各项组成的组:AgN03、AuCl3、HAuCl4、CuS〇4、CuS〇4·5H20、Cu(N03)2和它的水合物、Cu(OAc)2和它的水合物、FeCl3和它的水合物、FeCl2和它的水合物(及所有氯化铁水合物）、K2PtCl4、PdCl2、H2PdCl4以及Pd(N〇3)2。[0156]所述前体的浓度可以在以下范围内：约0.001M至约1M、或约ImM至约lOOOmM，优选地ImM至lOOmM，甚至更优选10mM至50mM。[0157]所述前体的浓度可以在以下范围内：约50mM至约lOOOmM、约100mM至约lOOOmM、约150mM至约lOOOmM、约200mM至约1000mM、约250mM至约lOOOmM、约300mM至约lOOOmM、约350mM至约lOOOmM、约400mM至约lOOOmM、约450mM至约lOOOmM、约500mM至约lOOOmM、约550mM至约1000mM、约600mM至约1000mM、约650mM至约1000mM、约700mM至约1000mM、约750mM至约lOOOmM、约800mM至约lOOOmM、约850mM至约lOOOmM、约900mM至约lOOOmM、约950mM至约lOOOmM、约ImM至约950mM、约ImM至约900mM、约ImM至约850mM、约ImM至约800mM、约ImM至约750mM、约ImM至约700mM、约ImM至约650mM、约ImM至约600mM、约ImM至约550mM、约ImM至约500mM、约ImM至约450mM、约ImM至约400mM、约ImM至约350mM、约ImM至约300mM、约ImM至约250mM、约ImM至约200mM、约ImM至约150mM、约ImM至约100mM、或约ImM至约50mM。所述前体的浓度可以是约ImM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约550mM、约600mM、约650mM、约700mM、约750mM、约800mM、约850mM、约900mM、约950mM、或约1000mM。[0158]所公开的合成方法的步骤(b)可以在水中或在无氯化物和磷酸盐的缓冲液，优选地Tris缓冲液中，在生理pH或碱性pH，如约7.4或约8.5、或约pH7至约pH9的pH下进行。[0159]所述pH可以是约pH7.2、约pH7.4、约pH7.6、约pH7.8、约pH8.0、约pH8.2、约pH8.4、约pH8.6、约pH8.8、或约pH9.0。[0160]优选地，根据所公开的合成方法所形成的金属纳米粒子是原位形成的。[0161]根据所公开的合成方法所形成的金属纳米粒子可以在胶凝（步骤(c))之后，经由用光，优选地紫外(UV)光辐照数分钟至数小时，优选地1分钟至60分钟，甚至更优选地1分钟至10分钟而原位形成。用光进行的辐照可以持续约1分钟至约60分钟、约1分钟至约50分钟、约1分钟至约40分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约20分钟、约1分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟、或约1分钟至约5分钟。用光进行的辐照可以持续约1分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、或约60分钟。[0162]所公开的方法的原位还原可以经由还原剂来实现。所述还原剂可以是生物相容性还原剂，如柠檬酸或抗坏血酸钠。可以在胶凝之前或之后（即在步骤(c)之前或期间或在步骤(c)之后)添加所述还原剂，其中在添加还原剂时，所述辐照步骤(d)可以被省去。[0163]如上文所述，本公开提供了一种含有纳米粒子的水凝胶。[0164]所述含有纳米粒子的水凝胶是通过所公开的原位方法来制备的。[0165]如上文所述，本公开提供了所公开的含有纳米粒子的水凝胶的用途。[0166]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用作用于金属递送，优选地用于持续释放或受控释放金属递送的装置。[0167]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用作抗微生物剂。[0168]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于治疗感染性疾病的方法中，其中，优选地，所述感染性疾病是由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母或真菌所引起。[0169]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用作伤口敷料和用于伤口愈合。所述含有纳米粒子的水凝胶提供在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0170]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于外科手术应用。[0171]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于防止细菌附着和/或微生物生物膜的形成。[0172]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于局部医疗施用。[0173]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于生物成像(通过利用金属纳米粒子的荧光)。[0174]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以与医疗装置组合使用，所述医疗装置如支架、假体、导管、牙科植入物、矫形装置、矫形用植入物。[0175]所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以用于其中将所述水凝胶用作(干燥)膜的应用，如过滤。[0176]有利的是，所公开的水凝胶可以不需要另外的化学修饰而显示出抗细菌特性。[0177]如上文所述，本公开提供了一种用于金属递送的装置。[0178]所述用于金属递送的装置包括所公开的含有纳米粒子的水凝胶。所述用于金属递送的装置优选地用于持续释放或受控释放金属递送。[0179]有利的是，所公开的水凝胶可以显示出金属纳米粒子在一段较长的时间，例如多于10天内的持续释放。[0180]进一步有利的是，所公开的水凝胶可能能够完全释放所述金属纳米粒子，甚至是在使用低浓度的金属盐前体时也是如此。[0181]还有利的是，所公开的水凝胶可能只需要低浓度的金属盐前体。[0182]如上文所述，本公开提供了一种抗微生物剂，其包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶。[0183]如上文所述，本公开提供了一种伤口敷料或伤口愈合剂，其包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶。[0184]所述伤口敷料或伤口愈合剂优选地用于预防微生物感染和/或微生物生物膜的形成。[0185]有利的是，所公开的水凝胶能够防止细菌附着，且因此防止生物膜的形成。[0186]有利的是，所公开的水凝胶能够包封多达99.9%的水。因此有利的是，来自所公开的水凝胶的水分可以在施用于伤口部位时防止不希望有的粘着，从而有助于无创性去除敷料。[0187]所公开的水凝胶提供了在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0188]如上文所述，本公开提供了一种药物或化妆品组合物，其包含所公开的含有纳米粒子的水凝胶。[0189]所公开的药物或化妆品组合物可以局部凝胶或乳膏剂、喷雾剂、粉剂、或薄片、贝占剂或膜的形式提供。所公开的药物或化妆品组合物可以注射溶液的形式提供。所公开的药物或化妆品可以进一步包含药学活性化合物和/或药学上可接受的载体。[0190]如上文所述，本公开提供了一种治疗感染性疾病的方法。[0191]所述方法包括以下步骤：向有需要的个人或受试者施用有效量的所公开的含有纳米粒子的水凝胶或所公开的药物组合物。优选地，所述感染性疾病是由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母或真菌所引起。[0192]如上文所述，本公开提供了一种治疗伤口和用于伤口愈合的方法。[0193]所述方法包括以下步骤：向伤口施用有效量的所公开的含有纳米粒子的水凝胶或所公开的药物组合物。[0194]有利的是，所公开的水凝胶可以具有柔性，且因此，能够被施用于皮肤上别扭的或不平坦的位置上。[0195]所述含有纳米粒子的水凝胶提供了在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和较大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0196]如上文所述，本公开提供了一种生物成像装置，其包括所公开的含有纳米粒子的水凝胶以供体外和/或体内使用。[0197]所述生物成像装置优选地用于口服、注射和/或局部施用。[0198]如上文所述，本公开提供了所公开的含有纳米粒子的水凝胶用于制造用于治疗感染性疾病的药物的用途。[0199]如上文所述，本公开提供了所公开的含有纳米粒子的水凝胶用于制造用于治疗伤口和/或用于伤口愈合的药物的用途。[0200]所述含有纳米粒子的水凝胶提供了在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和较大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0201]如上文所述，本公开提供了一种试剂盒，其包括[0202](i)至少一种如本文所定义的肽，[0203]所述肽任选地处于水溶液中；[0204](ii)金属纳米粒子的前体，[0205]优选地金属盐溶液(如AgN03);[0206](iii)有关凝胶形成以获得肽水凝胶以及有关对由此所得到的肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；[0207](iv)任选的赋形剂。[0208]如上文所述，本公开提供了一种试剂盒，其包括[0209](i)由至少一种如本文所定义的肽获得的水凝胶，[0210]所述水凝胶优选地处于免受(任何种类的）辐射的容器或容纳装置中；[0211](ii)金属纳米粒子的前体，[0212]优选地金属盐溶液(如AgN03);[0213](iii)有关对所述肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；[0214](iv)任选的赋形剂。[0215]在所公开的含有纳米粒子的水凝胶中，肽链的官能团与金属纳米粒子(如银纳米粒子)之间的相互作用可以相互补充，从而引起受控的原位金属纳米粒子合成。此外，超短的肽水凝胶的纤维结构有助于使经由UV辐照还原金属离子而原位合成的金属纳米粒子的聚集减到最低限度，而金属纳米粒子有助于使水凝胶的结构稳定。有利的是，所公开的含有纳米粒子的水凝胶可以不需要另外的化学修饰。[0216]所公开的用于原位合成含有纳米粒子的水凝胶的方法可以是易于遵循的和快速的，这是因为在一个实施方案中可能只耗费约1分钟的UV辐照来将金属离子还原成金属纳米粒子。与其它提出的生物材料对比，所公开的水凝胶可以被更高效地制备，从而节省了生产时间，其它提出的生物材料分别需要长达12小时、3小时以及1小时来将金属离子还原成它们的生物材料中的金属纳米粒子。所公开的用于原位合成含有纳米粒子的水凝胶的方案还允许在水凝胶的纤维结构内均匀分布的金属纳米粒子的可再生的合成，从而允许所公开的水凝胶在整个施用区域上有效地发挥它们的抗微生物活性。[0217]在需要使用所公开的水凝胶时，使用所公开的合成方案，金属离子可以被还原成金属纳米粒子。这确保了所公开的水凝胶中金属纳米粒子的质量和量的一致性。[0218]用于生物成像的焚光金属纳米粒子或纳米团簇[0219]焚光金属纳米粒子，如金(Au)纳米粒子、银(Ag)纳米粒子或铜(Cu)纳米粒子可以作为量子点和有机染料的替代物用于生物成像。量子点由于它们的镉含量而一般具有高毒性，而有机染料分子常常遭受光致漂白。荧光金属纳米粒子因此可以为这些生物成像剂提供一种良好的替代物。[0220]通过将银纳米粒子的抗微生物活性与它们可能的荧光(这取决于纳米粒子尺寸和表面分子)组合在一起，所公开的水凝胶可适用于生物成像和力学传感器中。[0221]优选实施方案的进一步说明[0222]先前已经介绍了一种新型类别的超短肽，所述肽含有3-7个氨基酸，具有固有的自组装能力以进行自组装。肽单体形成螺旋状纤维，这些纤维缠结成三维网络并最终包封水以形成水凝胶(Hauser等，2011;Mishra等，2011)。这些水凝胶在机械刚度、弹性以及生物相容性方面显示出显著的特性并且已经作为仿生材料被成功地用于不同的应用中(Lakshmanan等，2013)。然而，以物理方式将生物活性化合物包封于自组装肽水凝胶内的更早尝试导致了爆发释放，而持续释放却从未实现。因此，此项研究的目标在于开发一种有机-无机混合系统，所述系统优选地使得能够初始爆发释放，继而持续释放生物活性纳米粒子以用于伤口愈合应用。[0223]具体来说，在本公开中，报道了一种新型的银浸渍的生物材料的开发，所述生物材料是由只含有脂族氨基酸的超短肽制成。这种独特类别的超短肽能够在水中以及在生理相关缓冲液中自组装以形成水凝胶（Hauser等，2011;Mishra等，2011)。由肽Ac-LIVAGK-NH2(Ac-LK6-NH2)制成的凝胶被用作基质以用硝酸银作为Ag(I)源进行原位AgNP合成。在UV光下，银在非常短的时间内在不存在任何其它还原剂的情况下被还原。通过透射电子显微术(TEM)和流变学来研究所得的混合生物材料的形态学特性和机械特性，并且评价它的抗细菌特性。此外，使用人类原代真皮成纤维细胞来进行生物相容性研究以评价所述混合生物材料对于伤口愈合应用的适用性。[0224]讨论[0225]本发明人已经探究了通过加入原位形成的银纳米粒子来为超短肽增添抗细菌特性的可能性。纤维肽水凝胶的多孔特征和肽链的官能团的非反应性支持银纳米粒子的受控原位形成。此外，银纳米粒子形成的简易方式给出了与先前所报道的系统相比的优势。不同于其它所报道的抗细菌性水凝胶，如与PEG共混的多孔壳聚糖(Vimala等，2010)和电纺明胶纤维垫(Rujitanaroj等，2008)，Ag-Ac-LK6_NH2水凝胶不需要另外的化学修饰。[0226]单分散的AgNP的成功合成是通过TEM显微术证实，TEM显微术示出了10-20nm的平均尺寸分布（图3A至D)和在整个测量的样品中的均匀分布。在暴露于细菌之前（图3E)和之后（图3F)所测量的样品同样如此。小的单分散的纳米粒子的合成对于具有抗细菌特性的材料来说是关键性的。由Martinez-Gutierrez等（2010)进行的最新研究已示出抗细菌性AgNP的理想尺寸是低于25nm。本发明正好在这个范围内。有趣的是，观测到与没有AgNP的凝胶相比，水凝胶和AgNP在水凝胶的机械特性方面显示出协同效应（图2)。流变学研究显示含有10mMAgNP的凝胶具有是具有相同浓度，但是没有AgNP的样品差不多两倍的储能模量。类似于在盐晶体存在下将水凝胶进行生物矿化的情况下的观测结果，银纳米粒子在凝胶内的存在使得机械刚度显著增加。在长达14天内观测到持续释放，其中在前48小时内存在更快的释放。AgNP的释放对于新材料用作抗细菌剂的能力来说是关键性的。只有当AgNP被释放到水凝胶的周围环境中时，才将观测到有效的细菌治疗。此外，在开始时AgNP的更快释放递送了更高局部浓度的抗细菌剂，从而有助于快速减轻由细菌感染所引起的炎症。此外，在随后12天内的持续释放有助于防止再感染。[0227]虽然已经报道了银纳米粒子在2周内的持续释放，但是含有反应性儿茶酚部分的水溶性聚乙二醇(PEG)聚合物只能够释放水凝胶纸片内部银总量的约1%(Fullenkamp等，2012)。相比之下，Ag-Ac-LK6-NHfK凝胶（lOOyL)能够释放高达90%的原位合成的银纳米粒子，而使用比先前所报道的系统低得多的浓度。[0228]使用以下两种不同的方法测试所述新材料抑制细菌生长的能力:纸片扩散法和悬液法。这两种方法均显示了在生长抑制方面类似的趋势，且因此证实了彼此的结果。非常有趣地注意到，与对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.co1i)相比，AgNP对抗绿脓杆菌(P.aeruginosa)最为有效，所述绿脓杆菌是一种因它的药物抗性而闻名的细菌菌株，所述药物抗性可以通过四环素对照在绿脓杆菌中减低的活性而被看到。对于这两种方法，观测到对绿脓杆菌的杀灭，这在使用纸片扩散法时是通过透明的圆形周围区域来指示。此外，在使用悬液法的情况下看到起始光密度(0D)的减小（图6)。考虑到绿脓杆菌非常难治疗且因此在感染后可能导致严重的健康问题，有效的抗微生物化合物的开发是一个非常重要的问题。基于所获得的细菌抑制数据，Ag-Ac-LK6-NH2可以在治疗伤口感染方面提供新的有价值的新机会。这将克服对口服或静脉内施用传统抗生素的需要并且可以有助于减少医疗费用。[0229]为了表征新近开发的生物材料是否仅显示出细菌杀灭功效，而没有哺乳动物细胞毒性，在体外测试生物相容性。为了这个目的，使用原代HDFa细胞，并且将所述细胞与Ag-Ac-LK6-NH2-起在跨孔(transwe11)系统中孵育。此实验装置证实了细胞暴露于AgNP。提出将AgNP水凝胶作为一种有效的伤口敷料装置，其中AgNP被释放到伤口中。生物相容性研究的结果示于图7中，该图示出了在24小时和48小时之后的细胞活力。在这两个时间点时，观测到细胞活力降低了约20%。然而，在与未处理的对照相比较时，活/死测定没有显示出显著数目的死细胞（图7b-d)。使用1%琼脂凝胶作为对照，观测到琼脂对照几乎与由1%肽水凝胶所获得的值相匹配。在放置空的跨孔时，在24小时和48小时之后观测到活力降低。然而，即使是空的跨孔，在48小时的孵育之后也显示出细胞活力的约10%降低（图7a)。这些结果得出以下结论，即跨孔设置使细胞环境发生变化并且因此影响了细胞增殖率，但没有影响可以由活/死测定分析所看到的活力。最有可能的是，来自培养基的营养因子被保持在凝胶、琼脂或跨孔膜基质中，从而导致细胞增殖减少。鉴于这些结果，Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶似乎能够有效杀灭细菌而不会显著改变细胞活力。[0230]结论[0231]使用超短自组装肽和硝酸银开发出含有原位形成的银纳米粒子的抗细菌性水凝胶。硝酸银向银纳米粒子的转化只需要存在UV光。在水凝胶形成之后实现原位AgNP形成，从而使得在多孔的水凝胶结构下Ag(I)还原成AgNP之后获得受控的粒度。此方法允许在没有添加外部还原剂的情况下形成单分散的AgNP。通过TEM对AgNP的形成进行表征，证明可以形成具有小于20nm的单分散粒子。纳米粒子还均匀分布于所测量的样品内。含有AgNP的水凝胶在与肽水凝胶单独相比时显示出提高的机械强度。得出的结论是银纳米粒子在软物质水凝胶内的存在使得水凝胶的机械刚度增加。使用三种细菌菌株，即大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌进行抗细菌测试。使用少到10mM的银纳米粒子水凝胶，对于所有三种细菌菌株均观测到高效的细菌生长抑制。这是比用其它系统所报道的量显著更少的量。重要的是注意到，对于绿脓杆菌获得了最好的结果，绿脓杆菌因它的多重耐药性而闻名且因此在患者中非常难治疗。对HDFa细胞进行的生物相容性研究显示新型生物材料不会显著地影响细胞活力。银浓度显然处于治疗窗内，但是低到足以不会显著影响哺乳动物细胞活力。这种新型的释放银的生物材料提供在伤口愈合中，特别是在手术之后、在治疗如糖尿病性溃疡或严重烧伤的慢性和较大表面伤口中施用的巨大潜能，这是因为它具有减轻炎症的潜能并且它易于施用。[0232]另外的优势和比较[0233]本文所述的银释放研究证明了在12天内银的持续释放。所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶的这种特性允许它们充当杀细菌剂并且防止可能妨碍伤口愈合的细菌生物膜形成。Silvazine?中的当前技术需要每日更换敷料，而Acticoat?只提供最多7天的细菌防护。除了由于更换伤口敷料的频率减小而使得费用降低之外，所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶对于使用者和临床医师这两者来说还提高了便利性。虽然先前已经对于含有反应性儿茶酚部分的水溶性聚乙二醇(PEG)聚合物报道了银纳米粒子在2周内的持续释放，但是这些聚合物只能够释放水凝胶纸片内部银总量的约1%。相比之下，且如本文所述，所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶（lOOyL)能够完全释放原位合成的银纳米粒子。[0234]所公开的水凝胶能够包封多达99.9%的水。另一方面，Acticoat?7和Acticoat?Flex在整个愈合过程中需要持续的外部润湿。由于提供湿润的环境对于优化伤口愈合过程来说是关键性的，因此所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶在临床上可以是优越的并且更方便使用者使用。[0235]除了Acticoat?吸收剂以外，所有以Silvazine?和Acticoat?可商购获得的伤口处理产品均在不同程度上粘着到新形成的皮肤上，所述Acticoat?吸收剂利用来自伤口的渗出液形成凝胶，从而使粘着减到最低程度。然而，不是所有的伤口都产生足够的渗出液用于形成凝胶并且在水分存在不足的情况下，仍可能发生与皮肤的显著附着。相比之下，来自nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶的水分防止不希望有的粘着，从而有助于无创性去除伤口辅料并且是临床上优选的。[0236]所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶还更易于使用，因为它们可被施用于别扭的位置上。虽然已经作出改进来设计不太具有刚性的伤口治疗敷层，如Acticoat?Flex，但是应当了解的是，固体网状物不如所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶那样有柔性。在具有柔性的情况下，所公开的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶可被更加方便地施用，从而节省了作业时间。【附图说明】[0237]附图图示了所公开的实施方案并且用来阐明所公开的实施方案的原理。然而，应当了解的是，所述附图仅被设计用于图示的目的，而不用作对本发明的限制条件的限定。[0238]图1示出了用AgN03溶液合成的水凝胶。(A)使用UV辐射将AgN03溶液中存在的Ag+离子还原成Ag(0)，使得水凝胶中的颜色从无色变成棕色(从左到右:OmMAgN03;10mMAgN03;20mMAgN03)。⑶将肽吸移到凝胶模中，使它胶凝，然后用UV辐照。[0239]图2是示出了有和没有10mg/mL和15mg/mL的银纳米粒子的超短肽水凝胶的流变学特征的图表。以0.1%的应变进行频率扫描。[0240]图3是在水中使用10mM(A、B)和20mM(C、D)AgN03溶液所形成的Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶以及在与细菌一起孵育之前(E)和之后(F)在pH8.4的Tris缓冲液中使用10mM溶液所形成的Ag-AC-LK6-NH^K凝胶中银纳米粒子分布的一系列透射电子显微镜(TEM)图像。(A、C)银纳米粒子的均勾分布。(B、D)银纳米粒子的尺寸是约10-20nm。[0241]图4是示出了银从100yL的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶中随时间而变的累积释放的图表。[0242]图5描绘了对nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶的抗微生物特性的评估。[0243](A)对用不同的[AgN03]溶液形成的nAg-Ac-LK6-NH2水凝胶以及它们对抗细菌的功效的初步测试；[0244](B)纸片扩散法；[0245](C)细菌悬液法，其中在对照（第二排）上有可见的细菌附着而没有细菌粘附到nAg-Ac-LK6_NH2水凝胶(第一排)上。枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilus)也更强地附着到对照上(比较第2列和第3列）。[0246](D、E)在24小时孵育之后枯草芽孢杆菌和大肠杆菌分别的细菌悬液的平均光密度。[0247]图6是示出了银从1OOmL的Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶中随时间而变的累积释放的图表。[0248]图7描绘了通过纸片扩散法对Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶的抗微生物特性进行的评估。[0249](A)在覆盖了绿脓杆菌的琼脂平板上比较Ag-Ac-LK6-NHfK凝胶和Ac-LK6-NHfja^胶；[0250](B)与单独的Ac-LK6-NH2水凝胶相比，所得的半径测量结果的图表表示。[0251]图8示出了在t=0和t=24时在大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌中0D测量结果的一系列图表表示。条柱是根据附图图例说明中的顺序排列，即（从左到右^8-八(3-LIVAGK-NH2、Ac-LIVAGK-NH2、四环素（10yg/mL)、四环素(20yg/mL)、以及对照。[0252]图9示出了针对未处理的细胞归一化的生物相容性的图表表示(A)、经过Ag-Ac-LK6-NH2(B)、Ac-LK6-NH2(C)处理的细胞、或未处理的细胞(D)分别的活/死图像。条柱是根据附图图例说明中的顺序排列，即（从左到右)Ag-Ac-LIVAGK-NH2、Ac-LIVAGK-NH2、琼脂、跨孔、以及对照。[0253]实施例[0254]将通过参考具体实施例进一步更详细地描述本发明的非限制性实施例和比较实施例，所述实施例不应当被视为以任何方式限制本发明的范围。[0255]1.材料和方法[0256]1.1用于肽合成的材料[0257]Fmoc-lys-rink树脂(树脂0.42mg/mol);受Fmoc保护的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸；以及〇_(苯并三唑-1-基）-N，N，N'，N'_四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)购自吉尔生化(上海）有限公司（GLBiochem(Shanghai)Ltd)。二甲基甲酰胺(DMF)(分析级）购自飞世尔科技公司（FisherScientific)。乙酸酐(Ac2〇)和二甲亚砜(DMS0)购自西格玛奥德里奇公司（SigmaAldrich)Α,Ν-二异丙基乙胺(DIPEA)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸（TFA)及TIS(三异丙基硅烷）购自阿法埃莎公司（AlfaAesar)。哌啶和硝酸银(AgN〇3)购自MerckSchuchardt0HG公司。乙酿(Et2〇)购自天地公司（TediaCompanyInc)。[0258]将Ac-LIVAGK-NH2(Ac-LK6-NH2)在装备有ZorbaxSB-C18柱（21·2mmX150·0mm，07μLη)的Agilent1260Infinity制备型HPLC系统上纯化。将HPLC经过主动分流器与SQ-MS联用以进行质量触发的级分收集。使用MilliQ水和HPLC级乙腈作为洗脱剂，这两者均含有0.1%的甲酸，并且使用溶剂梯度来洗脱纯肽。在装备有ESI喷雾室并与制备型Agilent1260HPLC单元联用的Agilent6130QuadrupoleLC/MS系统上以正离子模式测量ESI-MS谱。[0259]1.2TEM分析[0260]使用PhilipsCM300FEGTEM以300kV进行TEM分析。使用GatanDigitalMicrograph分析TEM图像。在分析之前将样品冷冻干燥，然后重悬在EtOH中并且滴在碳膜Cu网上以进行TEM成像。[0261]1.3肽合成和纯化[0262]使用固相肽合成来合成Ac-LK6_NH2肽。简单地说，称重出Fmoc-lys-rink树脂并使珠粒在DMF中溶胀1小时。随后，添加10当量的Ac20和DIPEA以防止侧基反应，并将混合物孵育45分钟。接着将树脂用DMF洗涤，之后经历一系列使用于DMF中的20%哌啶进行的脱保护反应以及通过添加4当量所期望的氨基酸以及4当量TBTU和4当量DIPEA所进行的偶联反应。使用4倍过量的Ac20和DIPEA对N末端进行乙酰化。在这之后，将树脂用DCM洗涤并干燥，之后使用95%TFA、2.5%水及2.5%TIS的混合物将肽从其上裂解。在减压下去除溶剂并且添加Et20以使肽沉淀。将肽通过离心分离，用Et20洗涤两次并在减压下干燥。在与电喷雾电离质谱设备联用的制备型高效液相色谱系统（ΗPLC-ESI-MS)(安捷伦科技公司（Agi1entTechnologies)，1260Infinity系列）中进行纯化。将肽通过将其完全溶解在最少量的DMSO中而引入到HPLC-MS系统中。产量：3.4g(60%)，ESI-MS:C3qH57N8〇7的（[Μ+Η+Γ)计算值：641.43,实测值:m/z641.5。[0263]1.4水凝胶制备[0264]用于凝胶制备的所有溶液均使用Tris缓冲液（100mM，pH8.5)，该Tris缓冲液是由Tris碱制备并用1M硝酸使其达到8.5的pH。用于制备水凝胶的标准工序涉及将所需量的使用Tris缓冲液制备的AgN03溶液添加到所称重出的Ac-LK6-NH2样品中以实现所期望的浓度。简单地说，为了制备10mg/mLAc-LK6-NHfK凝胶，将lmLAgN03溶液添加到10mg肽中。在暗处胶凝之后，使用UV灯在254nm下使水凝胶经受UV辐射，持续约5分钟。[0265]1.5.振荡流变测定法[0266]使用ARESG2流变仪(TA仪器公司（TAInstruments))测量肽水凝胶的粘弹性。使用8mm直径的锯齿状不锈钢平行板几何形状并且将间隙距离维持在0.8mm与2mm之间。针对0.1-lOOrad/s的范围，使用0.1%应变进行振荡频率扫描研究。从0.01%到100%应变，用lrad/s的角频率进行振荡幅度扫描研究。所有测量均是在25°C下，在胶凝后一天进行的。[0267]1.6通过电感耦合等离子体质谱分析测定银释放[0268]在24孔跨孔板(Corning_Transwell?6·5mm，8·ΟμΜ，具有聚碳酸酯膜插入物）中，使用跨孔中100此的凝胶和周边孔中400yL的PBS溶液来进行银释放研究。为了这个目的，在!^8缓冲液（10〇11^，？!1=8.5，含有1〇1111的48勵3)中制备含有48即的凝胶并且将10(^的所得溶液添加到跨孔中。使凝胶固化过夜，之后，通过使凝胶暴露于UV光(254nm，持续5分钟）形成AgNP。然后，将跨孔放入24孔板中并且将400yL的roS溶液添加到周边孔中。在不同的时间点获取样品并且将这些样品用硝酸(68%suprapur，默克公司(Merck))以1:1的体积比消化过夜。在稀释样品之后，通过ICP-MS分析来测定药物释放。在释放研究结束时，将剩余的凝胶溶解在400yLPBS中以确定总药物浓度。[0269]在PerkinElmerElanDRCII仪器上进行所有的ICP-MS分析并且使用1Q7Ag同位素进行定量。使用l_200ppb的外标(西格玛-奥德里奇公司）进行校准。基于使用Elan软件所绘制的校准曲线计算样品的浓度，并且将浓度以百分比形式用于计算累积释放曲线。[0270]1.7细菌生长抑制测定[0271]制备Ac-LK6-NH2/AgNP水凝胶以进行细菌悬液法测定[0272]在24孔无菌Nunc板中制备凝胶。新鲜制备10mMAgN〇3于lOOmMTris缓冲液(pH=8.5)中的溶液并且用于溶解肽至10mg/mL的最终浓度。将所得溶液超声处理15-20秒以确保肽完全溶解。然后将400yL的肽溶液等分到每个孔中并且使其均匀地铺在表面上。选择Ac-LK6-NH2的浓度以允许在合理的时限内形成透明的固体水凝胶，同时允许将肽溶液均匀等分到板的孔中。尽管Ac-LK6-NH2在Tris缓冲液中在10mg/mL下数分钟内就会发生胶凝，但将板在暗处静置过夜以确保完全胶凝。在使用之前，使板暴露于254nm下的短波长UV，持续5分钟以允许AgNP形成。对于对照凝胶，使用不含AgN03的lOOmMTris缓冲液进行Ac-LK6-NH2水凝胶的制备。[0273]选择银的浓度以使得可使用尽可能少的材料实现所期望的杀灭效率。经由纸片扩散法评价具有不同浓度的银，即ImM、10mM、25mM及50mM的Ac-LK6-NH2水凝胶杀灭细菌的功效。已发现，与10mM凝胶相比，在使用含量高得多的银时，25mM凝胶和50mM凝胶具有略微更高的效率。因此，10mM浓度被认为是最佳的并且被用于后续的体外评价。[0274]细菌悬液法测定[0275]伴随300rpm下的恒定振荡，将50yL的细菌原种在37°C下接种到5mL的Luria-Bertani(LB)培养基(pH=7.5)中过夜。然后将对数期的细菌溶液在LB培养基中稀释以获得0.07的O.D.(在600nm)。这被用作起始细菌溶液(0小时读数)并且将400yL的溶液分配到含有水凝胶的24孔板的每个孔中。将ΙΟμΜ和20μΜ最终浓度的四环素抗生素(美国的西格玛奥德里奇公司）用作阳性对照。不含AgΝΡ的Ac-LK6-NH2水凝胶和只含细菌的溶液充当阴性对照。将板包在铝箱中并在37°C下在50rpm旋转下在振荡孵育箱中放置24小时。对于0.D.读数，在即将测量之前将l〇〇yL的细菌溶液转移到透明的96孔Nunc板中以防止水凝胶层影响吸光度测量。按一式三份进行测定，每个独立实验有三个重复样品。[0276]用于制备水凝胶的环模法[0277]对于流变测定法和纸片扩散实验，使用环模法来制备水凝胶以确保均匀的凝胶体积并有助于容易地转移完整的凝胶。在溶解肽之后，将溶液的200yL等分部分立即转移到放置在清洁的35mm组织培养皿上的9mm直径的塑料环模中。将每个环模的顶部和底部用石蜡膜层覆盖，并且将组织培养皿用石蜡膜紧密地密封以防止蒸发。使凝胶固化过夜并且使用UV光在约5分钟内实现NP形成。[0278]用于评价抗细菌特性的纸片扩散法[0279]将150yL的对数期细菌原种均匀地涂铺到LB琼脂（1.5%琼脂)平板上并且孵育直到形成细菌生物膜为止。将水凝胶纸片置于膜的顶部上并且在24小时之时测量抑制/杀灭区。使用一对游标卡尺测量抑制区的直径。按一式三份进行所有的实验。[0280]1.8细胞培养[0281]人真皮成纤维细胞-成人(HDFa)购自龙沙公司（Lonza)。将细胞培养在含有2mML-谷氨酰胺和厄尔氏盐(Earle'ssalt)的MEM(500mL)中，该MEM补充有10%的热灭活的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素的混合物（美国加利福尼亚州的英杰公司（Invitr〇gen，CA，U.S.A))、碳酸氢钠（1.5g//L最终浓度）、NEAA(5mL的100X原种）以及丙酮酸钠(5mL的100mM原种）。在37°C下将细胞在具有95%空气和5%⑶2的加湿的孵育箱中维持在T175细胞培养瓶或T75细胞培养瓶(Nunc公司）中。[0282]生物相容性研究[0283]在24孔跨孔板(Corning丁ranswell%·5mm，8·ΟμΜ，具有聚碳酸酯膜插入物）中，使用跨孔中100yL的凝胶和周边孔中400yL的培养基进行生物相容性研究。在24小时和48小时孵育之后测量细胞活力。[0284]将HDFa细胞（12，000个细胞/孔)接种到24孔板中并且在400yL培养基中孵育24小时。在此期间，制备100yL含有水凝胶的跨孔。为了这个目的，称重出Ac-lk6-nh2,并且添加含有1OmMAgN〇3的TriS缓冲液（10OmM，pH=7.5)以获得10mg/mL的总浓度。将10OyL所制备的溶液添加到跨孔中并且使其在37°C下胶凝4小时。作为对照，以相同的方式，但是在不存在AgN03下制备Ac-LK6-NH2水凝胶。对于阳性对照，使用不存在任何水凝胶的细胞、在含有100μL的1%琼脂凝胶的跨孔下的细胞以及在空跨孔下的细胞。在将含有水凝胶的跨孔插入到细胞培养板中之前，使用UV光形成AgΝΡ。为了保持样品无菌，使用层流柜的UV光，并且将暴露时间延长到10分钟。随后，将跨孔置于在板上生长的细胞上并且孵育24小时。借助于比色微量培养测定(WST-1，罗氏公司(Roche))测定细胞活力。将跨孔从板中取出，小心地去除培养基并且添加新鲜的含有10%WST-1试剂的培养基。在37°C下孵育2小时之后，将90yL的上清溶液转移到96孔板上并且在板读数器（InfiniteM200，Tecan公司）上测量在450nm下的吸收。为了确定在与水凝胶一起孵育48小时之后的毒性，将含有WST-1的溶液从细胞中去除，并且添加新鲜的培养基。在1小时孵育之后，再次更换培养基并且将跨孔添加回来。再孵育24小时之后(总共48小时孵育），如上文所述测定细胞活力。除了1%琼脂对照和空的跨孔之外，所有实验均是按独立的一式三份进行。按独立的一式两份进行含有1%琼脂的对照和空的跨孔，每一式两份至少四个样品。生物相容性被表示为相对于未处理对照的存活百分比。[0285]活/死测定[0286]将HDFa细胞接种在24孔板中（12，000个细胞/孔)并且孵育24小时。之后，使细胞暴露于在跨孔中所制备的Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶样品，持续48小时。使用Ac-LK6-NH2水凝胶和未处理的细胞作为对照。在跨孔板中，如对于生物相容性研究所述进行孵育。在48小时之后，取出跨孔，将培养基更换为含有约2μΜ钙黄绿素AM和4μΜ乙锭同二聚体-1的DPBS溶液（UVE/DEAD?活力/细胞毒性试剂盒，LifeTechnologies?)并且孵育40分钟。在即将成像之前，去除培养基溶液以获得更大的清晰度。活细胞在绿色通道中成像并且死细胞在红色通道中成像。使用ImageJ使所获得的图片叠加。[0287]2.结果[0288]2.1混合水凝胶的形成[0289]通过在8.5的碱性pH下将AgN03溶液添加到Ac-LIVAGK-NH2中并且在胶凝之后使水凝胶暴露于254nm下的UV辐射持续几分钟而形成含有银纳米粒子的水凝胶(Ag-Ac-LK6-NH2)。胶凝速率没有显著地受到所用的AgN03溶液浓度的影响。更高的肽浓度需要更短的胶凝时间，即15mg/mL的Ag-Ac-LK6_NH2仅花费了约1分钟进行胶凝，相比之下，10mg/mL的Ag-Ac-LK6-NH2则花费了30分钟。通过用UV光将样品辐照几分钟来实现后续的纳米粒子形成。对于含有更高的银纳米粒子浓度的水凝胶观测到颜色变化(从无色变成棕色）（图1A)。此外，含有银纳米粒子的水凝胶与不含银纳米粒子的水凝胶相比更好地保持形状(图1B)。[0290]在AgNP形成过程期间，观察到凝胶的机械特性发生变化。为了对此观察结果进行定量，使用振荡流变测定法来研究有和没有银纳米粒子的水凝胶之间以及具有不同肽浓度的水凝胶之间机械特性的差异。以〇.1%应变从〇.1_1〇〇^(1/86(3进行频率扫描。如图2中所描绘，可以观测到有和没有AgNP的样品之间储能模量的显著差异。[0291]2.2原位合成的银纳米粒子的TEM图像[0292]在冷冻干燥样品之后拍摄在Milli-Q中使用10mM和20mMAgN03溶液所形成的Ag-Ac-LK6-NHfK凝胶的TEM图像。如在图3A和3C中所见，可以通过用UV光将银离子还原来实现银纳米粒子的均匀分布。此外，用UV光进行的受控还原产生了粒子的AgNP在约10-20nm的均匀尺寸分布，这可以在图3a和3c以及图3B和3D中的高分辨率图像中看到。具有10-20nm的尺寸范围的单分散NP对于实现有效的抗细菌活性来说是理想的(Martinez-Gutierrez等，2010)。此外，甚至在更高的浓度下仍观测到单分散的AgNP，因而，更高的Ag+离子浓度仅产生更高数目的银纳米粒子，但是没有产生更大的粒子。[0293]2.3复合超短肽水凝胶的银释放特性[0294]在跨孔板中研究银从Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶中的释放。将Tris缓冲液(pH=8.4)中的1OOyLAg-Ac-LK6-NH2水凝胶在PBS(pH7·4)中浸泡最多14天，其中对PBS溶液中的Ag浓度进行定期抽样。图4示出了银从水凝胶中的累积释放。在研究的前48小时内可以观测到爆发释放，这占总共释放的AgNP的差不多50%。然而，在长达14天内可以观测到持续释放。[0295]2.4.复合超短肽水凝胶的抗微生物活性[0296]分别在以下三种不同的细菌菌株中通过纸片扩散法以及在悬浮培养物中研究Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶的抗微生物活性:大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌。在最初的筛选中，将具有在ImM至l〇〇mM范围内的不同浓度的银离子的Ag-Ac-LK6-NHfjai胶纸片(每个纸片200μυ置于大肠杆菌覆盖的琼脂平板上，并且在24小时之后测量直径的增加。如所预期，观测到直径的浓度依赖性增加，然而，发现10mM的银足以通过直径的增加显示出可察觉的显著的杀灭作用。应记住，银纳米粒子具有潜在毒性，因此使用低浓度是优选的。基于此初始筛选，使用10mM的银浓度进行所有其它生物学研究。[0297]使用大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌覆盖的琼脂平板，按独立的一式三份进行纸片扩散测试。将水凝胶置于细菌菌苔之上并在37°C下孵育24小时。之后，用游标卡尺测量直径的增加并且与没有AgNP的Ac-LK6-NH2水凝胶纸片相比（图5B)。如图5A中所示，在24小时之后在Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶纸片周围形成透明圆，而对于没有AgNP的水凝胶没有发现杀灭。当比较基于AgNP的水凝胶在大肠杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌之间的杀灭效率时，惊人地注意到，对于绿脓杆菌观测到最高的效率，即最大的直径，该绿脓杆菌是已知对常见抗生素具有耐药性的一种细菌菌株，而大肠杆菌显示出最小的直径增加。所测试的细菌菌株中无一被Ac-LK6-NH2水凝胶对照杀灭，且因此，所用的Tris缓冲液看来对细菌没有影响。[0298]为了在悬液法中评估细菌生长抑制，进行0D测量。为了这个目的，将24孔板用400μL的Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶包被并固化过夜。同时，制备没有银的Ac-LK6-NH2水凝胶作为对照。在使水凝胶经受UV光以形成AgNP之后，将具有约0.07的初始0D值的400yL细菌溶液添加到水凝胶之上。使用l〇yg/mL和20yg/mL最终浓度的四环素抗生素作为阳性对照。不含AgNP的Ac-LK6-NH2水凝胶和只有细菌的溶液用作阴性对照。在24小时孵育之后，测定最终的0D值并且测量的结果可见于图6中。在所有三种细菌样品中，对于经过Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶处理的样品发现0D小于起始值，这证实了Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶不仅能够抑制细菌生长，而且还能够杀灭细菌。相比之下，当与未处理的细菌样品相比时，Ac-LK6-NH2水凝胶单独仅显示出小的生长抑制。有趣的是，四环素对照在大肠杆菌中显示出与Ag-Ac-LK6-NH^jai胶相似的活性，但是在金黄色葡萄球菌中不那么有效。在绿脓杆菌中，观测到Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶与四环素对照之间的最大差异，其中四环素与未处理的对照相比仅显示出约50%的生长抑制，而Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶能够降低起始OD值。[0299]2.5生物相容性[0300]在24孔跨孔板中，使用跨孔中100yL的凝胶和周边孔中400yL的培养基进行生物相容性研究。在24小时和48小时孵育之后测量细胞活力。使用没有银的Ac-LK6-NH2水凝胶、1%琼脂、空的跨孔以及未处理的细胞作为对照并且存活率表现为针对未处理的细胞归一化的百分比（图7A)。[0301]在24小时孵育之后，与未处理的细胞相比，对于含有具有水凝胶的跨孔的所有样品均发现活力降低约20%，而与凝胶类型无关。在48小时孵育之后发现类似的结果，其中与未处理的细胞相比，在跨孔中容纳水凝胶的所有样品均显示出降低了20%的活力。然而，必须指出的是，所抽样的Ag-Ac-LK6-NH2水凝胶显示出与含有对照样品的所有其它水凝胶相似的降低的活力。为了验证降低的细胞活力是因为细胞死亡，在48小时孵育之后记录活/死图像(图7B-D)。荧光图像的叠加没有显示出水凝胶样品在与未处理的对照相比时增加的死细胞量，这表明降低的活力不是因为凝胶的毒性，而是因为环境的变化(跨孔对比无跨孔）。[0302]应用[0303]所公开的水凝胶可以包含金属纳米粒子和至少一种肽。[0304]所公开的水凝胶可以由一种或多种肽在水中或生理相关缓冲液中自组装而形成。[0305]所公开的水凝胶可以显示出优越的机械强度。金属纳米粒子可以使水凝胶的纤维结构稳定，因此需要降低浓度的一种或多种肽，这成本显著更高。因此，所公开的水凝胶可以具有成本效益。[0306]所公开的用于所公开的水凝胶的生产方法是简单的并且不需要大量的化学修饰。[0307]所公开的水凝胶可在多于10天内具有持续的抗微生物活性，能够在持续的时间内为细胞再生提供湿润的环境，并且不具粘着性。[0308]所公开的水凝胶可以是方便使用者使用的并且可以降低的更换伤口敷料的频率容易地施用于别扭的或不平坦的位置上。[0309]很明显的是，本领域技术人员在阅读了上述公开内容之后将显而易知本发明的各种其它修改和改动，而不脱离本发明的精神和范围，并且所有这些修改和改动意图落入所附权利要求书的范围内。[0310]参考文献[0311]AdhikariB,BanerjeeA.Short-Peptide-BasedHydrogel:ATemplatefortheInSituSynthesisofFluorescentSilverNanoclustersbyUsingSunlight(基于短肽的水凝胶：通过使用阳光原位合成焚光银纳米团簇的模板），Chemistry-AEuropeanJournal.2010;16:13698-705。[0312]AltV，BechertT，SteinriickeP，WagenerM，SeidelP，DingeldeinE等，Aninvitroassessmentoftheantibacterialpropertiesandcytotoxicityofnanoparticulatesilverbonecement(对纳米粒子银骨接合剂的抗细菌特性和细胞毒性的体外评估），Biomaterials.2004;25:4383-91。[0313]Brandt0，MildnerM，EggerAE，GroesslΜ，RixU，PoschΜ等，Nanoscalicsilverpossessesbroad-spectrumantimicrobialactivitiesandexhibitsfewertoxicologicalsideeffectsthansilversulfadiazine(纳米级银具有广谱抗微生物活性并且表现出少于磺胺喃啶银的毒理学副作用），Nanomedicine:nanotechnology，biology,andmedicine.2012；8:478-88〇[0314]FullenkampDE，RiveraJG，GongY_k，LauKHA，HeL，VarshneyR等，Mussel-inspiredsilver-releasingantibacterialhydrogels(贻贝启发的释放银的抗细菌性水凝胶），Biomaterials·2012;33:3783-91。[0315]HauserCAE，DengR，MishraA，LooY，KhoeU，ZhuangF等，Naturaltri-tohexapeptidesself-assembleinwatertoamyloidP-typefiberaggregatesbyunexpecteda-helicalintermediatestructures(天然的三肽至六肽在水中通过出乎意料的α-螺旋中间结构自组装成淀粉样蛋白β型纤维集合体），ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2011；108:1361-6〇[0316]KimJS，KukE，YuKN，KimJ_H，ParkSJ，LeeHJ等，Antimicrobialeffectsofsilvernanoparticles(银纳米粒子的抗微生物作用），Nanomedicine:nanotechnology，biology，andmedicine.2007;3:95-101。[0317]KlasenHJ.Historicalreviewoftheuseofsilverinthetreatmentofburns(银在治疗烧伤中的用途的历史综述），I.Earlyuses(I.早期用途）.Burns.2000;26:117-30〇[0318]KlasenHJ.Ahistoricalreviewoftheuseofsilverinthetreatmentofburns(银在治疗烧伤中的用途的历史综述），II.Renewedinterestforsilver(II.对银的再度关注）.Burns.2000;26:131-8。[0319]LakshmananA,CheongDff,AccardoA，DiFabrizioE,RiekelC，HauserCAE.Aliphaticpeptidesshowsimilarself-assemblytoamyloidcoresequences,challengingtheimportanceofaromaticinteractionsinamyloidosis(月旨方矣月太显亦出与淀粉样蛋白核心序列相似的自组装，挑战了芳族相互作用在淀粉样变性中的重要性），ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2013；110:519-24〇[0320]LeaperDJ.Silverdressings:theirroleinwoundmanagement(银敷料：在伤口处理中的作用），InternationalWoundJournal.2006;3:282_94〇[0321]Martinez-GutierrezF，01ivePL，BanuelosA，0rrantiaE，NinoN，SanchezEM等，Synthesis，characterization，andevaluationofantimicrobialandcytotoxiceffectofsilverandtitaniumnanoparticles(银纳米粒子和钦纳米粒子的合成、表征以及对抗微生物和细胞毒性作用的评价），Nanomedicine:nanotechnology，biology，andmedicine.2010；6:681-8〇[0322]Martinez-GutierrezF，ThiEP,SilvermanJM，deOliveiraCC，SvenssonSL，HoekAV等，Antibacterialactivity,inflammatoryresponse,coagulationandcytotoxicityeffectsofsilvernanoparticles(银纳米粒子的抗细菌活性、炎症反应、凝血以及细胞毒性作用），Nanomedicine:nanotechnology，biology，andmedicine·2012;8:328-36。[0323]MishraA，LooY，DengR，ChuahYJ，HeeHT，YingJY等，Ultrasmallnaturalpeptidesself-assembletostrongtemperature-resistanthelicalfibersinscaffoldssuitablefortissueengineering(超小天然肽在适用于组织工程化的支架中自组装成强耐高温性螺旋状纤维），NanoToday.2011;6:232-9。[0324]MuraliMohanY,VimalaK,ThomasV,VaraprasadK,SreedharB,BajpaiSK等，Controllingofsilvernanoparticlesstructurebyhydrogelnetworks(通过水凝胶网络控制银纳米粒子结构），JournalofColloidandInterfaceScience.2010;342:73_82〇[0325]RoyS,BanerjeeA.Aminoacidbasedsmarthydrogel:formation,characterizationandfluorescencepropertiesofsilvernanoclusterswithinthehydroge1matrix(基于氨基酸的智能水凝胶:水凝胶基质内银纳米团簇的形成、表征以及荧光特性），SoftMatter·2011;7:5300-8〇[0326]RujitanarojP-〇,PimphaN,SupapholP.Wound-dressingmaterialswithantibacterialactivityfromelectrospungelatinfibermatscontainingsilvernanoparticles(由含有银纳米粒子的电纺明胶纤维垫制成的具有抗细菌活性的伤口敷料），Polymer·2008;49:4723-32〇[0327]VaraprasadK，MohanYM，RavindraS，ReddyNN，VimalaK，MonikaK等，Hydrogel-silvernanoparticlecomposites:Anewgenerationofantimicrobials(7K凝胶-银纳米粒子复合材料：新一代的抗微生物剂），JournalofAppliedPolymerScience.2010;115:1199-207。[0328]VimalaK，MohanYM，SivuduKS，VaraprasadK，RavindraS，ReddyNN等，Fabricationofporouschitosanfilmsimpregnatedwithsilvernanoparticles:Afacileapproachforsuperiorantibacterialapplication(浸渍有银纳米粒子的多孔壳聚糖膜的制造：用于优越的抗细菌应用的简便方法），ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces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1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶。36.-种伤口敷料或伤口愈合剂，其包含根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶，所述伤口敷料或伤口愈合剂优选地用于预防微生物感染和/或微生物生物膜的形成。37.-种药物组合物或化妆品组合物，其包含根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶。38.根据权利要求37所述的药物组合物或化妆品组合物，其中所述药物或化妆品组合物是以局部凝胶或乳膏剂、喷雾剂、粉剂、或薄片、贴剂或膜的形式提供的。39.根据权利要求37所述的药物组合物或化妆品组合物，其中所述药物或化妆品组合物是以注射溶液的形式提供的。40.根据权利要求37至39中任一项所述的药物或化妆品组合物，所述药物或化妆品组合物进一步包含药学活性化合物和/或药学上可接受的载体。41.一种治疗感染性疾病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的人或受试者施用有效量的根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶或根据权利要求37至39中任一项所述的药物组合物，其中优选地，所述感染性疾病是由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母或真菌所引起。42.-种治疗伤口和用于伤口愈合的方法，所述方法包括以下步骤：向伤口施用有效量的根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶或根据权利要求37至39中任一项所述的药物组合物。43.-种生物成像装置，其包含根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶以供体外和/或体内使用，优选地用于口服施用、用于注射和/或用于局部施用。44.根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶用于制造用于治疗感染性疾病的药物的用途。45.根据权利要求1至24和32中任一项所述的含有纳米粒子的水凝胶用于制造用于治疗伤口和/或用于伤口愈合的药物的用途。46.-种试剂盒，其包含(i)至少一种如权利要求1以及5至24中任一项中所限定的肽所述肽任选地处于水溶液中；(ii)金属纳米粒子的前体，优选地金属盐溶液(如AgN03);(iii)有关凝胶形成以获得肽水凝胶以及有关对由此得到的肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；(iv)任选的赋形剂。47.-种试剂盒，其包含(i)由至少一种如权利要求1以及5至24中任一项中所限定的肽获得的水凝胶，所述水凝胶优选地处于免受辐射的容器中；(ii)金属纳米粒子的前体，优选地金属盐溶液(如AgN03);(iii)有关对所述肽水凝胶进行辐照以获得含有纳米粒子的水凝胶的说明书；(iv)任选的赋形剂。【文档编号】C07K7/06GK105828838SQ201480070013【公开日】2016年8月3日【申请日】2014年10月20日【发明人】夏洛特·A·E·豪泽尔,陈加敏,M·R·赖特霍费尔【申请人】新加坡科技研究局