专利名称：一种大规模合成长链核酸分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸分子的合成方法，特别涉及一种由短链核酸分子合成长链核酸分子的大规模、低成本、高效率合成方法。
背景技术：
近年来，合成生物学的发展速度迅猛。生物能源、医药中间体等均可以通过合成基因的手段，达到改变细菌或细胞的代谢过程。例如，2006年，科学家利用工程酵母合成青蒿素中间体，将产率提高115毫克/毫升。2009年，Church小组通过一组寡核苷酸片段修饰基因组，加快大肠杆菌进化，使得番茄红素Lycopene的产率增加五倍。更为令人振奋的是，科学家已经开始通过合成手段来合成完整的基因组，并以此构建新的生命体。2008年，科学家第一次合成了基因组长度具有582kb的生殖支原体(Mycoplasma genitalium)。2010年5月，科学家组装修饰了一个基因组(有一百万个碱基组成)并将其植入到细菌中以此产生一个能够自我复制的蕈状支原体。这些成果表明，在·不久的将来，我们可以完全按照自己的意愿来改造生命。基因合成的不断成熟是合成生物学迅猛的关键之一。特别是近年来，DNA芯片技术的发展使得大规模合成基因成为可能。现在，在一张芯片上，可以同时合成上百万寡核苷酸序列。然而这些寡核苷酸序列太短，一般在60bp到200bp之间。如何将这些短的片段变成足够长度有效的基因(大于Ikb)，特别是如何有效地获得成千上万条条长片段基因是当前合成生物学研究领域的热点和难点之一。解决这一难题的策略有两个一是继续提高寡核苷酸的合成能力，增加每条寡核苷酸的长度；二是，基于现有技术，开发有效的组装方法，实现平行组装上千万条长片段基因。事实上，这两种策略并不矛盾，有可能相互整合。但是，前者很大程度上依赖于技术的突破。而最近两个工作证明后者，在操作上更为可行性。Church等利用选择性放大部分寡核苷酸序列方法，先建立亚文库，再进行组装的策略，实现了合成47个基因(共35kb)。TianJindong小组等将芯片预先分成若干个物理单元，进行平行合成、放大以及组装的方法，同样实现74个基因(共30kb)的合成。然而，Church和Tian Jindong等人的工作,在合成的通量上(最大合成的数目)仍然具有很大的局限性，必须分步实现上千基因的合成；此外这些方法合成基因的成本上也较高，还有很大的提高余地。本发明专利提出一种更为简单可行的组装方法，可平行实现多个基因的组装。
发明内容
本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种新型寡核苷酸组装合成长链核酸分子的方法。本发明采用核酸连接-纯化-放大(Ligation-Puficaion-Amplification，or LPA)技术，使得寡核苷酸片段(30bp-200bp之间)有效地组装合成长片段基因(500bp-lkbp)，进一步通过核酸扩增手段增加长片段基因的产量。利用该技术可方便、有效地从事寡核苷酸片段的组装、纯化和放大等操作，排除随机组装产物、不完全连接产物以及错配组装产物等副产物，实现三条或更多条基因的同时组装和放大。为了纯化简单起见，采用固相连接-纯化方法，即将核酸分子固定在磁珠等固相颗粒表面，达到从连接反应中快速、简单分离纯化产物的目的。在本发明中，术语“核苷酸序列”或“核酸分子”指的是核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)以及它们的衍生物或杂合体等。“固定化”(immobilize)指的是核酸分子(包括但不限于DNA、RNA等)通过化学基团(如氨基-NH2)与固态物体上的化学基团(如羧基-C00H)通过化学反应(如氨基与羧基脱去一分子水)形成共价键，从而将核酸分子与块状固体紧密连接在一起；或者指溶液中的核酸分子通过高亲和分子(包括但不限于biotin与avidin或streptavidin)之间的相互作用与固态物体连接在一体；或者指溶液中的核酸分子与已经固定化到高分子块体
上的纯化序列通过碱基配对生成氢键紧密连接在一起。因此，“固定化”不同于物理的吸附或粘附，通常的洗涤方式可以将吸附或粘附在高分子块体上的杂质洗去，却不能洗去“固定化”到高分子块体上的核酸分子。核酸扩增方法，是指任何基于核酸模板，实现核酸扩增放大的方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、转录、等温扩增等方法。“聚合酶链式反应(PCR) ”，又称体外DNA扩增技术，包括变性、退火和延伸三个步骤。用于DNA模板等扩增放大。本发明采用的技术方案如下。一种大规模合成长链核酸分子的方法，该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的设计及合成设计一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列，将所述核苷酸序列的双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段，合成小片段核酸分子的方法已经非常成熟，而且成本很低，如上百万条60bp的寡核苷酸片段只需几千元人民币，每一个碱基不足O. 01分；2)端点的化学修饰将位于上述核苷酸序列端点位置的4条小片段核酸分子中的至少一条的端点一该端点同时也是上述核苷酸序列的端点一进行化学修饰，使其带有可以发生生物和/或化学反应的化学基团和/或生物分子，上述进行了化学修饰的小片段核酸分子称为“纯化序列” ；3)短链核酸分子片段的连接步骤I合成得到的包括上述纯化序列的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；4)纯化准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，上述化学基团和/或生物分子能够与纯化序列上的化学基团和/或生物分子连接，将该块状固体加入步骤3得到的含有长链核酸分子的溶液中进行孵育，包含目标长链核酸分子的核苷酸序列将通过纯化序列上的化学基团和/或生物分子固定化到固体表面，分离得到块状固体，冲洗块状固体；5)扩增利用核酸扩增技术对固定化到块状固体表面的包含目标长链核酸分子的核苷酸序列进行扩增放大；任选的步骤6)剪切通过酶切除核苷酸序列中除目标长链核酸分子之外多余的核苷酸片段，得到目标核酸分子。上述技术方案与现有技术的最大区别在于其在扩增放大步骤之前进行了纯化。由于核苷酸的互补配对存在一定的错配率，因而通过核苷酸互补配对将短链核酸分子连接成长链的核酸分子的时候，并不是所有的产物都是目标核酸分子，如果不加以纯化便对其进行扩增放大的话，扩增产物中的非目标长链核酸分子将更多，不但浪费了大量的原料，而且大大增加了分离难度与成本。然而，在本申请之前，本领域似乎形成了一种技术偏见，研究者形成了这样一种定势思维合成得到长链核酸分子之后立即进行扩增放大，因而当有研究者尝试将长链核酸分子划分为短链核酸分子，然后由短链核酸分子连接合成长链核酸分子的时候，他们发现扩增放大之后的体系中目标核酸分子的含量很少，产率很低，成本非常高。本申请的发明人在研究过程中考虑到，可能是扩增放大步骤之前存在于体系中的非目标核酸分子导致了最终体系中的大量非目标连接产物，当发明人尝试在扩增放大步骤之前预先对核酸分子进行纯化的时候，惊奇地发现扩增放大产物中的非目标核酸分子的含量减小了数千万倍，从而使得合成效率大大提高，同时合成成本大幅下降。对核酸分子进行纯化可以采用传统的HPLC、PAGE、毛细管电泳或者凝胶电泳等方法，将不同长度的核酸分子分离开，也可以采用发明人设计的固相分离方法，具体操作是先将位于包含目标长链核酸分子的核苷酸序列端点位置的4条小片段核酸分子中的至少一条的端点一该端点同时也是上述核苷酸序列的端点一进行化学修饰，使其带有可以发生生物和/或化学反应的化学基团和/或生物分子，上述进行了化学修饰的小片段核酸分子称为“纯化序列”;然后准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，上述化学基团和/或生物分子能够与纯化序列上的化学基团和/或生物分子连接，将该块状固体加入含有“包含长链核酸分子的核·苷酸序列”的溶液中进行孵育，上述核苷酸序列将通过纯化序列上的化学基团和/或生物分子固定化到固体表面，分离得到块状固体，冲洗块状固体，便可以将非目标产物(通常是物理吸附到块状固体表面，或者连接到块状固体表面但是核酸分子上存在未连接的缺口)冲洗掉，于是块状固体上固定化的核酸分子便基本全是包含目标核酸分子的核苷酸序列了，如此便简单地实现了核酸分子的纯化，使得扩增放大的准确率大大提高。当然，上述固相分离也可以在将短链核酸分子片段连接成长链核酸分子之前进行，先将块状固体与纯化序列一起孵育，使纯化序列固定化到块状固体表面，然后将块状固体与其他短链核酸分子一起在核酸分子连接酶的作用下连接成长链核酸分子，同样可以简单地对块状固体进行冲洗以达到纯化的目的。具体操作步骤如下一种大规模合成长链核酸分子的方法，该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的设计及合成设计一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列，将所述核苷酸序列的双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段；2)端点的化学修饰将位于上述核苷酸序列端点位置的4条小片段核酸分子中的至少一条的端点一该端点同时也是上述核苷酸序列的端点一进行化学修饰，使其带有可以发生生物和/或化学反应的化学基团和/或生物分子，上述进行了化学修饰的小片段核酸分子称为“纯化序列”;3)短链核酸分子片段的连接准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，上述化学基团和/或生物分子能够与纯化序列上的化学基团和/或生物分子连接，将该块状固体加入步骤2得到的纯化序列的溶液中进行孵育，纯化序列将通过其上的化学基团和/或生物分子固定化到固体表面，将上述孵育后的块状固体与步骤I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；4)纯化分离得到块状固体，冲洗块状固体；5)扩增利用核酸扩增技术对固定化到块状固体表面的目标长链核酸分子进行扩增放大；任选的步骤6)剪切通过酶切除核苷酸序列中除目标长链核酸分子之外多余的核苷酸片段，得到目标核酸分子。而如果采用常规的纯化方法，则步骤如下一种大规模合成长链核酸分子的方法，该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的合成将目标长链核酸分子双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段；2)短链核酸分子片段的连接步骤I合成得到的小片段核 酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；3)纯化利用HPLC、PAGE、毛细管电泳或者凝胶电泳等方法对步骤2的产物进行纯化，分离得到目标长链核酸分子；4)扩增利用核酸扩增技术对步骤3纯化得到的目标长链核酸分子进行扩增放大。步骤I中所述“一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列”可以是目标长链核酸分子本身。这样最后的步骤6便可以省略，步骤5直接得到目标长链核酸分子。或者，步骤I中所述“一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列”由目标长链核酸分子及位于目标长链核酸分子两端的PCR引物序列和纯化序列组成。这样设计的好处是，不同的目标长链核酸分子可以使用同样的纯化序列、在步骤5进行PCR扩增时将用到的PCR引物序列，这样有利于进一步降低成本。优选地，可以在纯化步骤之前进一步包括转录步骤，如此能更进一步地提高扩增方法的准确率，进一步降低成本。优选地，步骤I中将目标核酸分子双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开至少3个核苷酸，优选彼此错开至少5个核苷酸，进一步优选彼此错开至少7个核苷酸，最优选彼此错开至少9个核苷酸。划分点错开较多，则错配的几率变小，合成的准确度增加。优选地，所述长链核酸分子包括至少700个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目< 150 ;或者所述长链核酸分子包括至少1000个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目(100。现有技术中合成200个核苷酸以下的核酸分子技术已经很成熟，成本也相当低，利用本发明的方法可以将这些容易获得的短链核酸分子连接为想要的长链的核酸分子，现有技术的方法合成700个、1000个以上或者更长的核酸分子成本非常高，利用本发明的方法可以大大降低成本。优选地，所述块状固体包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。实际上，任何已知的固体材料，只要其表面可以进行化学修饰或者连接生物基团，都可以使用。优选地，纯化序列修饰有生物素(biotin)，块状固体表面修饰有链酶亲和素(streptavidin);或者纯化序列修饰有氨基，块状固体表面修饰有羧基；或者纯化序列修饰有羧基，块状固体表面修饰有氨基；或者纯化序列修饰有叠氮化物(azide)，块状固体表面修饰有炔烃(alkyne);或者纯化序列修饰有炔烃，块状固体表面修饰有叠氮化物。优选地，核酸分子连接酶可以是T4连接酶或Taq连接酶。本发明所产生的技术效果是非常显著而且振奋人心的，现有技术合成较短的核酸分子(核苷酸数目在200以下)技术较成熟，成本也较低，然而进一步合成更长的核酸分子(500个核苷酸以上)时成本急剧增加，虽然有研究者利用不同策略合成得到了一定数量的基因(如Tian Jindong等人利用物理空间分隔一次得到74个基因，约30kb)，然而这些工作所能完成的通量仍然受操作的复杂程度和成本的制约。而本发明由于在对连接产物进行扩增之前预先进行了纯化，保证了所有连接反应、纯化反应、扩增反应可以平行针对所有产物同时进行，没有增加太多额外的操作和成本，实现了大通量、大规模的长链核酸合成。
图I本发明的寡核苷酸片段(即短链核酸分子)组装成长链核酸分子的示意图。主要包括三步寡核苷酸片段的连接，连接产物的纯化以及放大。一组寡核苷酸片段充分混合后，进行磷酸化处理。为方便下一步对连接产物进行纯化起见，其中一条寡核苷酸链的5’端带有生物素(biotin)。这些序列经过退火(annealing),在T4连接酶或Taq连接酶的作用下，形成完整的双链。随后，加入带streptavidin修饰的磁珠进行纯化,这样可以有效地 去除反应底物、错误连接产物以及没有连接完全的双链。最后，通过PCR等核酸扩增方式，将进行纯化好的产物扩增放大。图2单一 554bp核酸片段的获得。一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)和纯化序列(见表I)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一 554bp核酸片段(经过测序确认)。每条DNA片段的起始量可以低至O.Olfmol，仍然可以得到连接产物。图3单一 731bp核酸片段的获得。一组25bp-60bp的核酸片段(23条)、接头序列(I和2)和纯化序列(见表2)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一 731bp核酸片段(经过测序确认)。每条DNA片段的起始量可以低至O.Olfmol，仍然可以等到连接产物。图4单一 1026bp核酸片段的获得。一组25bp-60bp的核酸片段(33条)、接头序列(I和2)和纯化序列(见表3)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一 1026bp核酸片段(经过测序确认)。图5存在干扰片段下，单一片段554bp核酸片段的获得。一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)、纯化序列(I条)(表I)以及一组干扰序列(12条)(见表4)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一完全正确的554bp核酸片段(经克隆测序确认)。图6存在干扰片段下，单一片段731bp核酸片段的获得。一组25bp_59bp的核酸片段(23条)、接头序列(I和2)、纯化序列(I条)以及一组干扰序列出条)(见表5)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一完全正确的731bp核酸片段(经克隆测序确认)。图7存在干扰片段下，单一片段1026bp核酸片段的获得。一组25bp-60bp的核酸片段(33条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)以及一组干扰序列出条)(见表6)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得单一完全正确的981bp核酸片段(经克隆测序确认)。图8存在干扰片段下，同时获得554bp、731bp、1026bp三条核酸片段。一组25bp_59bp的核酸片段(17+23+33 = 73条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)以及一组干扰序列(12+6+6=24条)(见表1-6)，经过图I连接、纯化、放大三步操作，获得三条完全正确核酸片段，分别为554bp，731bp，1026bp (经克隆测序确认)。
具体实施例方式以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。材料和方法一组DNA片段溶解充分混合后，稀释到IOOfmol/ μ I。按照产品要求，利用Τ4寡聚核苷酸激酶(Polynucleotide kinase, NEB)对所有DNA片段进行磷酸化处理，然后在37°C孵育I个小时。磷酸化后，DNA片段进一步稀释到每一条的含量为lfmol。同时，将Tl磁珠(Dynal)与5’端修饰生物素的DNA探针在室温下孵育15分钟，然后用缓冲液清洗三次。将DNA片段溶液与固定化了“纯化序列”的磁珠混合，在65°C下孵育两个小时。为了保证DNA链间充分杂交，整个反应器在220转/分钟震荡。然后将反应器缓慢降温至室温，清洗磁珠，除去多余的DNA片段。最后，在T4或Taq连接酶的作用下，将磁珠上杂交好 的DNA，进行过夜连接。为了大量获得连接好的DNA产品，下一步我们将它们进行必要的扩增。常用的方法包括PCR、转录等各种扩增方式，或者可以将两种方式相互结合使用进行扩增。最后将放大产物进行纯化，克隆和测序。从实施例1-7的结果(实验结果见图1-8及
)可以看出，即使DNA片段的起始量低至O. Olfmol的时候，依然可以得到目标DNA分子，这一点对于基于芯片合成的核酸制备非常重要。由于现阶段芯片大规模合成小核酸分子方法得到每一条分子的含量约为lfmol，不经过扩增，很难等到足够量的核酸分子，因此扩增反应是必须的。本发明由于预先进行了纯化，在扩增前尽可能的除去对产物扩增有影响的副产物，使得DNA片段的起始量低至O. Olfmol的时候，依然可以得到目标DNA分子，这是采用芯片技术大规模合成长链核酸分子的关键所在。此外，图5-8的结果证明，本发明抗干扰的能力特别强。从表4-6可以看出，每个实验中我们人为地加入了若干条干扰序列，每一条干扰序列中都在不同的位置设置了 5个随机的核苷酸(N代表随机核苷酸)，这将对合成目标长链核酸分子造成非常大的干扰，在实际合成时是不会存在如此大的干扰的，本发明的方法在存在如此强烈的干扰的情况下依然得到了目标产物，说明本发明的方法抗干扰能力非常强，很适合大规模、高准确度地合成长链核酸分子。实施例I一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)(见表I)先充分混合，然后经过激酶磷酸化处理。经过退火(annealing),在T4连接酶的作用下，形成完整的双链。随后，加入带streptavidin修饰的磁珠进行纯化,这样可以有效地去除反应底物、错误连接产物以及没有连接完全的双链。最后，通过PCR等核酸扩增方式，将进行纯化好的产物扩增放大。实施例2实验过程与实施例I相同，只是将表面修饰streptavidin的磁珠颗粒先于纯化序列孵育15分钟，用缓冲液清洗三次。然后在其它序列混合，进行磷酸化处理。再经过退火、连接反应。最后，进行纯化和扩增。实施例3
实验过程与实施例I或2相同,只是将表面修饰streptavidin的磁珠颗粒换为玻璃、聚合物颗粒，如聚甲基丙烯酰胺、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚2-羟乙基(甲基)丙烯酸酯、聚N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、聚乙酸乙烯酯或聚丙烯胺，得到的结果与实施例I相似。实施例4一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)(见表I)先充分混合，然后经过激酶磷酸化处理。经过退火(annealing),在T4连接酶的作用下，形成完整的双链。随后，利用HPLC对产物进行纯化，这样可以有效地去除反应底物，错误连接产物以及没有连接完全的双链。最后，通过PCR等核酸扩增方式，将进行纯化好的产物扩增放大。实施例5
实验过程与实施例4相同，只是将HPLC对产物的纯化改为PAGE胶纯化、凝胶电泳纯化、毛细管电泳纯化等方式，实验结果与实施例4类似。实施例6实验过程与实施例I或2相同，只是在一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)中，再加入12条干扰片段(见表5)。克隆测序发现，全部为正确554bp核酸片段。实施例7实验过程与实施例6相同，只是在一组25bp_59bp的核酸片段(17条)、接头序列(I和2)和纯化序列(I条)中，加入12条干扰片段，再加入68条25bp-59bp的核酸片段。克隆测序发现，可同时获得554bp、731bp、1026bp三条核酸片段。附表PCR 引物forward primer TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTreverse primer AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT表I.获得554bp片段所需序列
权利要求
1.一种大规模合成长链核酸分子的方法，其特征在于该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的设计及合成设计一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列，将所 述核苷酸序列的双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段；2)端点的化学修饰将位于上述核苷酸序列端点位置的4条小片段核酸分子中的至少一条的端点一该端点同时也是上述核苷酸序列的端点一进行化学修饰，使其带有可以发生生物和/或化学反应的化学基团和/或生物分子，上述进行了化学修饰的小片段核酸分子称为“纯化序列” ;3)短链核酸分子片段的连接步骤I合成得到的包括上述纯化序列的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；4)纯化准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，上述化学基团和/或生物分子能够与纯化序列上的化学基团和/或生物分子连接，将该块状固体加入步骤3得到的含有长链核酸分子的溶液中进行孵育，包含目标长链核酸分子的核苷酸序列将通过纯化序列上的化学基团和/或生物分子固定化到固体表面，分离得到块状固体，冲洗块状固体；5)扩增利用核酸扩增技术对固定化到块状固体表面的包含目标长链核酸分子的核苷酸序列进行扩增放大；任选的步骤6)剪切通过酶切除核苷酸序列中除目标长链核酸分子之外多余的核苷酸片段，得到目标核酸分子。
2.一种大规模合成长链核酸分子的方法，其特征在于该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的设计及合成设计一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列，将所述核苷酸序列的双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段；2)端点的化学修饰将位于上述核苷酸序列端点位置的4条小片段核酸分子中的至少一条的端点一该端点同时也是上述核苷酸序列的端点一进行化学修饰，使其带有可以发生生物和/或化学反应的化学基团和/或生物分子，上述进行了化学修饰的小片段核酸分子称为“纯化序列” ;3)短链核酸分子片段的连接准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，上述化学基团和/或生物分子能够与纯化序列上的化学基团和/或生物分子连接，将该块状固体加入步骤2得到的纯化序列的溶液中进行孵育，纯化序列将通过其上的化学基团和/或生物分子固定化到固体表面，将上述孵育后的块状固体与步骤I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；4)纯化分离得到块状固体，冲洗块状固体；5)扩增利用核酸扩增技术对固定化到块状固体表面的目标长链核酸分子进行扩增放大；任选的步骤6)剪切通过酶切除核苷酸序列中除目标长链核酸分子之外多余的核苷酸片段，得到目标核酸分子。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于步骤I中所述“一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列”为目标长链核酸分子本身。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于步骤I中所述“一段包含目标长链核酸分子的核苷酸序列”由目标长链核酸分子及位于目标长链核酸分子两端的PCR引物序列和纯化序列组成。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的方法，其特征在于在步骤4和5之间还包括转录步骤。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的方法，其特征在于在扩增步骤完成之后进一步进行纯化。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的方法，其特征在于步骤I中将目标核酸分子双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开至少3个核苷酸，优选彼此错开至少5个核苷酸，进一步优选彼此错开至少7个核苷酸，最优选彼此错开至少9个核苷酸。
8.根据权利要求1-7的任一项所述的方法，其特征在于所述块状固体包括磁性材料、硅、二氧化硅、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的方法，其特征在于纯化序列修饰有生物素(biotin),块状固体表面修饰有链酶亲和素(streptavidin)。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的方法，其特征在于纯化序列修饰有氨基，块状固体表面修饰有羧基；或者纯化序列修饰有羧基，块状固体表面修饰有氨基；或者纯化序列修饰有叠氮化物(azide)，块状固体表面修饰有炔烃(alkyne);或者纯化序列修饰有炔烃，块状固体表面修饰有叠氮化物。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的方法，其特征在于步骤3中的核酸分子连接酶是T4连接酶或Taq连接酶。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的方法，其特征在于所述长链核酸分子包括至少700个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目< 150 ;或者所述长链核酸分子包括至少1000个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目< 200。
13.一种大规模合成长链核酸分子的方法，其特征在于该方法先合成短链核酸分子，然后将短链核酸分子连接为长链核酸分子，所述长链核酸分子的长度至少为短链分子长度的2倍；该方法包括如下步骤1)短链核酸分子片段的合成将目标长链核酸分子双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开，合成所述小片段；2)短链核酸分子片段的连接步骤I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对，形成带有缺口的双链，在核酸分子连接酶的作用下，形成完整的长链核酸分子；3)纯化利用HPLC、PAGE、毛细管电泳或者凝胶电泳等方法对步骤2的产物进行纯化，分离得到目标长链核酸分子；4)扩增利用核酸扩增技术对步骤3纯化得到的目标长链核酸分子进行扩增放大。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于在步骤3和4之间还包括转录步骤。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于在扩增步骤完成之后进一步进行纯化。
16.根据权利要求13-15的任一项所述的方法，其特征在于步骤I中将目标核酸分子双链中的每一条单链分别划分为若干个小片段，两条链中的划分点彼此错开至少3个核苷酸，优选彼此错开至少5个核苷酸，进一步优选彼此错开至少7个核苷酸，最优选彼此错开至少9个核苷酸。
17.根据权利要求13-16的任一项所述的方法，其特征在于步骤2中的核酸分子连接酶是T4连接酶或Taq连接酶。
18.根据权利要求13-17的任一项所述的方法，其特征在于所述长链核酸分子包括至少70 0个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目(150 ;或者所述长链核酸分子包括至少1000个核苷酸，每一个小片段中的核苷酸数目< 200。
全文摘要
一种由短链核酸分子合成长链核酸分子的大规模、低成本、高效率合成方法，包括1)短链核酸分子片段的合成；2)端点的化学修饰将位于长链核酸分子端点位置的小片段核酸分子的端点进行化学修饰，称为“纯化序列”；3)短链核酸分子片段的连接准备块状固体，所述固体表面具有化学基团和/或生物分子，将该块状固体加入步骤2得到的纯化序列的溶液中进行孵育，纯化序列将固定化到固体表面，将块状固体与步骤1合成得到的小片段核酸分子在溶液中通过互补配对形成带有缺口的双链，在连接酶作用下形成完整的长链核酸分子；4)纯化分离并冲洗块状固体；5)利用核酸扩增技术对固定化到块状固体表面的目标长链核酸分子进行扩增放大。
文档编号C12N15/10GK102876658SQ20111019363
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者马千君, 李绍路 申请人:北京唯尚立德生物科技有限公司