一种燕麦花叶病毒的实时荧光RT‑PCR检测方法、引物和探针及试剂盒与流程

本发明涉及生物物种分子诊断领域，具体地说，涉及一种燕麦花叶病毒的实时荧光rt-pcr检测方法、引物和探针及试剂盒。
背景技术：
：燕麦花叶病毒(oatmosaicvirus，omv)为马铃薯y病毒科(potyviridae)，大麦黄花叶病毒属(bymovirus)，为线状，常弯曲，无包膜，具有明显的形态长度，长约600～750nm，宽12～14nm。omv主要侵染燕麦属植物，引起秋季播种的燕麦发病，可以引起39～60％的减产。omv的传播主要依赖禾谷多粘菌以持久性方式传播，长距离扩散则随感病植株的无性繁殖材料传播。目前，omv主要分布于美国、加拿大、新西兰、英国、法国、爱尔兰等国，在我国尚未见发生，2007年农业部862号公文《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为重要的对外检疫性有害生物。因此，建立该病毒的快速检疫鉴定技术及相关检测标准具有非常重要的经济价值和社会价值。半个世纪来，现代病毒学研究水平不断提高，病毒的检测技术也在不断发展和改进。目前病毒的检测方法主要包括枯斑和指示植物检测法，酶标免疫吸附法(elisa)，电镜负染检测法，免疫电镜检测法，电镜超薄切片法以及pcr检测方法。血清学方法是目前普遍运用的常规检测方法，可操作性强，检测结果相对可靠。但是该方法依赖于高质量的抗血清，成本较高，周期性长，且灵敏度有限，难以检测含量很少的病毒。同时，燕麦花叶病毒所在的大麦黄花叶病毒属各个成员在血清学上密切相关，因而难以采用elisa方法来准确检测燕麦花叶病毒。pcr技术也是目前国内外植物病毒检测中应用较成功的方法。专利cn102102133a“棉花曲叶病毒检测用引物”公开了棉花曲叶病毒定性pcr检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种针对燕麦花叶病毒的特异性强、灵敏度高的实时荧光定量rt-pcr检测方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，针对omv的外壳蛋白基因(cpgene)设计一对特异性检测燕麦花叶病毒的引物和荧光探针，并优化反应体系和反应程序，建立了实时荧光rt-pcr快速检测omv病毒的方法。该方法具有很强的特异性，可以从大麦黄花叶病毒属中特异性检出omv病毒。该方法灵敏度高、特异性强、快速高效，检测结果准确可靠，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。为此，本发明所采用的技术方案是：一种用于燕麦花叶病毒的实时荧光rt-pcr检测的引物和探针，包括上游引物omv-f1、下游引物omv-r1和荧光探针omv-p，其序列分别如下：omv-f1：5′-acggttttcctcatcgggag-3′；(seqidno.1)omv-r1：5′-tcatccaaggacgagggaca-3′；(seqidno.2)omv-p：5′-fam-tcaaacgaatatgcagggttgaca-bhq1-3′。(seqidno.3)一种燕麦花叶病毒的实时荧光rt-pcr检测方法，包括使用以上所述引物和探针进行pcr扩增的步骤。进一步地，该检测方法包括以下步骤：s1、取待测样品提取植物组织总rna；s2、以总rna为模板，引入下游引物omv-r1进行反转录模板cdna的合成；s3、将上游引物omv-f1、下游引物omv-r1和荧光探针omv-p置于荧光定量pcr仪中进行实时定量荧光pcr扩增反应；s4、荧光pcr仪读取ct值判断检测的结果。进一步地，所述步骤s2中进行反转录模板cdna的合成时，其反应体系为：反应条件为：37℃15min，85℃5s，16℃30s，反应结束后将模板于-4℃保存备用。进一步地，所述dntp的浓度为10mmol/l，所述下游引物omv-r1的浓度为10μmol/l。进一步地，所述步骤s3中实时定量荧光pcr反应体系为：反应条件为：95℃，30s；95℃5s，60℃30s，45个循环。进一步地，所述上游引物omv-f1和下游引物omv-r1的浓度均为10μmol/l，所述荧光探针omv-p的浓度为10μmol/l。一种燕麦花叶病毒的实时荧光rt-pcr检测试剂盒，包含以上所述的引物和探针。本发明的有益效果是：本发明针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒，设计了特异性引物和荧光探针，建立了实时定量荧光rt-pcr快速检测omv的方法，具有检测方法简单(全程闭管、无需电泳检测)、速度快定量准确、特异性强、灵敏度高等优点，减少了有毒试剂的接触，检测时间也缩减到2小时之内，极大的提高了效率。整个过程采用荧光信号放大及计算机全程控制，减少人为误差，提高了灵敏度，适用于我国各大检验检疫机构针对检疫性有害生物燕麦花叶病毒的检疫鉴定。附图说明图1是实施例实时定量荧光rt-pcr检测omv的结果分析示意图；图2是实施例实时定量荧光rt-pcr检测omv灵敏度的动力学曲线；图3是实施例实时定量荧光rt-pcr检测omv灵敏度的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例一、选择供试验材料。采用的供试验的病毒样品见表1。表1供试验病毒样品中文名英文名燕麦花叶病毒oatmosaicvirus，omv大麦黄花叶病毒barleyyellowmosaicvirus，bymv大麦和性花叶病毒barleymildmosaicvirus，bammv小麦黄花叶病毒wheatyellowmosaicvirus，wymv小麦梭条斑花叶病毒wheatspindlestreakmosaicvirus，wssmv水稻坏死花叶病毒ricenecrosismosaicvirus，rnmv本实施例使用到的主要试剂和仪器如下：荧光pcr扩增试剂由珠海宝锐生物科技有限公司提供；rna提取试剂盒、反转录试剂盒、引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司提供；其他试剂按普通分子生物学实验操作规定。荧光pcr仪：罗氏lightcycler480荧光定量pcr仪；台式高速离心机eppendorf5415d。二、取待测样品提取植物组织总rna。采用液氮进行供试样品的前处理，植物总rna提取按照试剂盒(takaracode:d9108a)方法，操作步骤如下：1、于冰箱中取冷冻样品置于预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉末状；2、迅速将粉末状样品转移至2ml离心管中，加入1mlrnaisoplus，剧烈振荡混匀，直至样品呈匀浆状，室温静置5min；3、12000g，4℃离心5min；4、小心吸取上清(1ml)，转移至新的2ml离心管中；5、向上述溶液中加入1/5体积的氯仿(200μl)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min；6、12000g，4℃离心15min；7、从离心机中小心取出离心管，此时溶液分三层，小心吸取上层清液(400μl)，转移至新的2ml离心管中；8、向上述清液中加入等体积(400μl)的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置10min；9、12000g，4℃离心10min，此时管底有白色沉淀；10、小心地弃去上清，沿离心管管壁缓慢加入1ml预冷的75％乙醇，切勿碰触到沉淀，轻轻地上下颠倒离心管洗涤沉淀；11、12000g，4℃离心5min，小心地弃去乙醇，保留沉淀；12、室温状态下干燥10min左右；13、待乙醇充分晾干之后，向离心管中加入60μl，rnase-freeh2o溶解沉淀；14、溶解后的rna保存于-20℃冰箱，备用。三、根据genbank中已登录的omv的核苷酸序列，利用dnastar软件包primerselect设计引物和探针。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物和荧光探针的相关信息如表2。表2特异性引物和探针四、以总rna为模板，引入所述下游引物omv-r1进行反转录模板cdna的合成。以总rna为模板，以下游引物omv-r1作引物反转录合成cdna，0.2mlpcr管中加入：反应条件为：37℃15min，85℃5s，16℃30s，反应结束后将模板于-4℃保存备用。五、将上游引物omv-f1、下游引物omv-r1和荧光探针omv-p置于荧光定量pcr仪中进行实时定量荧光pcr扩增反应。其反应体系为：反应条件为：95℃，30s；95℃5s，60℃30s，45个循环。1、用试验建立的荧光pcr技术对大麦黄花叶病毒属与omv同源性高的5种病毒(即表1的病毒)进行特异性检测。2、灵敏度检测将反转录的omv阳性样品产物cdna，分别稀释1倍、10倍、102倍、103倍、104倍，加入到荧光pcr反应体系中，进行灵敏度检测，每个梯度做两个重复。六、pcr反应结束后，通过收集的荧光曲线及ct值与已知标准曲线ct值比较，判断结果。七、结果与分析。1、特异性验证对表1中的样品进行荧光pcr反应，检测引物和探针的特异性。结果如图1所示，omv病毒有特异性扩增，ct值在20～22之间，其他几种病毒全部没有荧光信号，表明该试验采用的这组引物具有很强的特异性。2、灵敏度检测实时荧光pcr灵敏度检测结果见图2和图3，图2是灵敏度的动力学曲线，图3是灵敏度的标准曲线，图2中，1-2：omv病毒1倍稀释液(100ng/μl)；3-4：10倍稀释液；5-6：102倍稀释液；7-8：103倍稀释液；9-10：104倍稀释液。omv阳性检测样品的所有测试浓度都检测到现荧光信号，ct值与dna模板浓度相关，模板浓度为1倍、10倍、102倍、103倍、104倍稀释液时，扩增的ct值分别为21.3、24.1、27.2、30.3、33.4。在104倍稀释液下荧光pcr扩增曲线明显，两个平行样间的ct值分别为33.66和33.49，体现了良好重复性，表明该方法的检测限度在104倍稀释液的浓度以下。本发明针对omv的外壳蛋白基因设计一对特异性检测燕麦花叶病毒的引物和荧光探针，并优化反应体系和反应程序，建立了实时荧光rt-pcr检测omv病毒的方法。特异性测试结果表明该方法具有很强的特异性，可以从大麦黄花叶病毒属中特异性检出omv病毒。该方法灵敏性远高于常规rt-pcr方法的检测结果，同时大大缩短了检测时间，检测结果准确可靠。具有准确灵敏，时效性强，成本较低，检测范围广的特点，非常适合在检验检疫口岸的推广应用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。sequencelisting<110>珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>一种燕麦花叶病毒的实时荧光rt-pcr检测方法、引物和探针及试剂盒<130><160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1acggttttcctcatcgggag20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcatccaaggacgagggaca20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tcaaacgaatatgcagggttgaca24当前第1页12