Sweepoviruses病毒实时荧光定量PCR检测的通用引物、探针及其检测方法与流程

本发明涉及生物工程
技术领域：
中的病毒检测方法，具体涉及一种sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测的通用引物、探针及其检测方法和应用。
背景技术：
：菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)病毒属于双生病毒科(geminiviridae)，是一类重要的植物病毒。系统发育分析发现，侵染甘薯的begomovirus病毒明显与其它植物的病毒处于不同的分支，具有较大差异，因此被称为“sweepoviruses”。目前，侵染甘薯的sweepoviruses总共包括11个种，分别为：sweetpotatoleafcurlchinavirus(splccnv)、sweetpotatoleafcurlvirus(splcv)、sweetpotatoleafcurlgeorgiavirus(splcgv)、sweetpotatoleafcurlcanaryvirus(splccv)、sweetpotatoleafcurlsaopaulovirus(splcspv)、sweetpotatoleafcurlsouthcarolinavirus(splcscv)、sweetpotatoleafcurlugandavirus(splcuv)和sweetpotatomosaicvirus(spmv)、sweetpotatoleafcurlhenanvirus(splchnv)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus1(splcsiv1)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus2(splcsiv2)。研究表明，我国甘薯上的sweepoviruses至少有7个种，分别为：splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2。sweepoviruses是侵染甘薯的一类重要病毒，一般可引起11-86％的产量损失，对甘薯生产危害很大。目前对sweepoviruses尚无特别有效的化学防治方法，对这类病毒的早期检测和预警以及种植脱毒甘薯是防治sweepoviruses最有效的方法。在对病毒监测预警和培育脱毒甘薯的过程中，都需要对sweepoviruses病毒进行定量检测，只有尽早发现病毒或种植经过严格检测不含sweepoviruses病毒的种薯种苗才能有效控制病害的发生，否则会引起产量损失和病毒的流行和扩散蔓延。目前对sweepoviruses的检测主要采用普通pcr方法，但普通的pcr方法不能对病毒进行定量分析，而且灵敏度较低，容易引起漏检。实时荧光定量pcr(real-timefluorescentquantitativepcr)技术是一种新型核酸定性、定量技术，既有普通pcr灵敏快速的特点，又可实时监测，已应用于多种植物病毒的检测。但是目前尚无sweepoviruses实时荧光定量pcr检测方法的研究报道。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测的通用引物、探针及其检测方法和应用。该方法能够简便、快速、灵敏的对sweepoviruses病毒进行定量检测。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测的通用引物及探针，所述的引物包括上游引物spv-f和下游引物spv-r，其中spv-f的序列为5’-ccctacactgggaatgctgt-3’，spv-r的序列为5’-tgtgggacatccatcttgaa-3’；所述的探针为spv-probe，spv-probe的序列为5’-fam-atacctaaggggtgtgtgggtccctgt-bhq-3’。一种利用所述的通用引物及探针的sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测方法，具体为，提取待测样品的总dna，以总dna为模板，利用通用引物及探针进行实时荧光定量pcr扩增，根据扩增结果，判定样品是否感染sweepoviruses病毒。所述的实时荧光定量pcr的反应体系为20μl，包括：premixextaq(probeqpcr)10μl、roxreferencedyeii0.4μl、10μmol/lspv-f0.4μl、10μmol/lspv-r0.4μl、10μmol/lspv-probe0.6μl、模板2μl，余量为ddh2o。所述的实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性20s；95℃变性5s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环。所述的实时荧光定量pcr扩增反应后，得到的实时荧光定量pcr的标准曲线为y＝3.261x+40.967，扩增效率为102.603％，相关系数为0.999。一种所述的通用引物及探针在检测sweepoviruses病毒中的应用。一种所述的实时荧光定量pcr检测方法在检测sweepoviruses病毒中的应用。本发明的有益效果：1、本发明根据我国已报道的7种甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通过序列比对，在其相对保守区域设计一对通用引物和一条探针，并通过一系列条件的优化，建立了检测sweepoviruses病毒的实时荧光定量pcr检测方法。该方法检测的灵敏度高，最低可检测到2×100copies/μl，比常规pcr方法高出100倍。且该方法的特异性好，能够特异性检测出sweepoviruses，而对spvg、spcsv等甘薯病毒则无法检出。同时，该方法具有较好的重复性和稳定性。2、本发明建立了实时荧光定量pcr检测方法的标准曲线，该标准曲线为y＝3.261x+40.967，斜率为-3.261，扩增效率为102.603％，相关系数为0.999；该方法只能检测到目的病毒，能定量检测单个拷贝数的病毒，可作为sweepoviruses病毒互作机制研究的高效工具，具有较高的实用价值。3、本发明的实时荧光定量pcr检测方法可用于田间甘薯样品和脱毒甘薯种苗的检测，为加强sweepoviruses的早期监测预警和流行学研究以及脱毒甘薯质量检测提供了技术手段，对sweepoviruses的防控具有重要意义。附图说明图1为sweepoviruses实时荧光定量pcr上下游引物浓度筛选结果。其中，1-4分别为上下游引物终浓度0.2μmol/l、0.1μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l，5为空白对照。图2为sweepoviruses实时荧光定量pcr探针浓度筛选结果。其中，1-5分别为探针终浓度0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l，6为空白对照。图3为sweepoviruses实时荧光定量pcr退火温度的筛选结果。其中，a-d中的1分别为退火温度49℃、53℃、58℃、61℃，2为空白对照。图4为sweepoviruses实时荧光定量pcr扩增曲线。其中，1-10分别为模板浓度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11为空白对照。图5为sweepoviruses实时荧光定量pcr标准曲线。图6为sweepoviruses常规pcr灵敏度试验结果。其中，m为dl2000，1-10分别为模板浓度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11为空白对照。图7为sweepoviruses实时荧光定量pcr特异性检测结果。其中，1和8为splcgv重组质粒；2和7为splcv重组质粒；3为spvg重组质粒；4为spcsv重组质粒；5为空白对照，6为splccnv重组质粒；9为splccv重组质粒；10为splchnv重组质粒；11为splcsiv1重组质粒；12为splcsiv2重组质粒；13为空白对照。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实施步骤。实施例1、sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测方法的建立1材料与方法1.1材料重组质粒：含有splcgv(登录号为：kj013563)、spcsv(登录号为：kc888961)、spvg(登录号为：eu218531)、splccnv(登录号为：kj013576)、splcv(登录号为：kj013555)、splccv(登录号为：kx033435)、splchnv(登录号为：kj476507)、splcsiv1(登录号为：kj476511)、splcsiv2(登录号为：kj013574)全长基因组的重组质粒由河南省农科院植保所生物技术研究室构建并保存。上述重组质粒中，含有spcsv和spvg重组质粒是含有该病毒的外壳蛋白(cp)基因，其它病毒的重组质粒均为含有该病毒的全长基因组序列，所有重组质粒的克隆载体均为pmd19-t。1.2主要仪器实时荧光定量pcr仪为abi公司的7500型，紫外分光光度计为美国ge公司所生产的产品。1.3sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测方法的建立1.3.1引物和探针的设计根据我国已报道的7种甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通过序列比对，在其相对保守区域设计一对通用引物spv-f/spv-r和一条探针spv-probe，具体序列见表1。表1、引物和探针设计其中，f为上游引物，r为下游引物。1.3.2重组质粒标准品的制备选取含有splcgv全长基因组的重组质粒dna为模板，利用引物spv-f和spv-r进行普通pcr扩增，以此验证所设计引物正确性。结果显示，扩增片段约为155bp左右，与预期大小相符，所设计引物可以应用于实时荧光定量pcr。引物验证正确后，将含有splcgv全长基因组序列的重组质粒转化大肠杆菌tg1，以提取符合要求的阳性重组标准质粒。利用分光光度计对提取的含有splcgv全长基因组的重组质粒进行浓度测定，根据阿伏伽德罗常数将浓度转化为拷贝数。结果显示，所提取的重组质粒浓度为607ng/l，a260/a280比值为1.83，a260/a230比值为2.30，说明提取的质粒dna纯度符合实时荧光定量pcr标准品要求。根据阿伏伽德罗常数，换算成拷贝数为2×1011copies/μl。同时吸取10μl加入90μlddh2o对重组质粒进行10倍稀释。按照这个方法依次进行10倍稀释，得到系列10倍浓度差的重组质粒dna(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11)，选取2×109-2×100copies/μl10个梯度差的重组质粒作为实时荧光定量pcr的标准品和普通pcr的模板。1.3.3反应体系和反应条件的优化1.3.3.1引物和探针浓度的优化选取含有splcgv全长基因组的重组质粒dna(10-5)为模板，对反应体系进行优化，筛选引物浓度和探针浓度。筛选时，扩增反应选择premixextaqtm试剂盒(购自takara公司)中实时荧光定量pcr的标准体系，反应体系如下：采用单因素实验来筛选引物和探针的最佳浓度，其中引物终浓度在0.1-0.4μmol/l的范围以0.1μmol/l递增设置4个浓度梯度，探针在0.1-0.5μmol/l以0.1μmol/l递增设置5个浓度梯度。结果表明，当上下游引物终浓度为0.2μmol/l(图1、表2)，探针终浓度为0.3μmol/l(图2、表3)时实时荧光定量pcr能够检测到最小ct值和较高的荧光强度增加值，此时即为最佳浓度。表2、sweepoviruses实时荧光定量pcr上下游引物浓度筛选结果上下游引物终浓度方法ct值0.1μmol/l绝对定量法16.81380.2μmol/l绝对定量法12.48330.3μmol/l绝对定量法19.270710.4μmol/l绝对定量法22.40567表3、sweepoviruses实时荧光定量pcr探针浓度筛选结果探针终浓度方法ct值0.1μmol/l绝对定量法23.169610.2μmol/l绝对定量法22.985640.3μmol/l绝对定量法22.867790.4μmol/l绝对定量法23.047020.5μmol/l绝对定量法23.01476经过优化后的扩增反应体系为：1.3.3.2退火温度的优化获得最佳反应体系后，对退火温度进行优化，从49-61℃设置4个梯度处理，分别为49℃、53℃、58℃、61℃。采用三步法进行实时荧光定量pcr，即：阶段1：(1个循环)95℃预变性20s阶段2：(40个循环)95℃变性5s49-61℃设置4个梯度退火30s72℃延伸30s结果表明(图3、表4)，在58℃时能够检测到最小ct值，此时为最佳退火温度。表4、退火温度的筛选结果退火温度方法ct值49℃绝对定量法23.1696153℃绝对定量法22.9856458℃绝对定量法22.8677961℃绝对定量法23.04702经优化的反应程序为：95℃预变性20s；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s并收集荧光，反应共40个循环。1.3.4标准曲线的建立分别以稀释的10倍浓度梯度的标准质粒为模板，进行实时荧光定量pcr扩增。反应结束后，分别根据abi7500绘制的扩增曲线和标准曲线进行分析。结果表明，稀释10倍浓度梯度的模板均出现了扩增曲线。且模板浓度越高，ct值越小，模板浓度越低，ct值越大(图4)。根据实时荧光定量pcr仪自带软件绘制标准曲线，并进行数据分析，结果显示：所建立的sweepoviruses标准曲线方程为：y＝3.261x+40.967，斜率为-3.261，扩增效率为102.603％，相关系数为0.999(图5)。实施例2、sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测方法的验证2.1灵敏度检测将含有splcgv全长基因的重组质粒dna进行10倍梯度连续稀释，以10倍连续浓度梯度(2×109-2×100copies/μl)的重组质粒为模板，同时进行常规pcr与实时荧光定量pcr扩增。反应结束后，分别根据abi7500绘制的扩增曲线和经琼脂糖凝胶电泳分析的普通pcr结果进行灵敏度比较分析。普通pcr反应体系为：反应程序为：94℃预变性3mim；94℃变性3mim，58℃退火50s，72℃延伸30s，共35个循环；最后一个循环72℃补平10min。结果表明，所建立的实时荧光定量pcr在模板浓度稀释至2×100copies/μl时仍有荧光曲线(图4)，表明本发明建立的实时荧光定量pcr方法的检测灵敏度可达2×100copies/μl。但普通pcr只能检测到2×102copies/μl(图6)，表明本发明所建立sweepoviruses实时荧光定量pcr的灵敏度比普通pcr高出100倍。2.2特异性检测利用含有splcgv全长基因的重组质粒dna作为阳性对照，含有splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2、spcsv和spvg基因组序列的重组质粒作为检测对象，对所建立的实时荧光定量pcr方法的特异性进行检测。结果表明，以重组质粒spvg、spcsv为模板的实时荧光定量pcr未出现扩增曲线，以splcv、splccnv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2为模板的实时荧光定量pcr出现扩增曲线。表明本发明建立的检测方法可特异性检测sweepoviruses，而对spvg、spcsv等甘薯病毒则无法检出(图7)。2.3重复性检测从稀释的10个浓度梯度中挑选5个连续梯度模板(2×108-2×104copies/μl)，分别做3个平行重复对照，分别进行实时荧光定量pcr反应，进行重复性试验。结果显示(表5)，其ct值得变异系数为0.52-1.54％。对相同的模板，以相同的反应条件分别在不同次的试验中进行试验间重复，结果显示(表6)，其ct值得变异系数为0.54-1.28％。说明本发明建立的sweepoviruses实时荧光定量pcr方法的具有较好的重复性和稳定性。表5、实时荧光定量pcr方法检测splcgv的试验内重复结果表6、实时荧光定量pcr方法检测splcgv的试验间重复结果2.4实时荧光定量pcr产物的序列测定为验证本发明所建立的sweepoviruses实时荧光定量pcr检测方法所扩增到的产物为目的片段，随机将部分实时荧光定量pcr扩增产物进行回收和序列测定。利用blast对所测序列与genbank中登录的sweepoviruses病毒序列进行比较分析。结果表明，经实时荧光定量pcr扩增的核苷酸序列与genbank中登陆的所有sweepoviruses病毒的核苷酸序列一致性均在91％以上，说明扩增出的片段均为目的片段。2.5实时荧光定量pcr检测方法的应用从田间采集15块疑似感染双生病毒的植株所结数块，提取总dna作为模板，同时分别利用普通pcr和实时荧光定量pcr进行扩增，检测薯块带毒情况。结果表明(表7)，15份样品中sweepoviruses的检出率为100％，与普通pcr结果一致。表7、2种检测方法结果的比较以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>河南省农业科学院植物保护研究所<120>sweepoviruses病毒实时荧光定量pcr检测的通用引物、探针及其检测方法<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ccctacactgggaatgctgt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tgtgggacatccatcttgaa20<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3atacctaaggggtgtgtgggtccctgt27当前第1页12