专利名称：一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法。
背景技术：
毛头鬼伞(Coprinus comatus)是近年来人工开发生产的一种具有商业潜力的珍稀食用菌新品，其性平味甘，有益脾胃、清神宁智、增食欲及治疗痔疮等功效，还具有一定的降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等生物学功能，所以被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为集“天然、营养、保健”三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一。毛头鬼伞多糖具有较高的免疫活性，可以调节机体的特异性和非特异性免疫。 毛头鬼伞多糖也具有较高的抗肿瘤活性，能抑制肿瘤的生长，具有预防和治疗癌症的潜在价值。硒(Se)是人体必需的一种微量元素，具有多种重要的生理功能，硒的摄入量不足与克山病、大骨节病、心血管疾病、肿瘤等许多疾病的发生有关。人体获取硒主要从食物中吸收，食物来自于农产品，农产品从土壤中吸收硒，而土壤缺硒是世界上广泛存在的问题， 地球土壤的自然含硒量一般也只有0. 1 2. 0 μ g/g，平均为02 μ g/g。我国恰恰处在全球的缺硒带。目前，补硒剂主要有两类，一是无机硒，如亚硒酸钠、硒酸钠；二是有机硒，包括有机硒制剂、富硒地区出产的天然产物，以及人工生物转化的各种动、植物和微生物产品。目前，生物体内主要的含硒物质是含硒氨基酸构成的硒蛋白，除此之外，硒还能与多糖和核酸结合，形成含硒多糖和含硒核酸，它们与硒蛋白一起构成生物内主要的含硒生物大分子物质，其中硒多糖作为目前的一个广泛关注的研究热点。而目前还没有关于毛头鬼伞硒多糖提取方面相关报导。
发明内容
本发明的第一个目的旨在提供一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法。本发明的目的是通过以下技术措施来实现的一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其包括以下步骤(1)采用深层发酵法，制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体；(2)取步骤(1)中的新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体进行勻浆后用微波处理破壁；(3)向所述步骤(2)中的勻浆液中加入2 3倍体积的水，进行浸提；(4)浸提液经去除残渣后，浓缩，去除蛋白；( 将去除蛋白后的溶液装入透析袋中进行透析，然后加入3 4倍体积无水乙醇进行醇沉，将醇沉物于干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。本发明所述步骤(1)推荐的具体方法是1)取毛头鬼伞菌菌种于斜面培养基培养得到毛头鬼伞菌斜面菌种；2)取步骤1)中的毛头鬼伞菌斜面菌种接种到摇瓶培养基中进行摇床培养得到液体菌种；
3)取步骤幻中所得的液体菌种转接入含硒盐的发酵培养基中进行发酵至发酵液透明，气味清香，按湿重计算菌丝体生物量为20 30g/L，pH为5 7时，停止发酵，得到富硒毛头鬼伞菌丝体。本发明推荐的所述步骤1)中的斜面培养基的配方为土豆150 300g，葡萄糖 15 30g，蛋白胨 1. 5 3g, KH2PO4I 3g, MgSO4 · 7Η20 0· 5 1. 5g, VB1O. 01 0. 03g，琼脂15 30g，蒸馏水lOOOmL，pH自然；培养温度为25 30°C。本发明所述步骤幻中的摇瓶培养基推荐的配方为土豆150 300g，葡萄糖15 30g,蛋白胨 2 4g，KH2PO4I 3g, MgSO4 · 7Η20 0· 5 1. 5g, VB1O. 01 0. 03g,蒸馏水 IOOOmL, pH自然。所述的斜面菌种的接种量为0. 5 1. Ocm2菌落面积的菌丝。本发明推荐的所述步骤2)的摇床培养的培养条件为摇床转速100 150r/min， 温度25 ^°C，装液量与容器体积比为1 2 3，培养时间3 4d。本发明推荐的所述步骤幻中的发酵培养基的配方为葡萄糖20 30g，玉米粉 20 40g，花生粕 2 6g，KH2P042 4g，MgSO4 · 7H20 0· 5 1. 5g, VB1IO 20Xl(T3g， Na2Se034 6X 10_3g，蒸馏水lOOOmL，pH自然；所述的液体菌种接种量为3 5%。本发明中的斜面培养基、摇瓶培养基和发酵培养基在配制好后进行灭菌处理，然后再接种菌种，以保证得到的得到的富硒毛头鬼伞菌丝体无其他杂菌污染。所述的灭菌处理采用现有的常规灭菌方式进行即可。本发明所述步骤幻的发酵培养推荐的培养条件为生物反应器温度25 ^°C， 通气量6 lOL/min，培养时间5 6d。在此条件下，不仅适合于毛头鬼伞菌自身的生长， 而且能让毛头鬼伞菌处于良性生长状态中，可以充分地吸收元素硒，利于菌体富集微量元素硒，并且也不会伤害毛头鬼伞菌菌体，使生物量保持在较高的水平范围。本发明所述步骤幻中发酵的放罐质量标准为发酵液透明，气味清香，菌丝体生物量(湿重)为20 30g/L，富硒率为80 85%，pH 5 7，且无任何杂菌污染。本发明所述步骤O)中微波处理的时间为6 lOmin，采用常规微波设备进行处理。本发明所述步骤(3)中所述的勻浆液加入水后在90 100°C温度下浸提2 4h。本发明所述步骤中所述的浸提液于7000 9000r/min离心，去除残渣，上清液浓缩至原来的1/3后，采用Sevag法去除蛋白，得到去除蛋白后的溶液。本发明所述步骤(5)中去除蛋白后的溶液透析的时间为M 48h ；所述的醇沉在 0 4°C温度下进行，醇沉的时间为M 36h ；所述的醇沉物于35 45°C鼓风干燥。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)本发明利用毛头鬼伞菌对微量元素硒的富集与转化能力，将毛头鬼伞多糖与硒相结合，所得毛头鬼伞硒多糖，兼具二者的生物学功能。(2)本发明采用液态深层发酵法培养富硒毛头鬼伞菌丝体，与固态发酵法相比，具有生产周期短，没有杂菌感染，生物量和富硒率的相对稳定，因而产品质量稳定。本发明易于机械化生产，自动化管理控制。
图1是本发明毛头鬼伞菌硒多糖的工艺流程方框图。
图2是实施例--的毛头鬼伞硒多I害鉴定的紫外光谱图。
图3是实施例--的毛头鬼伞硒多I害鉴定的红外光谱图。
图4是实施例二二的毛头鬼伞硒多I害鉴定的紫外光谱图。
图5是实施例二二的毛头鬼伞硒多I害鉴定的红外光谱图。
图6是实施例三Ξ的毛头鬼伞硒多I害鉴定的紫外光谱图。
图7是实施例三Ξ的毛头鬼伞硒多I害鉴定的红外光谱图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。实施例一(1)制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体1)按下述配方配制斜面培养基，灭菌后，接种经活化的毛头鬼伞菌种，在28V温度下培养至斜面上长满新鲜的毛头鬼伞菌。斜面培养基配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g， VB1O. Olg，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制摇瓶培养基，灭菌后，挑取0. 5cm2菌落面积的毛头鬼伞斜面菌种的菌丝，接种到三角瓶摇瓶培养基中，摇床转速lOOr/min，温度25°C，装液量 75mL/250mL，培养3d，得液体菌种；摇瓶培养基的配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1O. 01g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反应器中配制250L发酵培养基，然后进行灭菌。灭菌完成后将所得的液体菌种按接种量3% (ymm/ymm+&mimm)接种于发酵培养基中于温度 25°C，无菌空气通气量6L/min的条件下，培养时间5d，得富硒毛头鬼伞菌丝体，按湿重计算菌丝体生物量为23. 5g/L，富硒率为80. 3%。发酵培养基的配方为葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1IOXKT3g, Na2Se034X l(T3g，蒸馏水 1000ml，pH 自然。(2)将新鲜的菌丝体勻浆后用微波处理6min。(3)将勻浆液加入2倍体积的水，于90°C浸提4h。(4)将浸提液于7000r/min离心IOmin后，去除残渣，上清液浓缩至原来的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)将去除蛋白后的溶液装入透析袋中透析24h后，加入3倍体积无水乙醇于0°C 醇沉Mh，将醇沉物于35°C鼓风干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。(6)通过紫外光谱和红外光谱对所得毛头鬼伞硒多糖进行鉴定，结果参见图2 3。实施例二(1)制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体1)按下述配方配制斜面培养基，灭菌后，接种经活化的毛头鬼伞菌种，在25V温度下培养至斜面上长满新鲜的毛头鬼伞菌。斜面培养基配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g，VB1O. Olg，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制摇瓶培养基，灭菌后，挑取0. 75cm2菌落面积的菌丝，接种到三角瓶摇瓶培养基中，摇床转速150r/min，温度，装液量IOOmLASOmL,培养3d，得液体菌种；摇瓶培养基的配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1O. 01g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反应器中配制250L发酵培养基，然后进行灭菌。灭菌完成后将所得的液体菌种按接种量4% (ymm/ymm+&mimm)接种于发酵培养基中于温度 ^°C，无菌空气通气量8L/min的条件下，培养时间5d，得富硒毛头鬼伞菌丝体，按湿重计算菌丝体生物量为Mg/L，富硒率为85%。发酵培养基的配方为葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg, VB1IOXlO^g, Na2Se034. 5Xl(T3g，蒸馏水 1000ml, pH 自然。(2)将新鲜的菌丝体勻浆后用微波处理8min。(3)将勻浆液加入3倍体积的水，于100°C浸提浊。(4)将浸提液于9000r/min离心IOmin后，去除残渣，上清液浓缩至原来的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)将去除蛋白后的溶液装入透析袋中透析4 后，加入3倍体积无水乙醇于4°C 醇沉36h，将醇沉物于40°C鼓风干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。(6)通过紫外光谱和红外光谱对所得毛头鬼伞硒多糖进行鉴定，结果参见图4 5。实施例三(1)制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体1)按下述配方配制斜面培养基，灭菌后，接种经活化的毛头鬼伞菌种，在30°C温度下培养至斜面上长满新鲜的毛头鬼伞菌。斜面培养基配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g， VB1O. 01g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制摇瓶培养基，灭菌后，挑取1. Ocm2菌落面积的菌丝，接种到三角瓶摇瓶培养基中，摇床转速150r/min，温度25°C，装液量75πι ν250ιΛ，培养4d，得液体菌种；摇瓶培养基的配方为土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg, VB1O. 01g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反应器中配制250L发酵培养基，然后进行灭菌。灭菌完成后将所得的液体菌种按接种量5% (ymm/ymm+&mimm)接种于发酵培养基中于温度 25°C，无菌空气通气量lOL/min的条件下，培养时间5d，得富硒毛头鬼伞菌丝体，按湿重计算菌丝体生物量为24. 8g/L，富硒率为83.9%。其中发酵培养基的配方为葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 ·7Η20 lg，VB1IOXKT3g, Na2Se035X l(T3g，蒸馏水 1000ml，pH 自然。(2)将新鲜的菌丝体高速勻浆后用微波处理lOmin。(3)将勻浆液加入3倍体积的水，于95°C浸提池。
(4)将浸提液于8000r/min离心IOmin后，去除残渣，上清液浓缩至原来的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)将去除蛋白后的溶液装入透析袋中透析3 后，加入3倍体积无水乙醇于4°C 醇沉30h，将醇沉物于45°C鼓风干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。(6)通过紫外光谱和红外光谱对所得毛头鬼伞硒多糖进行鉴定，结果参见图6 7。上述实施并不限制本发明的保护范围，所有在不偏离本发明精神的基础上所做修改和改进，均属于本发明要求保护范围。
权利要求
1.一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤(1)采用深层发酵法，制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体；(2)取步骤(1)中的新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体进行勻浆后用微波处理破壁；(3)向所述步骤(2)中的勻浆液中加入2 3倍体积的水，进行浸提；(4)浸提液经去除残渣后，浓缩，去除蛋白；(5)将去除蛋白后的溶液装入透析袋中进行透析，然后加入3 4倍体积无水乙醇进行醇沉，将醇沉物于干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。
2.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)深层发酵法的具体方法是1)取毛头鬼伞菌菌种于斜面培养基培养得到毛头鬼伞菌斜面菌种；2)取步骤1)中的毛头鬼伞菌斜面菌种接种到摇瓶培养基中进行摇床培养得到液体菌种；3)取步骤幻中所得的液体菌种转接入含硒盐的发酵培养基中进行发酵至发酵液透明，气味清香，按湿重计算菌丝体生物量为20 30g/L，pH为5 7时，停止发酵，得到富硒毛头鬼伞菌丝体。
3.根据权利要求2所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，本发明推荐的所述步骤幻中的发酵培养基的配方为葡萄糖20 30g，玉米粉20 40g，花生粕2 6g， KH2P042 4g, MgSO4 · 7H20 0· 5 1. 5g, VB1IO 20X 10、，Na2Se034 6X l(T3g，蒸馏水 IOOOmL, pH自然；所述的液体菌种接种量为3 5%。
4.根据权利要求3所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，本发明所述步骤3)的发酵培养推荐的培养条件为生物反应器温度25 ^°C，通气量6 lOL/min，培养时间5 6d。
5.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中微波处理的时间为6 lOmin。
6.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述的勻浆液加入水后在90 100°C温度下浸提2 4h。
7.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中浸提液于7000 9000R/min离心，去除残渣，上清液浓缩至原来的1/3后，采用Sevag法去除蛋白，得到去除蛋白后的溶液。
8.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中去除蛋白后的溶液透析的时间为M 48h。
9.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述的醇沉在 0 4°C温度下进行，醇沉的时间为M 36h。
10.根据权利要求1所述的毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其特征在于，所述的醇沉物于；35 45 °C鼓风干燥。
全文摘要
本发明公开了一种毛头鬼伞菌硒多糖的制备方法，其包括以下步骤(1)采用深层发酵法，制备新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体；(2)取步骤(1)中的新鲜的富硒毛头鬼伞菌丝体进行匀浆后用微波处理破壁；(3)向所述步骤(2)中的匀浆液中加入2～3倍体积的水，进行浸提；(4)浸提液经去除残渣后，浓缩，去除蛋白；(5)将去除蛋白后的溶液装入透析袋中进行透析，然后加入3～4倍体积无水乙醇进行醇沉，将醇沉物于干燥后，得毛头鬼伞硒多糖。本发明利用毛头鬼伞菌对微量元素硒的富集与转化能力，将毛头鬼伞多糖与硒相结合，所得毛头鬼伞硒多糖，兼具二者的生物学功能。
文档编号C12R1/645GK102286568SQ20111019410
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月12日 优先权日2010年11月26日
发明者余杰, 崔鹏举, 杨明泉, 覃焕达, 贾爱娟 申请人:广东美味鲜调味食品有限公司