专利名称：支原体的pcr检测方法
技术领域：
本发明属于生物检验技术领域，涉及一种支原体的PCR检测方法。
背景技术：
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0. 2-0. 3 μ m之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体约有可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，因此在普通光学显微镜下不易被发现。到目前为止， 已发现的支原体有30余种，细胞培养中常见的污染种类包括精氨酸支原体(Mycoplasma arginini),猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis), 口腔支原体(Mycoplasma orale),发酵支原体(Mycoplasma fermentans),莱氏无胆留原体(Acholeplasma laidlawii)等。细胞是兽医生物制品领域科研和生产中常用到的重要工具，然而支原体污染一直是困扰细胞培养的一个严重问题。细胞被支原体污染后，细胞培养上清液中支原体的浓度可达IO7个/mL，而培养的细胞看起来很正常，不引起明显的细胞形态改变，也不导致液体混浊，在肉眼观察或普通光学显微镜下观察，受污染的细胞也无明显变化，仅凭外观难以发现。但是支原体污染显著影响培养细胞的生理活性，使以细胞培养为基础的疫苗生产企业受到很大影响。传统的检测方法是培养法，是利用营养丰富的培养基，直接对待检细胞、血清等进行支原体培养，观察培养基上支原体集落形成情况，但是这种方法检验周期至少3周。鉴于目前的现状，对于以细胞培养为基础的疫苗生产来说，特别是悬浮培养式的大规模细胞培养，就迫切需要建立快速有效的检测支原体方法，而PCR检测方法是应用一对特异性引物扩增支原体基因组序列，具有灵敏度高、特异性好和稳定性好等特点，并且检验周期短，2个小时既可以出结果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种快速校验支原体的PCR检测方法。实现本发明的具体方法如下一种支原体的PCR检测方法，包括如下步骤(1)提取待测样品的核酸；(2)以一对支原体特异性引物对检测样品进行PCR扩增反应，所述的特异性引物为上游引物如SEQ ID NO 1所示，下游引物如SEQ ID NO 2所示，；(3)扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳；(4)观察电泳检测图，根据有无特异性扩增产物的目的条带出现来判定待测样品中是否含有支原体。以下为各步骤可采取的较佳操作条件。
其中，步骤(1)中所述待测样品的核酸提取方法为取ImL待检样品，放入一个 1. 5mL无菌离心管中，12000rpm离心5 20分钟，弃上清，用10 30 μ 1无菌超纯水溶解沉淀，将离心管沸水浴5 15分钟后，再冰浴2 10分钟，12000rpm离心5 10分钟，弃沉淀，上清转入新的1. 5mL无菌离心管中，_20°C保存备用。其中，步骤⑵所述扩增反应的反应液总体积为25μ 1，包括PCR反应10倍缓冲液2. 5 μ L，4种dNTP混合物每种各200 μ mol/L,上游引物0. 5 μ 1，下游引物0. 5 μ 1，待测样品的核酸1 μ 1，超纯水补至总体积25 μ 1。其中上游引物和下游引物的用量各为10 IOOpmol ο其中，上游引物的浓度为10 μ m/L，下游引物的浓度为ΙΟμπι/L。其中，步骤⑵所述扩增反应的反应条件为95°C预变性5 10分钟，94°C变性 5 30秒，55°C退火20 30秒，72°C延伸25 45秒，28 40个循环，72°C延伸5 10 分钟。其中，步骤中所述特异性扩增产物的大小为360 700bp。与现有支原体检测方法相比，本发明主要优点在于1.特异性高一对引物对支原体基因组特异性区域的识别保证PCR扩增的高度特异性，而传统培养法，存在非特异性细菌增殖，影响结果判定。2.检测周期短PCR检测方法可以2个小时得出结果，而传统培养方法检测周期要
一个月。3.稳定性高同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性强，适合大规模、高通量的样品分析，一次可处理样品几十个。
图1细胞样品进行PCR检测图，泳道1为DNA Marker DL5000，泳道2污染细胞上清液，泳道3为正常细胞上清液，泳道4为阴性对照。图2支原体污染细胞样品进行10倍梯度稀释，泳道1为DNA Marker DL1000，泳道 2-泳道9分别为支原体污染细胞样品KT1--KT8稀释度，泳道10为阴性对照。
具体实施例方式本发明用到的所述特异性引物的设计基础为支原体基因组的特异性保守序列 SEQ ID NO :1。使用所述特异性引物的效果最佳。
下面结合实例及附图，进一步阐述本发明。实施例1 :FMDV疫苗生产中各种实验样品的支原体PCR检测1样品准备分别取下述各样品1ml，至灭菌1. 5ml离心管中备用。1) 1号BHK21细胞培养物；2) 2号BHK21细胞培养物；3) 1 号 FMDV 病毒液；4) 2 号 FMDV 病毒液；5) 1号细胞培养用营养液；
6)阳对对照，即猪鼻支原体培养物；7)空白对照，即灭菌水；
2样品支原体核酸制备 核酸提取方法为1)ImL待检样品，放入一个1. 5mL无菌离心管中，12000rpm离心20分钟；2)弃上清，用20μ 1无菌超纯水溶解沉淀；3)将离心管沸水浴10分钟后，再冰浴2分钟；4)12000rpm离心5分钟，弃沉淀；5)上清转入新的1.5mL无菌离心管中，-20°C保存备用。 3支原体PCR扩增反应扩增反应的反应液总体积为25 μ 1，包括
权利要求
1.支原体的PCR检测方法，包括如下步骤(1)提取待测样品的核酸；(2)以一对支原体特异性引物对检测样品进行PCR扩增反应，所述的特异性引物为上游引物如SEQ ID NO 1所示，下游引物=SEQ ID NO :2所示；(3)扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳；(4)观察电泳检测图，根据有无特异性扩增产物的目的条带出现来判定待测样品中是否含有支原体。
2.根据权利要求1所述的支原体的PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述待测样品的核酸提取方法为取Iml待检样品，放入一个1. 5ml无菌离心管中，12000rpm离心5_20 分钟，弃上清，用10 30 μ 1无菌超纯水溶解沉淀，将离心管沸水浴5 15分钟后，再冰浴 2 10分钟，12000rpm离心5 10分钟，弃沉淀，上清转入新的1. 5mL无菌离心管中，_20°C 保存备用。
3.根据权利要求1所述的支原体的PCR检测方法，其特征在于步骤(2)所述扩增反应的反应液总体积为25 μ 1，包括PCR反应10倍缓冲液2. 5 μ L，4种dNTP混合物每种各 200ymol/L，上游引物0. 5 μ 1，下游引物0. 5 μ 1，待测样品的核酸1 μ 1，超纯水补至总体积 25 μ 1。其中上游引物和下游引物的用量各为10 lOOpmol。
4.根据权利要求4所述的支原体的PCR检测方法，其特征在于上游引物的浓度为 10 μ m/L，下游引物的浓度为lOym/L。
5.根据权利要求1所述的支原体的PCR检测方法，其特征在于步骤(2)所述扩增反应的反应条件为95°C预变性5 10分钟，94°C变性5 30秒，55°C退火20 30秒，72°C 延伸25 45秒，沘 40个循环，72°C延伸5 10分钟。
6.根据权利要求1所述的支原体的PCR检测方法，其特征在于步骤中所述特异性扩增产物的大小为360 700bp。
全文摘要
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测支原体的PCR方法。本发明通过提取支原体核酸，应用支原体特异性引物进行PCR扩增及电泳来判断检测样品中是否存在支原体污染，电泳图中如出现435bp特异性条带，表明该样品中存在支原体，如果没有出现435bp特异性条带，表明该样品中不存在支原体。经检测验证，本发明的检测体系具有特异性高、稳定性好和检验周期短等特点。
文档编号C12Q1/04GK102242213SQ201110194160
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月14日 优先权日2011年7月14日
发明者刘国英, 张贵刚, 张领月, 徐师军, 郭伟 申请人:金宇保灵生物药品有限公司