一种樱桃病毒A荧光定量PCR检测的专用引物和方法与流程

本发明涉及植物病毒学领域，具体而言，涉及一种樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)荧光定量PCR检测的专用引物和方法。

背景技术：

樱桃是一种具有较高经济价值的水果，近年来随着种植面积的不断扩大，病毒病已成为限制其产量和质量提高的重要因素。樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)是一种能侵染樱桃、李子、杏等李属果树的潜隐性病毒，为乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)发形病毒属(Capillovirus)成员。CVA最早于1995年在德国南部的樱桃样品中被发现，在我国则最早于2007年在江苏省的杏树样品和云南省的樱桃样品中被相继发现。CVA侵染寄主植物能导致寄主果实产量和品质的降低，但是作为一种潜隐性病毒，其侵染寄主植物后没有明显的症状表现，给该病毒的早期诊断带来较大的困难。与此同时，CVA常与樱桃小果病毒(Little cherry virus,LChV)伴随发生，关于其病毒与病毒、病毒与植物互作机制的基础研究也逐渐受到重视。因此，有必要建立一种高效、灵敏的对CVA进行定量检测的方法。

技术实现要素：

本发明提出一种对樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)进行荧光定量PCR检测的方法及其专用引物，该检测方法可实现对供试果树样本材料中CVA基因组拷贝数的绝对定量。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种樱桃病毒A荧光定量PCR检测的专用引物，包括上游引物和下游引物，上游引物CVA-4F：5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’；

下游引物CVA-4B：5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’。

本发明还提出了一种樱桃病毒A荧光定量PCR检测的方法，包括以下步骤：

第一步，提取CVA毒源材料的总RNA，用随机引物反转录得到cDNA，以CVA-4F和CVA-4B为引物进行PCR扩增，大小为205bp的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，连接克隆载体，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选并挑取含阳性克隆的大肠杆菌进行培养，提取质粒得到阳性质粒标准品；

第二步，阳性质粒标准品分别梯度稀释至不同浓度，以CVA-4F和CVA-4B为引物进行荧光定量PCR扩增，以Ct值为纵坐标，以质粒拷贝数为横坐标，绘制得到标准曲线；

第三步，提取待测样品的总RNA，以CVA-4B为引物反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，按照与步骤(2)中完全相同的条件进行荧光定量PCR扩增，所得Ct值代入标准曲线公式得到待测样品中CVA基因组RNA的含量。

优选的，在第一步中，阳性质粒标准品的制备，其PCR反应体系为：2×Ex Taq Mix 12.5μL，10μM CVA-4F和CVA-4B引物各1.0μL，模板2.0μL，双蒸水补足至25μL。

优选的，在第一步中，阳性质粒标准品的制备，其PCR反应程序为：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，共35个循环；72℃ 10min。

优选的，在第二步中，绘制标准曲线时根据公式：拷贝数(copy/μL)＝(浓度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(质粒碱基数×660)，将质粒标准品依次稀释至10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL共5个浓度。

优选的，在第二步中，绘制标准曲线和检测待测样品时的荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL，10μM CVA-4F和CVA-4B各1.4μL，模板1.0μL，双蒸水补足至20μL。

优选的，在第二步中，绘制标准曲线和检测待测样品时的荧光定量PCR反应程序为：95℃ 2min；95℃ 5s，58℃ 10s，共39个循环；由65℃至95℃，以每10s升温0.5℃读取荧光值得到溶解曲线。

本发明构建了对CVA进行定量检测的实时荧光PCR体系，该方法特异性强、灵敏度高，可对大量样品进行高通量的标准化操作。该方法应用于生产实际，可实现对果树苗木中CVA带毒情况的快速检测，对果树病毒病的防控，进而提高产品产量和品质具有重要作用。同时，该方法也可用于科研工作，对探索CVA与其它果树病毒的互作机制、致病机理等学术问题具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对实施例中所需要使用的附图作如下说明：

图1为本发明实施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同浓度质粒标准品为模板扩增获得的标准曲线。

图2为本发明实施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同浓度质粒标准品为模板扩增的扩增曲线。

图3为本发明实施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同浓度质粒标准品为模板扩增的溶解曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1.引物合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物CVA-4F(5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’)和CVA-4B(5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’)，用双蒸水溶解至10μM备用。

2.质粒标准品构建

2.1.感染CVA的樱桃枝条样品采自辽宁省兴城市。使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN,DP140916)提取样品总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。

2.2.使用随机引物反转录，反转录酶购自Promega，具体步骤如下：

70℃水浴5min，冰置5min，加入下列成分：

37℃反应1h，95℃灭活5min，得到的cDNA；

2.3.以cDNA为模板，以CVA-4F和CVA-4B为引物进行PCR扩增，所使用的Ex Taq Mix购自康为世纪，反应体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃补充延伸10min。

2.4.PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中145V恒压电泳15min，凝胶在EB染液中染色5min后用紫外凝胶成像系统成像拍照；用洁净刀片割下大小约为200bp的产物，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN,DP209)纯化回收目标产物，具体方法参照说明书；回收片段连接pGEM-T easy(Promega)克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(康为世纪)，在含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选得到阳性克隆，具体方法参照相关说明书；经PCR验证阳性的单克隆菌落扩大培养后，使用质粒小提试剂盒(TIANGEN,DP103)提取质粒得到阳性质粒标准品；测定质粒浓度为262ng/μL。

2.5.为确保本方法的准确性，重组阳性质粒委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司，使用通用引物M13F/M13R对插入片段进行DNA测序，测序结果如SEQ ID NO:1。将该序列与GenBank数据库中的已有序列进行在线BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果表明插入片段确为CVA基因组片段，其与GenBank中已提交的CVA序列一致性为91.7％(KT310083)～95.1％(KU215411)：

TCACATTATCAGAGAACCAGAGAGCCGTGAAGAACACCATCAGGAATTACTACCTGAGGATAATGTTTGGGAATCTTGCGGTGATGGGAACAAGCGAGCAGACAGACTACCCAGGAGAGCATCTAGCGATTCCGAGACCAGTAATAGAGAATCAGGAGGCTCTGACTGCACATCTCCCAGCAGGCATGTCATTATTAACTTTTGC

3.标准曲线绘制

3.1.参照公式：拷贝数(copy/μL)＝(浓度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(质粒碱基数×660)，将262ng/μL的质粒标准品稀释至10⁸copy/μL，其中质粒碱基数为3220，即1μL质粒标准品加741.2μL双蒸水，再将10⁸copy/μL的质粒标准品依次稀释至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL。

3.2.分别以各浓度的质粒标准品为模板，使用Quant One Step RT-qPCR Kit(SYBR Green)试剂盒(TIANGEN,FP303)进行荧光定量PCR，反应体系如下：

使用Bio-Rad iQ^TM5实时荧光定量PCR仪按如下反应程序进行：95℃ 2min；95℃ 5s,58℃ 10s,Read,39cycle；65℃ to 95℃,0.5℃/10s read。程序运行结束后由软件自动生成标准曲线：Y＝-3.511×log(X)+42.507，R²＝0.995

4.待测植物材料的定量检测

待测樱桃枝条样品采自辽宁省葫芦岛市兴城市，按照上述方法提取样品总RNA，随机引物反转录得到cDNA，以cDNA为模板，CVA-4F和CVA-4B为引物，完全按照上述体系和程序进行荧光定量PCR扩增，同时分别设置健康樱桃样品、无菌双蒸水作为阴性对照，确保检测结果的准确性。5份待测样品Ct值为20.74～24.30，代入上述标准曲线公式，得到待测样品CVA拷贝数为1.54×10⁵～1.59×10⁶copy/μL。阴性对照样品均未出现扩增曲线和溶解峰。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种樱桃病毒A荧光定量PCR检测的专用引物和方法

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 樱桃病毒A荧光定量PCR检测上游引物

<400> 1

TCACATTATC AGAGAACCAG AG 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 樱桃病毒A荧光定量PCR检测下游引物

<400> 2

GCAAAAGTTA ATAATGACAT GCC 23