长效重组人生长激素的Fc融合蛋白的制作方法

专利名称：长效重组人生长激素的Fc融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组人生长激素的Fe融合蛋白及其制法和用途。
背景技术：
人生长激素(hGH)是由脑下垂体产生和释放，全长191个氨基酸、分子量为22kDa的肽类激素。它参与了大部分人的正常生长和发育的调控，是刺激身体生长的主要激素，并呈现出多种生物效应，包括线性增长、体质形成、泌乳、巨噬细胞活化以及类似胰岛素作用等。此外，生长激素还可以刺激骨骼、软骨和肌肉的代谢。生长激素与其特异生长激素受体(hGHR)在靶点细胞表面相互结合，介导出生化串联反应，从而激活生物效应。生长激素与受体分子的结合通常遵循一种序贯机制；先通过生长激素内的结合位点I与第一个受体分子结合，其后再通过生长激素的结合位点2与第二个受体分子结合。这种由一个生长激素分子与两个生长激素受体分子的结合是激化生物活性、调节生长和发育所必需的步骤。具体地，结合位点2包含了生长激素分子N端的8个氨基酸和其他几个来自属于螺旋线I和螺旋线3内的氨基酸。结合位点I则包括生长激素分子在螺旋线I之内的氨基酸以及C-端附近的氨基酸。结合位点I的8个氨基酸占了结合总能量的85%。换言之，这8个氨基酸在与受体结合的过程中扮演了决定性的角色。若将这8个氨基酸残基的位置以其它氨基酸取代，将会迅速改变其与生长激素受体结合的能力(例如见，Wells et al. Recent Prog. Horm. Res. ,48 :253-75,1993) 这 8 种氨基酸位于螺旋线I和螺旋线2之间段(K41，L45，P61，R64)和螺旋线4内的羧基C端半段(K172，T175，F176，R178)，而其后段4个氨基酸残基正好位于全长191个氨基酸的生长激素的C-终端附近。因此生长激素C端附近的氨基酸在与受体结合的过程中举足轻重。换言之，生长激素C端的氨基酸与其功能密切相关，故目前对GH进行基因工程改造时通常避开C端，也不采用人GH的C末端与其他蛋白进行融合的方式。儿童和成人在生长激素缺乏情况下，补充重组人生长激素(rhGH)是理想的治疗方式。但其缺点是重组人生长激素在人体内药效甚短，其静脉注射的血清清除半衰期约20分钟。若以皮下注射重组人生长激素，其高峰血药浓度通常要几个小时后才能达到，而其消除半衰期则为3至8小时。因此，重组人生长激素的治疗需要每周注射3次，或每天一次，以保持适当的血清生长激素水平。对于那些需要长期接受生长激素治疗的病人，往往由于不能按时注射，造成治疗效果降低。长效、高活性的重组人生长激素因而成为此药剂改善的目标。在1999年到2004年间，基因技术(Genentech)公司和阿尔凯默斯(Alkermes)股份有限公司开发出Nutropin D印ot在市场销售，该产品是一种持续释放形式的生长激素，具长效特性，接受治疗的病人其注射次数可减至每2或4周一次，而不需每天注射。不过由于生产成本过高，该产品在2004年被撤出市场。在此期间，数种治疗性蛋白药物藉着与某些聚合物如聚乙二醇(PEG)进行结构上的修改来延长半其衰期和改善体内效价而创建了这些蛋白质药物的第二代产品。蛋白药物与聚乙二醇共价性的结合通常可增加蛋白质的有效期限，并降低其在人体内的清除率。重组人生长激素亦不例外。一些有关聚乙二醇生长激素的文献显示，数种不同形式的聚乙二醇生长激素确实具有比重组人生长激素较长的半衰期，但往往在蛋白质的聚乙二醇化过程中造成了生物活性的损失。IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天。已有报导将IgG的Fe区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合而形成融合蛋白(参见，例如 Capon 等人,Nat ure, 337 :525-531,1989 ;Chamow 等人，TrendsBiotechnol.，14 :52-60,1996 ;美国专利 No. 5，116，964 和 5，541，087)。典型的融合蛋白是一重二聚体蛋白质,系通过IgG Fe绞链区中的半胱氨酸残基与蛋白连接,而形成类似IgG、但缺少CHl区域和轻链的分子。由于结构上的同源，Fe融合蛋白表现出的体外药物动力学特性与同种型的人IgG相当类似。因此制造含有与人IgG蛋白质的Fe区域相连的hGH融合蛋白，将有助于延长hGH的循环半衰期和/或增加它的生物活性。此外，由于生长激素分子C端氨基酸在生物活性的高度重要性，因此在构建hGH-Fc融合蛋白(hGH-Fc)时必需要预先考虑到如何克服连接Fe半体时所带来的后果。若直接将庞大的IgG Fe半体联结在C端，会为C端造成空间位阻效应,而大大地影响了生长激素结合位点对受体的可亲度。首先，融合蛋白与第一个生长激素受体的结合将因Fe半体带来的位阻现象受损，其接下去与细胞表面上的第二受体的后续结合可能因为此位阻效应而更进一步减弱。因此，根据上述生长激素C-终端氨基酸的重要性(K172，T175，F176，R178), hGH-Fc融合蛋白对受体的亲和力将受到破坏，导致其生物活性降低甚至丧失。因此目前的技术都是避免将Fe半体直接联结在C-终端，以免其活性遭受破坏。大多数重组蛋白都将Fe半体联结到生长激素分子的N-终端。但此替换方式亦有其缺陷，由于生长激素分子与其受体的结合位点分布于两终端，不论是将Fe接到N端或C端，融合蛋白的生物活性都可能会因Fe所带来的位阻效应而遭破坏。由于hGH-L-vFc融合蛋白的构建有其本质上的困难，迄今为止尚没有既具有半衰期显著延长的令人满意的GH衍生物。因此，本领域迫切需要开发长效、高活性、可以以合理的成本生产的hGH衍生物。

发明内容
本发明的目的就是提供一种具有高度生物活性的hGH-L-vFc融合蛋白及其制备方法和用途。在本发明的第一方面，提供了一种重组hGH-L-vFc融合蛋白，所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人GH、肽接头和人IgG Fe变体，并且所述的人IgG Fe变体选自下组⑴含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(ii)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的人 IgG4 绞链区、CH2 和 CH3 区域；(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3区域。在另一优选例中，所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于人GH和人IgG Fe变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的
氨基酸。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所示。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了 -26到-I位氨基酸残基的hGH前导肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的hGH-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似或更高的体外生物活性、更长的半衰期。 在本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面所述重组hGH-L-vFc融合蛋白的DNA分子。 在本发明的第三方面，提供了一种CHO衍生细胞株，所述细胞在其生长培养基中在每24小时内，产生超过10 μ g/百万个细胞的如本发明第一方面所述的重组hGH-L-vFc
融合蛋白。在另一优选例中，所述的CHO衍生细胞株在生长培养基中，每24小时内，产生超过30 μ g/百万个细胞的本发明第一方面所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白。在另一优选例中，所述的CHO衍生的细胞株含有编码hGH-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO : 17、19或21所示的核苷酸序列。在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面所述重组融合蛋白的方法，包括步骤(a)在融合蛋白在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过10 μ g/106 (百万)个细胞的条件下，培养本发明的第三方面所述的细胞株；和(b)纯化步骤(a)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似的或更高的体外生物活性，更长的半衰期。在另一优选例中，所述的重组融合蛋白在人GH和人IgG Fe变体之间有2-20个氨基酸的柔性肽；且所述柔性肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的
氨基酸。在另一优选例中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所不。在另一优选例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了 -26到-I位氨基酸残基的hGH前导肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。在本发明的第五方面，提供了一种提高含有人GH、柔性肽接头和人IgG Fe变体的重组融合蛋白的表达量的方法，所述的方法包括(a)将编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；(b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达融合蛋白；和(c)纯化步骤(b)表达的融合蛋白，其中重组融合蛋白是hGH-L-vFc融合蛋白，其特征为表现出极高的体外生物活性，即在摩尔基础上，具有与人GH类似或更高的体外生物活性和更长的半衰期；其中在人GH和IgG Fe变体间存在含有约2-20个氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域Pro331Ser突变的人IgG2 ；Ser228Pro和Leu235Ala 突变的人 IgG4 ;和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :18,20或22所示。在另一优选例中，所述编码融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO :17、19或21所示的核苷酸序列。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


图I显示了人IgGl、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较三个部分氨基酸区域228、234-237和330-331。这些变体的氨基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。
图2显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH-L_vFcY2的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-I是hGH的前导肽。成熟蛋白含有hGH(氨基酸残基I到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fe变体(氨基酸残基208到430)。在Fe区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。图3显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH-L_vFcY4的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-I是hGH的前导肽。成熟蛋白含有hGH (氨基酸残基I到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fe变体(氨基酸残基208到436)。在Fe区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。图4显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH_L_vFcYl的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-I是hGH的前导肽。成熟蛋白含有hGH (氨基酸残基I到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fe变体(氨基酸残基208到434)。在Fe区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。图5显示旋转培养瓶内细胞株的生长及其分泌hGH-LvFcY2融合蛋白的浓度趋势曲线图。图6显示了 hGH-L-vFcY2纯化蛋白刺激Nb2细胞增殖的能力。
具体实施例方式本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独到的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得hGH的C端与Fe连接的融合蛋白，中间有柔软的肽接头。令人意外的是，此融合蛋白不仅不会导致GH的功能丧失，反而能够维持、甚至提高生长激素-Fe融合蛋白的生物活性。在此基础上完成了本发明。具体地，本发明hGH-L-vFc融合蛋白从N端到C端依次含有人GH、肽接头和人IgGFe变体。较佳地，其中人Ig Fe变体含有选自以下的变体绞链区、CH2和CH3区域(A)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl ； (B)含有 Pro331Ser 突变的人 IgG2 ;和(C)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4。较佳地，使用约2_20个氨基酸长度的、含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgG Fe变体是非裂解性的，且与天然IgG Fe相比含有氨基酸突变。此类hGH-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似或更高的体外生物活性。且hGH-L-vFc γ2的体内血清清除半衰期比rhGH有显著增长。本发明的另一实施例为人Ig Fe变体含有绞链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能。在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组融合蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过10 (较佳地为30) μ g/106 (百万)个细胞的水平下表达。这些hGH-L-vFc融合蛋白显示出高度的体外生物活性和更长的体内血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实现类似药效所需的剂量和注射次数。此外，本发明人还发现，在hGH和人IgG Fe变体间添加的肽接头以两种方式提高hGH-L-Fc的体外生物活性⑴使Fe区域远离hGH上的hGHR结合位点，和⑵使一个hGH远离另一个hGH结构域,从而使两个hGH区域能分别与祀细胞上的hGHR反应。且人的IgG Fe变体在CH2区域在228、234、235、331位点含有氨基酸突变，从而降低Fe的效应子功能。Fe 元件Fe元件来自免疫球蛋白的Fe区域，Fe在消灭病原体的免疫防御中具重要作用。IgG的效应子功能由Fe介导而通过两种主要机制(I)与细胞表面Fe受体(Fe Y Rs)的结合，导致通过抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)途径，由杀伤细胞通过吞噬作用或裂解作用而嚥吞病原体；(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而溶解病原体。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3能有效地结合Fcy R。IgG4与Fe Y R的结合亲和力比IgGl或IgG3的低一个数量级，而IgG2与Fe Y R的结合低得难以测定。人IgGl和IgG3还能有效地结合Clq，并激活补体串联反应。人IgG2对补体的固定作用很弱，而IgG4似乎在激活补体串联反应的能力方面相当缺乏。对应用于人的治疗而言，当hGH-Fc融合蛋白结合于靶点细胞表面上的hGHR时，融合蛋白的Fe区域必须不能有不良效应子功能，因而不会溶解或除去这些靶点细胞。因此，hGH-Fc的Fe区域必须是非溶解性的，对结合于Fe Y Rs和Clq从而触发效应子功能方面，Fe区域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hGH-Fc融合蛋白。为了得到非溶解性的Fe，必须使天然Fe区域中的一些氨基酸突变，以降低其效应子功能。透过人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列的比较显示，Fe片段在CH2区域N末端附近的序列在IgG Fe与Fe YRs的结合中具重要作用。其在234位到237位基序的重要性已在基因工程建构的抗体中证明(参见，例如Duncan等人，Nature, 332 :563-564,1988)。本发明所提氨基酸残基编号是根据Kabat等人所述的EU编号体系标定(《SEQUENCES ofPROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第 5 版，United States Department of Healthand Human Services, 1991)。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3与Fe γ Rs的结合力最高，且两者具有相同的Leu234-Leu-Gly-Gly237序列(图I)。IgG4 % Fe y Rs结合的亲和力甚低，观其序列显示有个氨基酸受到替换，即在234位点上Leu换成Phe。在不与Fe Y Rs结合的IgG2中，则发生两个位点替换和一个位点被删除，从而形成Val234-Ala-Gly237序列(图I)。为了减少Fe与Fe Y R的结合和ADCC活性，IgG4中的Leu235可用Ala取代(参见，例如 Hutchins 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11980-11984，1995)。IgGl 抗体内的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233_Val_Ala235相关序列来替换。这种改变使IgGl变体在小鼠中失去了透过Fe Y R-介导除去靶点细胞的能力。有关抗体对Fe Y R与Clq结合至关重要的第二部位座落于人IgG的CH2区域靠近羧基端的附近(参见，例如Duncan等人，Nature, 332 =738-740,1988)。在四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代IgG4中的Ser330和Ser331替换了 IgGl、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(图I)。Ser330的存在不影响Fe Y R与Clq的结合。用Ser替代Pro331则使IgGl失去了与Clq的结合亲和力，而用Pro替代Ser331部分保留了 IgG4的补体固定活性(参见，例如Tao等人，J. Exp. Med.，178 :661-667,1993 ;Xu等人，J. Biol.Chem. ,269 :3469-3474,1994)。融合蛋白及其生产方法本发明提供了一类新型有效的hGH-L-Fc融合蛋白，融合蛋白中的Fe元件为变体 (vFc),以用于构建高效的hGH-L-vFc融合蛋白。人IgG2不结合Fe y R,但显示出微弱的补 体活性。具有Pro331Ser突变的Fcy2变体应比天然Fcy2的变体活性更低，而且仍旧不结合于Fe Y R0 IgG4Fc在激活变体串联反应有缺陷，且它与Fe Y R的结合亲和力比活性最高的同种型(IgGl)低约一个数量级(十倍)。与天然Fcy4相比，具有Leu235Ala突变的Fcy4变体应表现出極微的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcy1也表现出比天然Fcy1低得多的效应子功能。这些Fe变体都比天然存在的人IgG Fe更适于制备hGH融合蛋白。在非溶解Fe的制备中也可引入其它替换，而不危及循环半衰期或导致不良的构象变化。本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于PCR, DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。表达载体可采用市售的例如但不限于pcDNA3、pIRES、pDR, pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CH0，C0S细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括I)提供编码融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO 17序列);2)将I)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996 ;86 :338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-P AGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA, HAl, c_Myc，6_His或8_His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如O. 000001-90wt% ;较佳的O. l-50wt%;更佳的，5-40wt%)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。药学上可接受的载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约O. 00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的O. 0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。本发明融合蛋白的优点如下I.延长GH的循环半衰期和/或增加生物活性。2.血清中药物浓度波动的减少，安全性提高，耐受性的改善。 3.含有非溶解Fe变体的hGH-L-vFc融合蛋白能显著地有助于治疗因内源性生长激素分泌不足的成长缺失，以及特纳综合症引起的体型矮小，慢性肾功能衰竭，Prader-WilIi综合症,特发性体型矮小等病症。4.降低注射频率，使患者有更好的生活品质。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I构建编码hGH-L-vFcY2融合蛋白编码的基因I.制备含人-生长激素的基因序列质粒hGH-L-vFcY2融合蛋白编码序列是由数个DNA片段组合而成的。含有人GH的前导肽和成熟蛋白编码的基因的制备，系根据NCBI参考序号NM_000515. 3所载人-生长激素的基因序列用人工合成方法制备。合成方法是先沿着hGH基因的双链DNA序列从5’终端向3’终端行进，制备四个上下链交替、长度约为180个碱基的寡核苷酸片段。每个片段的终端分别与下一个互补链片段的终端含有约20个碱基的互补重叠序列。其后再将此四个寡核苷酸片段，用聚合酶链式反应技术(PCR)组合成长度约为650碱基的核苷酸片段。为了便于克隆，所合成基因的两端将含有限制性酶内切位点。表I列出了用于克隆hGH-L-vFc融合蛋白的寡核苷酸序列。表I
权利要求
1.一种重组hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白从N端到C端依次含有人GH、肽接头和人IgG Fe变体， 并且所述的人IgG Fe变体选自下组 (i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl 绞链区、CH2 和 CH3 区域。
2.如权利要求I所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于人GH和人IgG Fe变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
3.如权利要求I所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 18,20或22所示。
4.如权利要求I所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-I位氨基酸残基的hGH前导肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。
5.如权利要求I所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白，其特征在于，所述的hGH-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似或更高的体外生物活性、更长的半衰期。
6.一种编码权利要求I所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白的DNA分子。
7.—种CHO衍生细胞株，其特征在于，所述细胞在其生长培养基中在每24小时内，产生超过10 μ g/百万个细胞的如权利要求1-5任一所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白。
8.如权利要求7所述的CHO衍生细胞株，其特征在于，在生长培养基中，每24小时内，产生超过30 μ g/百万个细胞的如权利要求1-5任一所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白。
9.如权利要求7所述的CHO衍生的细胞株，其特征在于，它含有编码hGH-L-vFc融合蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO :17、19或21所示的核苷酸序列。
10.一种制备权利要求I所述重组融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤 (a)在融合蛋白在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过10yg/106(百万)个细胞的条件下，培养权利要求7所述的细胞株；和 (b)纯化步骤(a)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似的或更高的体外生物活性，更长的半衰期。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在于人GH和人IgGFe变体之间有2-20个氨基酸的柔性肽；且所述柔性肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO :18、20 或 22 所示。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-I位氨基酸残基的hGH前导肽之后的SEQ ID NO : 18、20或22所示的氨基酸序列。
14.一种提高含有人GH、柔性肽接头和人IgG Fe变体的重组融合蛋白的表达量的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)将编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系； (b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达融合蛋白；和 (c)纯化步骤(b)表达的融合蛋白， 其中重组融合蛋白是hGH-L-vFc融合蛋白，其特征为表现出极高的体外生物活性，SP在摩尔基础上，具有与人GH类似或更高的体外生物活性和更长的半衰期；其中在人GH和IgG Fe变体间存在含有约2-20个氨基酸的柔性肽接头；和柔性肽接头含有2个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；和其中人IgG Fe变体含有选自以下的人 IgG 的绞链区、CH2 和 CH3 区域Pro331Ser 突变的人 IgG2 ；Ser228Pro 和 Leu235Ala 突变的人 IgG4 ;和 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突变的人 IgGl。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO :18、20 或 22 所示。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的编码融合蛋白的DNA具有SEQIDNO :17、19或21所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种长效重组人生长激素的Fc融合蛋白。本发明的人生长激素的Fc融合蛋白(hGH-L-vFc融合蛋白)含有人生长激素、约2-20个氨基酸的柔性肽接头、和人IgG Fc变体。本发明的Fc变体无裂解性，且显示极小的不良Fc-介导的副作用，还公开了一种高表达水平制备或产生这类融合蛋白的方法。本发明的hGH-L-vFc融合蛋白表现出血清半衰期延长，且生物活性增加，从而改善药物动力学和药效，在治疗时间内所需的注射次数较少。
文档编号C12N5/10GK102875683SQ201110193210
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者金宜慧, 刘瑞贤, 周若芸, 严孝强, 王宇鹏, 李强, 孙乃超 申请人:旭华(上海)生物研发中心有限公司