骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，具体涉及骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
背景技术：
I.骨髓间质干细胞功能
骨髓中包含两种完全不同的干细胞造血干细胞和间质干细胞(mesenchymal stemcellS，MSCS)，前者维持造血，而后者则构成了骨髓造血的微环境。这两种独立而且完全不同的干细胞不仅共存而且在功能上互相协作，共同完成成人体内血液系统的再造。除骨髓夕卜，其他组织也存在少量MSCs，但成人中骨髓中含量最多，约占其有核细胞0. 001 0. 01%,因此骨髓是较为适合的MSCs来源。1970年Friedenstein通过成纤维细胞集落形成单位试验在体外证明了 MSCs的存在；经过长期的研究，人们对其功能已有了比较深入的了解。骨髓MSCs为多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞；在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs对多种损伤组织具有替代修复作用，植入体内后可在多种造血以外的组织如肺、骨、软骨和皮肤等处定位和分布。除了分化作用外，骨髓MSCs还具有较强的免疫调控能力，对T、B、树突状细胞和NK细胞均有调节性抑制作用。研究表明，MSCs可抑制T细胞增殖，引起T细胞分化停滞，并可抑制T细胞活化,下调相应肽段对幼稚性(naive)及记忆性抗原特异T细胞效应,诱导T细胞失能(anergy);此外MSCs还可诱导产生调节性T细胞来进行调控。MSCs可抑制B细胞增殖(B细胞/MSCs为1:1时作用最强，而达1:5或1:10时作用消失)，抑制B细胞分化并影响B细胞趋化(与MSCs共培养后B细胞表达趋化因子CXCR4、CXCR5和CXCR7受体减少，从而出现趋化能力缺陷)。对于树突状细胞，MSCs可抑制其增殖及分化成熟，可阻止单核细胞和骨髓前体细胞分化为树突状细胞，抑制⑶la、⑶40、⑶80、⑶86及HLA-DR上调，使细胞维持未成熟状态；MSCs还可改变其细胞因子分泌能力，从而影响树突状细胞功能。MSCs同样能够抑制NK细胞的增殖，其表面存在多种成分可影响NK细胞活化(包括NKG2D配体如MICA、ULBPs 和 DNAM-I 配体如 PVR、nectin-2)。2.间质干细胞应用现状
MSCs可在造血干细胞niche中分泌细胞因子起支持作用，并且降低外周血单个核细胞同种免疫刺激活性，从而促进造血干细胞移植后造血系统重建。2000年，首项临床试验显示，28例女性乳腺癌患者在接受自体造血干细胞移植时给予MSCs单次输注，其造血恢复加快且无副反应。2005年另一项多中心研究也显示46例患者同时行异基因造血干细胞和MSCs治疗后多数造血恢复加快，未发现副作用。
2004年，Le Blanc报道首个MSCs治疗移植物抗宿主病(GVHD)病例，患儿为淋巴细胞白血病患者，MSCs由其母亲提供，于造血干细胞移植70天和170天时分别输注I次，患儿症状改善，胆红素水平下降。2008年，Le Blanc报道了 MSCs治疗重度难治性GVHD II期临床研究结果，共治疗55例患者，结果30例患者完全缓解，另9例部分缓解。目前III期研究正在进行中。MSCs可同时修复心肌和血管组织、具有免疫调节活性，并且具有易培养扩增满足移植需要的特点，这使其在心血管疾病治疗中存在理论价值，目前已应用于心肌梗塞、心肌缺血、心功能衰竭的治疗。经心肌直接注入是最常用的治疗方式，初步研究显示可改善心脏射血分数，提高患者生存率，但其疗效和安全性尚有待对照研究加以证实。
MSCs在神经系统疾病(如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化)、成骨不全、皮肤创伤也有一些初步应用。由于MSCs的靶向性，在动物研究中已有用于肿瘤治疗的报道。3.自身免疫性疾病常规治疗
自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫应答反应导致组织器官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。是临床上常见的一大类疾病，目前已被公认的自身免疫性疾病至少有30多种。根据自身免疫反应对组织器官造成损伤的范围，通常将自身免疫病分器官特异与非器官特性两大类。临床上常见的自身免疫性疾病包括结缔组织疾病类风湿关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬皮病(SSC)、系统性血管炎；神经肌肉疾病多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、脱髓鞘疾病；内分泌性疾病原发性贤上腺皮质萎缩、慢性甲状腺炎、青少年型糖尿病；消化系统疾病慢性非特异性溃疡性结肠炎(Crohn病)、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎缩性胃炎；泌尿系统疾病自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合征；血液系统疾病自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜(ITP)、特发性白细胞减少症。自身免疫性疾病的常规治疗方法有
(I)肾上腺皮质激素是多数自身免疫性疾病最常用的治疗药物，具有较快抑制免疫反应和较强的抗炎作用。近年采用的激素冲击疗法提高了危重症的缓解率，但是激素也有不少副作用，长期应用可以抑制下丘脑-垂体-肾上腺系统，垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素的量明显减少，使肾上腺皮质素分泌减少，皮质腺出现萎缩，从而患者需要长期服用激素维持治疗，并且他们的应激能力减弱，容易出现感冒及各种感染，在受到外伤、冷风刺激、精神刺激、手术治疗其它疾病等应激状态时，由于体内激素的分泌不足，一方面可能诱发自身免疫性疾病发生或加重，另一方面会出现疲乏无力，食欲减退，低血糖反应，肌肉关节疼痛等肾上腺皮质分泌激素不足的症状。此外，激素还可导致肥胖、多毛、高血压、青光眼、糖尿病、消化道溃疡、出血、精神症状、骨质疏松、股骨头坏死等。(2)免疫抑制剂自身免疫反应对多数自身免疫性疾病的发生发展有密切关系，除激素外，临床工作中往往还需应用I 一数种免疫抑制剂以控制患者病情发展。常用的免疫抑制剂有环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯等，这些药物的主要副作用有胃肠道反应、血液系统损害、泌尿系统反应、影响生育、脱发、增加肿瘤发生率等。大剂量人体免疫球蛋白静脉注射通过抗体封闭作用治疗激素和免疫抑制剂不能控制的难治性患者，国内外均有成功经验，但此法对不同的病人疗效差异很大，也有一定的毒副作用，价格昂贵，应用受限。(3)造血干细胞移植尽管给予了激素和免疫抑制剂治疗，仍有不少病人病情得不到控制或不能耐受常规治疗带来的严重不良反应，这促使临床工作者不断探索新的治疗方法。造血干细胞移植(HSCT)是近十余年来发展起来的一项治疗手段，在治疗自身免疫性疾病时主要采用了自体HSCT方式，其治疗原理有两方面，一是在预处理时，通过大剂量化疗或全身照射摧毁患者的异常免疫系统，对自身免疫性疾病起缓解作用；二是移植的自体外周血干细胞以重建正常的免疫系统，在免疫重建中阻断自身抗体的产生或诱导对自身抗原的免疫耐受。根据最新统计，目前全世界有近1000例难治性自身免疫性疾病患者接受了HSCT，其中包括SSc 190例，SLE 86例，PM/DM 14例，RA 86例，MS 368例，克罗恩病21例。由于自体免疫疾病自体HSCT后仍有部分患者病情不能控制，部分病例在术后复发，加之移植治疗风险较高，相关死亡率约为7 %，高于非自身免疫性疾病(3 % )，制约了该技术的广 泛应用。移植相关死亡率与具体病种相关，从高到低依次为SSc、SLE、MS和RA ;病例选择、支持治疗、预处理方案、是否去移植物中的淋巴细胞等也影响患者的存活率。

发明内容
本发明的目的是提供骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。所述的自身免疫性疾病是指包括系统性红斑狼疮、系统性硬化症、混合性结缔组织病、类风湿关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、炎性肠病、白塞病、原发性胆汁性肝硬化等在内的一大类疾病。本发明中，所述自身免疫性疾病尤其是指系统性硬化症、克罗恩病、多发性肌炎/皮肌炎、难治性自身免疫性溶血性贫血、混合性结缔组织病、类风湿关节炎、白塞病或原发性胆汁性肝硬化。所述的骨髓间质干细胞以如下方法制备
(1)取髂后上棘为穿刺点，用肝素稀释液接入穿刺针接口，缓慢抽取骨髓，并用PBS稀
释；
(2)向淋巴细胞分离液(Ficoll)中加入经过步骤(I)所述骨髓的稀释液,离心后，吸出灰白色的淋巴细胞，然后用PBS洗涤；
(3)在37°C、5%CO2、饱和湿度CO2培养箱中，将步骤(2)得到的淋巴细胞，用含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液培养，24 h后首次换液，去掉非贴壁细胞，以后每三天以L-DMEM完全培养液换液。(4)培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代，用PBS洗涤细胞，用胰酶消化，PBS洗涤后，置37°C、5 %C02、饱和湿度CO2培养箱培养中用L-DMEM完全培养液培养。(5)取各代骨髓间质干细胞测定细胞表面标记并测定其核型，得具有间质干细胞特征且染色体核型正常的骨髓间质干细胞。 发明人通过调研大量的案例，发现自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在异常，在疾病的发生发展中起重要作用。例如系统性红斑狼疮患者的骨髓MSCs体外生长较正常人缓慢，易衰老，传代过程(10代)中活力会逐渐丧失，白细胞介素6、7mRNA表达降低，并且MSCs存在细胞骨架异常。发明人最近的研究又发现系统性红斑狼疮骨髓MSCs体外向脂肪及软骨细胞的分化能力较正常明显降低，移植到裸鼠体内成骨也明显下降。另外，还发现系统性红斑狼疮患者的骨髓MSCs和正常人外周血单个核细胞在体外共培养时，刺激调节性T细胞(Treg)上调的能力也明显低于正常MSCs。由于自身免疫性疾病患者存在MSCs异常，因此，自身免疫性疾病不仅是“造血干细胞病”，而且也是“间质干细胞病”。这也是为什么自体HSCT治疗自身免疫性疾病复发率高的原因，而异体HSCT存在的高排斥反应、高死亡率和高费用又限制了它的临床应用。因为骨髓MSCs有独特的免疫调节和修复作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病药物中。本发明提出骨髓MSCs在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。采用骨髓MSCs制备获得的治疗自身免疫性疾病的药物与自身免疫性疾病常规治疗药物相比较，具有以下优点骨髓MSCs作为治疗自身免疫性疾病药物的活性成分，有独特的免疫调节和修复作用，用于治疗自身免疫性疾病具有“治疗方便、疗效持久”的特点，能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用，甚至可能停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善患者生活质量；同时，以骨髓MSCs为活性成分的治疗自身免疫性疾病的药物较其他新型的生物制剂费用低，多数患者具有相应的经济能力。因此骨髓MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。


图I和图2表示克罗恩病患者骨髓MSCs移植前后肠镜变化，其中图I表示移植前罗恩病患者肠镜照片，图2表示移植后半月罗恩病患者肠镜照片；
图3和图4表示皮肌炎患者骨髓MSCs治疗前后肌肉核磁共振(MRI)变化，其中图3表示骨髓MSCs治疗前皮肌炎患者肌肉MRI，图4表示骨髓MSCs治疗后皮肌炎患者肌肉MRI。
具体实施例方式实施例I骨髓间质干细胞体外分离、培养 (一)细胞的来源
用于输注治疗自身免疫性疾病患者的MSCs来源于异体骨髓单个核细胞经体外扩增培养而成。(二)细胞的采集
I所用设备，材料，试剂
超净工作台、层流洁净床、肝素、注射用生理盐水、一次性空针和骨髓穿刺包。2骨髓的采集方法
(I)紫外线消毒超净工作台30 min。(2)超净台内配置肝素-生理盐水以I ml生理盐水加入65. 5 U的肝素。(3)骨髓捐献者俯卧于层流洁净床上，取髂后上棘为穿刺点，常规消毒铺洞巾，用骨髓穿刺针穿刺，固定后，20ml注射针管抽肝素稀释液5ml，接入穿刺针接口，缓慢抽骨髓至20ml刻度处，共抽取2支空针。(三)骨髓MSCs分离与培养 I所用设备、材料和试剂
超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、水平式离心机、恒温水浴箱、高压蒸气灭菌锅、细胞培养皿(HO Cm)、离心管(50ml)和吸管(5ml，IOml)。、
淋巴细胞分离液(Ficoll) L-DMEM培养液、肽牛血清、PBS液和胰酶。2骨髓MSCs原代分离、培养
(1)取50ml离心管2支，每管加入骨髓液20ml，用PBS稀释一倍待用；
(2)取50ml离心管4支，每管加入20 ml Ficoll淋巴细胞分离液(比重I. 077);
(3)沿管壁缓慢向淋巴细胞分离液(Ficoll)中加入经过稀释后的骨髓液，每管加稀释骨髓液20ml ；
(4)将步骤3中所得混合物离心(常温2000rpm, 30min)；
(5 )用吸管插入步骤(4)所得样品的中间淋巴细胞层，轻轻吸出灰白色的淋巴细胞至另一离心管中，加PBS至40 ml，混匀，离心(常温1000 rpm，5min)后弃上清，PBS重复洗涤一次;
(6)将分离的细胞用L-DMEM完全培养液(含10%胎牛血清)调整细胞浓度为5X IO6个细胞/ml，然后接种于培养皿中，置37°C、5% CO2、饱和湿度CO2培养箱培养；
(7)24 h后首次换液，去掉非贴壁细胞，以后每3d以L-DMEM完全培养液换液。3骨髓MSCs传代
(1)培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代；
(2)吸除培养皿内旧培养液，加入PBS，轻轻摇动培养皿，以洗去残留在内的培养液，吸除 PBS ；
(3)培养皿内加入胰酶2ml，轻轻摇动培养皿，使消化液流遍所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即加入完全培养液2ml终止消化；
(4)反复吹打瓶壁细胞，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液；
(5)将细胞悬液吸入离心管，离心(常温1000rpm，5min)，弃上清，PBS稀释后洗涤弃上
清；
(6 )用L-DMEM完全培养液调整细胞浓度为5X IO6个细胞/ml，然后接种于培养皿中，每瓶8 ml ;置37°C、5 %C02、饱和湿度CO2培养箱培养。(7)传至第三代(P3)时收集细胞备用。4骨髓MSCs细胞冻存
(1)消化贴壁细胞，步骤同3中的(I)-(5)；
(2)加入0.Iml 二甲基亚砜(DMS0)，0. 9ml胎牛血清，移入细胞冻存管；
(3)冻存细胞(4°C，1小时;-20°C，4小时;-70°C，12小时，液氮罐保存)。5骨髓MSCs细胞复苏
(1)取出冻存管，立即放入37°C水浴中，摇动，Imin内迅速解冻；
(2)吸管吸出细胞悬液，放入50ml离心管，加入40ml
(3)离心(常温1000rpm, 5min),弃上清，重复一次；
(4)加入L-DMEM完全培养液接种于培养皿中，
(四)骨髓MSCs的鉴定
I细胞总数 测量并确定细胞悬液的总体积。充分混匀后，吸取0. Iml细胞悬液滴于细胞计数板上，计数。计算出细胞总数。2活细胞比例进行台盼蓝染色，计数采集细胞中活细胞所占比例。3流式细胞仪检测细胞表面标志 取各代骨髓MSCs用与异硫氰荧光素(FITC)(中文名，全称)或藻红蛋白(PE)标记的⑶14、⑶29、⑶34、⑶44、⑶45、⑶105作用，流式细胞仪检测。结果显示⑶14、⑶14和⑶45为阴性，⑶29、⑶44和⑶105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。4骨髓MSCs染色体核型测定
取各代骨髓MSCs，培养上清中加入秋水仙素使其最终浓度为liig/ ml，继续培养30min,弃上清，1%枸橼酸钠低渗液处理50min,用固定液(甲醇冰乙酸3:1)固定,原位收获细胞，45°C烤片过夜，胰酶法G显带。每例标本计数15个中期分裂相，分析5个核型。该染色体核型检测结果显示正常染色体核型。
实施例2骨髓MSCs的给药方法 (一)骨髓MSCs使用前最终鉴定 I无菌试验
如培养过程中未出现任何异常，常规在骨髓MSCs输注患者前3天，最后一次换液后，对每一培养瓶中的上清液作无菌试验，培养细菌和霉菌。无菌试验按《中国生物制品规程(1995)))的规定进行。细胞上清液不得有细菌、霉菌生长。2外观及镜下观察
在输注的当天，如无菌试验报告无细菌、霉菌生长，对培养瓶中的上清液进行颜色观察，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞密度、有无细菌或霉菌生长。如有可疑，须再次抽样作无菌试验培养细菌、霉菌。3活细胞比例
输注当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95%以上。4染色体核型
骨髓MSCs输注前3天抽样行染色体核型检查应为正常染色体核型。5表面标志
骨髓MSCs输注前3天抽样行表面标志测定⑶14、⑶34、⑶45表达阴性KD29、⑶44、CD45表达阳性。(二)骨髓MSCs的给药方法 I所用设备，材料，试剂
超净工作台离心机一次性注射器注射用生理盐水人血白蛋白 2输注前操作
当细胞总数量达到(I 2) X 107kg体重，可考虑输注准备
⑴输注前抽样留取细胞培养上清液作细菌、真菌培养、支原体检测及内毒素测定；
[2)输注前抽样取细胞，计数细胞浓度、活细胞比例、细胞表面标志、细胞染色体核型测定，具体见骨髓MSCs的鉴定。3输注操作
[I]胰酶消化所有细胞(操作同前)，离心(常温1000 rpm，5min)，弃上清，反复充分洗涤；加入含5%人血白蛋白的生理盐水100ml，输注的细胞悬液中仅残留不足0. 5%的细胞培养液。抽取0. Iml细胞悬液计数。标明患者姓名，准备输注。[2:1细胞输注前半小时给患者静脉甲强龙40mg。[31开放手背静脉，用输血器输入少量生理盐水，通畅后连接装有细胞的分离袋，调
整输注速度，输注过程中观察患者反应，及时对症处理。整个过程耗时约15分钟。
实施例3骨髓MSCs在制备治疗不同自身免疫性疾病的药物中的应用 (一)骨髓MSCs在制备治疗系统性硬化症的药物中的应用
I.病例入选标准I)确诊为系统性硬化症，2)已用激素和I种以上免疫抑制剂治疗半年以上，无明显疗效者，3)签署知情同意书同意MSCs治疗。2.排除标准1)患者存在严重的感染，2)疾病终末期，已出现重要脏器功能严重受损。3.移植方案骨髓MSCs静脉输入，细胞数为I X 106/kg体重。4.治疗评价共治疗6例患者，其中男性4例。移植前、移植后I月、3月、12月对患者内脏损伤及皮肤硬化记分进行评估，结果显示患者心、肺、肾功能保持稳定，皮肤积分逐步改善，皮肤溃瘍愈合加速。5.典型病例
汪XX，女，45岁，因“双手指肿胀、僵硬七年伴胸闷、气喘半年”入院(2008-01-15)。患者七年前无明显诱因下出现双手遇冷发白、发紫现象，觉双手麻木，渐出现对称性手指肿胀僵硬，手指皮肤绷紧感，伴手指间关节晨僵、疼痛，症状逐渐加重，于本院诊断“系统性硬化症”，一直给予强的松、爱若华口服，环磷酰胺0. 4g静脉滴注，半月余一次，双手指间关节疼痛渐消失，症状无进展。近半年出现“面具脸”，半年前始出现无诱因下心慌，并出现活动后胸闷、气喘，夜间平卧觉呼吸困难，渐出现双下肢、足踝处浮肿，伴腹胀、纳差等不适，查体见面部、颈项皮肤可见少量毛细血管扩张，双下肢浮肿，左下肢可见皮肤溃破，双手指肿胀，指端紫绀，皮肤弹性减退，握拳受限，辅检示抗核抗体颗粒型强阳性，抗RNP阳性，心脏彩超提示肺动脉高压87mmHg。患者先后行血浆置换三次并联合激素、CTX治疗疗效不佳，于2008-01-23行异基因骨髓间质干细胞移植术(供体为患者丈夫)，共输细胞数6 X 107，术后患者皮肤变软，左下肢皮肤溃破较前变浅。(二)骨髓MSCs在制备治疗克罗恩病的药物中的应用
I.病例入选标准1)确诊为克罗恩病，2)已采用常规方法(激素和I种以上免疫抑制齐U)治疗半年以上，疗效不佳者，3)签署知情同意书同意MSC治疗。2.排除标准并发严重感染的患者。3.移植方案骨髓MSCs静脉输入，细胞数为I X 106/kg体重。4.治疗评价共治疗3例患者，均为男性。移植前、移植后I月、3月、12月对患者症状进行评估，并进行肠镜检查。结果显示患者腹痛、腹泻症状减轻，肠部溃疡愈合，一例肠瘘患者分泌物明显减少。5.典型病例
陈X，男性，27岁，因“双髋疼痛十二年，反复解稀糊便半年”入院(2008-04-17)。患者十余年前无明显诱因出现腰骶部、髋部关节疼痛，静止休息时较严重，活动后稍有改善，后病情进展，关节疼痛加重，并有眼炎发作，骶髂关节X线示轻度骶髂关节炎，诊断为“强直性脊柱炎”，给予“甲氨喋呤、英太青、美卓乐、柳氮磺胺吡啶、益赛普”等治疗，2007年10月出现反复腹泻，大便呈稀糊样，3-7次/天，量中，伴下腹部饱胀感，便后减轻，肠镜提示多发溃疡、糜烂，诊断“克罗恩病”。于2008年4月24日行异基因骨髓间质干细胞移植术(供体为患者母亲)，共输细胞数6. 5X 107，术后无腹痛腹泻，复查电子肠镜显示横结肠至回肠末端处有多枚息肉形成，息肉大小不等，部分息肉表明溃烂，较入院前有明显好转。患者于2008年4月30日出院。出院后一周患者无腹痛腹泻症状，复查电子肠镜显示回肠末端轻度息肉样增生，降结肠部分区域间质水肿，未见其他异常(如图I和图2)。(三)骨髓MSCs在制备治疗多发性肌炎/皮肌炎的药物中的应用
I.病例入选标准1)确诊为多发性肌炎/皮肌炎，2)已用激素和I种以上免疫抑制剂治疗半年以上，无明显疗效者，3)签署知情同意书同意骨髓MSCs治疗。2.排除标准1)患者存在严重的感染，2)疾病终末期，已出现重要脏器功能严重受损。3.移植方案骨髓MSCs静脉输入，细胞数为I X 106/kg体重。4.治疗评价共治疗3例患者，其中男性2例。移植前、移植后I月、3月、12月对患者肌力、皮损情况进行评估，并行肌酶、肌肉MRI检查判断肌肉炎症有无变化。结果显示患者治疗后肌无力症状改善，肌酶迅速下降并保持稳定。5.典型病例
朱X X，男，21岁，因“反复四肢乏力伴皮疹一年余，加重一周”入院(2008-06-23)。患者一年余前受凉后感鼻塞流涕，其后出现心悸胸闷，心电图示心动过速，心肌酶谱CK-MB41U/L, CK496U/L，肌钙蛋白阴性。随后出现双下肢水肿、乏力，查CK-MB 74U/L、CK2372U/L，超声心动图大致正常，甲状腺功能正常，予利尿、营养心肌等治疗好转。一年前出现额头、双颊水肿性红疹，皮疹为片状，高出皮面，无搔痒疼痛，皮疹间皮肤发红，皮疹无破溃，肌电图提示肌源性改变，诊断为“皮肌炎”，一年来反复出现肌酶升高，最高达4000u/L左右，除激素外曾使用“骁悉、环磷酰胺冲击、血浆置换”等治疗，效果不显著，一周前感活动后四肢乏力加重，右小腿酸痛明显，入院后查体右下肢肌力2级，肌肉压痛( + )，左下肢肌力
3级，肌张力正常，上肢肌力 4—级，辅查示ALT 241.9U/L，AST 171.8U/L，GGT 475. 2U/L,LDH1032U/L, CK 2007U/L, CK-MB 156U/L, a -HBDH 828. 9U/L (2008-06-25)。于2008年7月4日行异基因骨髓间质干细胞移植术(患者父亲供髓)，共输细胞数为8X 107，术中无不适，术后I月，MRI示肌肉病变基本恢复正常(如图3和图4，治疗前肌肉炎症明显，如箭头所示)。随访情况如下表。目前此患者已能正常上学。权利要求
1.骨髓间质干细胞在制备治疗多发性肌炎和皮肌炎药物中的应用。
2.根据权利要求I所述骨髓间质干细胞在制备治疗多发性肌炎和皮肌炎药物中的应用，所述的骨髓间质干细胞按照如下方法制备 (1)取髂后上棘为穿刺点，用肝素稀释液接入穿刺针接口，缓慢抽取骨髓，并用PBS稀释； (2)向淋巴细胞分离液中加入经过步骤(I)所述骨髓的稀释液液，离心后，吸出灰白色的淋巴细胞，然后用PBS洗涤； (3)在37°C、5%CO2、饱和湿度CO2培养箱中，将步骤(2)得到的淋巴细胞，用含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液培养，24 h后首次换液，去掉非贴壁细胞，以后每三天以L-DMEM完全培养液换液； (4)培养至贴壁细胞90%融合时，进行传代，用PBS洗涤细胞，用胰酶消化，PBS洗涤后，置37°C、5 %C02、饱和湿度CO2培养箱培养中用L-DMEM完全培养液培养； (5)取各代骨髓间质干细胞测定细胞表面标记并测定其核型，得具有间质干细胞特征且染色体核型正常的骨髓间质干细胞。
全文摘要
本发明公开了骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。自身免疫性疾病患者的骨髓间质干细胞存在异常，在疾病的发生发展中起重要作用。骨髓间质干细胞有独特的免疫调节和修复作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病药物中。
文档编号C12N5/0775GK102631368SQ201210061129
公开日2012年8月15日 申请日期2009年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者冯学兵, 孙凌云, 张华勇 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院