专利名称：实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，特别是用于猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测，属于生物技术领域。
背景技术：
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)是一种能够引起猪多发性衆膜炎、关节炎、耳炎、肺炎等病症的致病性支原体。猪鼻支原体不仅在猪群中普遍存在，同时也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。作为一种常见病原菌，猪鼻支原体通常由母猪或大猪传染给小猪。已有研究者证实了能从10%母猪和30% 40%断奶仔猪的鼻腔分泌物中分离出该支原体。一旦感染，该支原体在上呼吸道迅速传播并且能从感染猪的肺脏和鼻咽管中分离到。在英国和美国的慢性猪肺炎案例中，50%以上都能检测到猪鼻支原体的存在；同时在地方性肺炎暴发群中几乎每次都能够分离到猪鼻支原体。从捷克斯洛伐克、丹麦、德国和英 国分离出的几株猪鼻支原体通过呼吸道途径能诱发猪肺炎。猪鼻支原体的三株捷克斯洛伐克分离物和一株英国分离物，可诱导无菌小猪发生肺炎。国内宁夏农学院曾以两株疑似猪鼻支原体(宁农3和宁农5)培养物滴鼻接种小猪，诱发轻度肺炎。台湾林俊宏用猪鼻支原体分离株ATIT-1、3、7混合物气管内注射可以诱发部分攻毒猪发生典型的猪支原体肺炎病变，并成功从大部分攻毒猪肺中分离到猪鼻支原体。另外，研究表明，猪鼻支原体与人类的肿瘤发生有关。迄今为止，对猪鼻支原体的检测方法有培养法、血清学检测方法等，而对猪鼻支原体检测主要以分离培养为主,所需要的时间较长,亟需建立一种敏感性高的、快速的、等量的分子生物学检测方法。本发明提供了猪鼻支原体实时荧光定量PCR的引物和探针，有助于快速、定量诊断猪鼻支原体的感染。
发明内容
技术问题本发明的目的是为了克服现有的以分离培养为主对猪鼻支原体检测的时间长、无法准确定量的缺陷，提供一种能快速、灵敏、准确、定量检测猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测方法。技术方案—种快速检测猪鼻支原体的荧光定量PCR引物和探针，引物1:P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3'引物2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3'分子信标探针5，-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，检测过程中PCR扩增反应体系为无菌双蒸水8μ12Χ反应预混液(.含Taq廳、dNTP及缓冲液)P
20μΜ 引物 IΙμ
20μΜ 引物 2Ιμ
20μΜ分f信标探针Ιμ
校正染料Rox0.5 μ
标准阳性模板ρΜ-Ρ37或样品模板DNAΙμ 反应条件为95 V预处理IOmin,进行40个循环反应，每个循环反应包括 950C 15s，53。。lmin，于 53°C 时测定荧光值。用所述的引物对和分子信标探针可以制备猪鼻支原体的荧光定量PCR检测试剂盒。有益效果本发明与现有技术相比具有以下优点和效果I、定量准确；2、检测速度快，仅I小时，加上DNA提取的制备，共仅需3_4h ；3、步骤简单；4、可同时进行高通量的样品检测。在本发明提供检测猪鼻支原体荧光定量PCR的引物和探针，将其用于猪鼻支原体定量检测，建立了检测猪鼻支原体荧光定量PCR的方法，该方法的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，完全可以满足快速鉴定诊断猪鼻支原体的要求。
图I不同拷贝数阳性质粒荧光PCR扩增的动力学曲线。分别以模板数为I. OXlO8-L OXlO1拷贝/ml及水为阴性对照进行Taqman PCR分析。图2显示猪鼻支原体荧光定量PCR的标准曲线。针对模板数为I. OX IO8-L OX IO1拷贝/ml的反应体系进行Taqman PCR分析。当猪鼻支原体个数为I. O X IO1时，检测样品的Ct值为34左右，即检测下限灵敏度可达I. OX IO1拷贝/ml。绘制得到的标准曲线的斜 率为-3. 121，在Y轴截距为38. 243，相关系数R2=O. 999。
具体实施例方式试剂包括a) DNA裂解液，b) Taq DNA聚合酶，c)标准阳性模板，d)荧光定量反应液，其特征是荧光定量反应液中含有引物和荧光探针，引物为正向引物(SEQ ID N01)5，-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3’，和反向引物(SEQ ID NO: 2)，5’ -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3’，荧光探针(SEQ ID NO. 3)序列为 5，-ATCAGCAACAAAACCTT-3，，荧光探针 5，端标记FAM (荧光报告基因)，3’端标记MGB基因(荧光淬灭基团)，标准阳性模板pM_P37 (SEQ IDNO:4)是含有猪鼻支原体P37蛋白基因的1212个核苷酸片段构成的pMD18_T(购于Takara公司)可在大肠杆菌Trans5 α (购于Takara公司)中增殖。贮存浓度为IX 101°拷贝/ μ 1，使用前系列稀释。实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒ΡΜ-Ρ37，该质粒转化大肠杆菌Trans5 α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A26tl(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至I X IOltl拷贝/ μ 1，-20°C保存。在制作标准曲线时，所使用的标准阳性模板pM_P37 DNA(SEQ ID NO:4)为5’ -ttgctcaaaaaatttaaaaattttattctattttcatctatattttcgccaatagcatttgctatatcatgttctaatacaggagtagtcaagcaagaggatgtatcagttagtcaaggtcaatgagataaaagtataacatttggtgtttcagaagcttggttaaacaagaaaaaaggaggtaaagaagttaacaaagaagttattaatacatttttagaaaatttcaaaaaagaatttaataaactcaaaaatgcaaatgataaaaccaaaaacttcgatgacgttgattttaaagtaactccaattcaagactttactgtgttgttaaacaatttatctactgacaatcctgaattagattttggaattaatgcttcaggaaaattggtagaatttctaaaaaataatcctggtataataactccagcattagaaacaacaactaattcttttgtatttgacaaagaaaaagataaaatttatgttgatggtacagattcagatccacttgtaaaaattgctaaagaaattaataaaatttttgttgaaactccatatgcaagttgaactgatgaaaatcataagtgaaatggtaatgtttatcaaagtgtttacgatccaactgttcaagctaatttttatagaggaatgatttgaataaaaggtaatgatgaaactctagctaaaattaaaaaagcttgaaatgataaagattgaaatacatttagaaattttggaattttacacggtaaagataattcttcttctaaattcaagttagaagaaactatattaaaaaaccactttcaaaataaatttacaacactaaatgaagacagaagcgcacatccaaacgcatataaacaaaaatctgcagatacattgggaactttagatgatttccatattgctttttcagaagaaggttcttttgcttgaacacataacaaatcagcaacaaaaccttttgaaactaaagcaaatgaaaagatggaagcacttatagtaactaatccaattccgtatgatgttggagtgtttagaaaaagtgttaaccaattagaacaaaatttaattgttcaaacattcattaatttagctaaaaataaacaagatacatatggtccacttttagggtataatggttataaaaaaattgacaatttccaaaaagagattgtagaagtttatgaaaaagccattaaataa-3’本发明中，荧光定量反应液由正向引物和反向引物，荧光探针，荧光定量PCR反应预混液及无菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，2倍荧光定量PCR反应预混液(含Taq酶、dNTP及缓冲液)(Takara公司)12. 5 μ 1，20 μ mol/L正向引物和反向引物各1μ l,20ymol/L荧光探针I μ 1，O. 5 μ I校正染料ROX和8 μ I无菌水组成，最后加入I μ I的样品DNA的模板进行反应，其中荧光探针为SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记FAM，3’端标记MGB。使用DA7600、ABI7500型等其他结构类型的自动荧光检测热循环仪上对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件为95°C预处理lOmin，进行40个循环反应，每个循环反应包括95°C 15s，53°C lmin，于53°C时测定荧光值。反应完成后，借助装置上配置的自动分析系统分析结果。在本研究中，如果循环阈值(Ct)等于或大于38，结果即为阴性；如果Ct值小于38，结果则为阳性。其中以反应的前5-10个循环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置为3-8个循环的荧光信号的标准差的10倍。
在本发明提供猪鼻支原体快速定量检测猪鼻支原体荧光定量PCR方法中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因荧光共振能量转移而被3’端淬灭基因淬灭，因而体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针和模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’ -3’外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两个基团之间的荧光共振能量转移，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对猪鼻支原体的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，反之，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。本发明的猪鼻支原体荧光定量PCR检测方法，主要包括下列步骤I)制备标准阳性质粒，并用紫外分光光度计定量；2)提取猪鼻支原体样品的DNA，低温保存备用；3)分别取2)步中的DNA和同样量的系列稀释的I)步中的阳性标准品加入到含Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量PCR检测；
4)通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。用本发明中提供的引物和探针制备的猪鼻支原体荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒可对猪鼻支原体进行定量检测。实施例I :猪鼻支原体荧光定量PCR检测方法的建立I.提取江苏某猪场猪肺组织分离培养猪鼻支原体阳性样品的DNA及标准阳性模板PM-37DNA，低温保存备用；本发明使用的猪鼻支原体样品的DNA，可按常规方法提取，具体方法是在提取含有猪鼻支原体的猪肺组织后再按下述步骤进行I)加IOOmg组织至600 μ I蛋白裂解液,再加入蛋白酶K3 μ I (20mgml),RNase抑制酶3 μ I (10mg/ml),混匀，55°C水浴2-3小时，期间振摇数次。2)力口等体积的酌·:氯仿:异戍醇(25 24 :1),轻振IOmin, I, 2000rpm离心5min。3)取上清(约 300 μ 1)，加氯仿 600 μ 1,1，2000rpm 离心 5min。4)取上清(约 200 μ 1)，加氯仿 600 μ 1,1，2000rpm 离心 5min。5)取上清(约200 μ I )，加2倍的无水乙醇，O. 4倍的5mol/L的醋酸铵，轻轻颠倒混匀，放置20min.6)1，2000rpm 离心 5min,弃上清，加入 70% 乙醇，洗 2 次(I, 2000rpm 离心 lmin)。7)加50 μ I的灭菌去离子水或者TE溶液。得本发明所需要使用的猪鼻支原体样品的DNA。2. PCR引物及探针查询分析国际上已报道的猪鼻支原体的核苷酸序列，选取猪鼻支原体Ρ37基因的保守序列作为PCR扩增的靶序列P37-F 5/ -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3'P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3'预期扩增产物为79bp。根据引物之间的序列设计合成了一条分子信标5，-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，，在其 5，端标记荧光染料 FAM，而 3，端则标记荧光淬灭剂MGB。3. PCR扩增反应反应体系为
无菌双蒸水8μ1
2 X反应预混液(含Taq酶、dNTP及缓冲液) 12.5μ1
引物 I (20μΜ)Ιμ 引物 2(20μΜ) Ιμ 分广信标探针(20μΜ) Ιμ
校」Π染料Rox0.5 μ
标准_性模板ρΜ-Ρ37或样品模板DNAIμ 反应条件为95 V预处理IOmin,进行40个循环反应，每个循环反应包括 950C 15s，53。。lmin，于 53°C 时测定荧光值。4.灵敏度实验将鉴定好的质粒，分光光度计测定其浓度，并计算出拷贝数，然后分别稀释成I. 0X108、1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷贝 / μ I浓度梯度，按上述PCR反应体系和反应程序在荧光定量PCR仪进行扩增，经计算机分析得出不同拷贝数的Ct值，根据Ct值以及相应拷贝数的对数做出标准曲线。检测结果表明，I. 0X108、1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷贝 / μ I的 Ct 值分别为 14. 45,17. 62,20. 88,23. 8,27. 95,30. 89,33. 95,37. 11，本发明方法的最低检测下限为10拷贝/ml (参见图I)。检测样品的猪鼻支原体含量为5 X IO4拷贝/ μ I。5.荧光PCR特异性试验分别以健康猪DNA、猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪絮状支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA及猪瘟病毒、猪流感病毒(逯晓敏等，猪肺炎支原体套式PCR检测方法的建立及应用，江苏农业学报，2010，26 (I ):91-95)的核酸样品为模板，在相同的条件下进行荧光定量PCR扩增，以检测分子信标与目的DNA结合的特异性。结果表明，除猪鼻支原体出现阳性峰外，其他种属DNA样本均未起峰，说明猪鼻支原体荧光定量PCR特异性良好。
权利要求
1.一种猪鼻支原体荧光定量PCR检测引物对和分子信标探针，其特征是， 引物 I :P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3' 引物 2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3' 分子信标探针5’ -FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，
2.根据权利要求I所述的一种猪鼻支原体荧光定量PCR检测定量PCR检测引物对和分子信标探针，其特征在于，检测过程中PCR扩增反应体系25μ I为无菌双蒸水8μ1 2 X荧光定量PCR反应预混液12.5μ1 20μΜ 引物 IΙμ 20μΜ 引物 2Ιμ 20μΜ分子信标探针ιμ1校正染料Rox0.5 μ 标准阳性模板ρΜ-Ρ37或样品模板DNAIμ 反应条件为95°C预处理IOmin,进行40个循环反应,每个循环反应包括95°C 15s,53°C lmin，于53°C时测定荧光值。
3.用权利要求I或2所述的引物对和分子信标探针制备猪鼻支原体荧光定量PCR检测试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，特别是用于猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测，属于生物技术领域。确定以猪鼻支原体P37基因保守区序列作为扩增靶序列，设计合成一对特异性引物和一条分子信标探针应用于猪鼻支原体的定量检测。根据不同浓度梯度的阳性质粒制作的定量标准曲线可以看出，不同梯度定量模板数的对数值与Ct值之间有较好的相关关系，其相关系数为0.999；同时，该检测方法具有很高的灵敏度，最低能检测到10个拷贝的病原体。对其他病原进行检测表明，该方法具有很好的特异性。
文档编号C12R1/35GK102766699SQ20121029691
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者冯志新, 刘茂军, 武昱孜, 熊祺琰, 白方方, 邵国青 申请人:江苏省农业科学院