一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨组织再生和骨整合修复领域，具体而言，涉及一种应用于骨修复重建的负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥及其制备方法。
【背景技术】
[0002]口腔颁面部是人体重要的解剖部位，颁骨组织是构成人体面部容貌的支架，其结构复杂，血运丰富，关系着面部美观及口腔咀嚼功能的实现。然而，由于先天性畸形、外伤、感染、肿瘤等原因造成的骨缺损是临床上的常见疾病。目前，骨组织再生与重建的方法主要包括自体骨移植、异体或异种骨移植和组织工程等方法。同时，在颁骨缺损修复基础上往往需要进行牙种植等口腔功能的重建，因此，对口腔颁面部再生骨组织的速度和质量都有一定的要求。经典的组织工程方法采用种子细胞、支架材料和生长因子组合修复缺损部位，具有准确重建原有组织形态及体积的优点，已取得了一定的效果。然而，目前对于体外培养的种子细胞应用于临床患者仍存在较大的争议。分析其原因，现有种子细胞在体外培养中可能存在变异、污染、短时间内难以获得大量细胞等问题。因此，组织工程骨构建时，如何获得大量的干细胞，创造有利于新骨快速形成和成熟的干细胞微环境，尤其是充分调动自体干细胞的参与，对于实现大块颁骨组织的再生尤为重要。
[0003]自固化磷酸钙骨水泥(CPC)具有良好的生物相容性和骨传导性、生物安全性，能任意塑形，在固化过程中具有等温性，目前该材料已成功通过IV期临床试验，广泛应用于骨组织缺损修复的临床治疗中。
[0004]天然骨组织是由细胞、纤维和基质成分组成，其中细胞在周围基质环境信号刺激下展开增殖、分化、合成基质和沉积矿物质等系列活动。因此，在有利于营养传输和血管化的宏观多级结构基础上，进一步从细胞角度设计，有望加强从细胞层面上对成骨活动的精确调控，从而获得更佳的骨缺损修复效果。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的在于提供一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法。
[0006]本发明第二个目的在于提供一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥。
[0007]本发明第三个目的在于提供负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥在制备颁骨修复材料中的应用。
[0008]为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案:一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，利用细胞粘附的原理，采用血液循环流通的方法，直接富集骨髓间充质干细胞于自固化磷酸钙骨水泥上。
[0009]作为一个优选方案，制备方法包括如下步骤:将自固化磷酸钙骨水泥放入干细胞富集器的过滤芯内，干细胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，启动蠕动泵，循环过滤，过滤芯内即为负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥。
[0010]作为一个优选方案，所述循环过滤的时间是10 — 20分钟。
[0011]为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案:一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥，其特征在于，通过以下方法制备获得:将自固化磷酸钙骨水泥放入干细胞富集器的过滤芯内，干细胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，启动蠕动泵，循环过滤，过滤芯内即为负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥。
[0012]为实现以上第三个目的，本发明公开以下技术方案:负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥在制备颁骨修复材料中的应用。
[0013]本发明的优点在于:(I)本发明通过细胞粘附这一简单有效的方法提高磷酸钙骨水泥中骨髓间充质干细胞的数量；(2)直接富集自体骨髓间充质干细胞于三维支架材料上，干细胞不通过体外扩增，避免了细胞扩增中可能产生的变异、污染等问题；(3)本发明提供的负载自体富集骨髓干细胞的自固化磷酸钙骨水泥，可以显著促进颁骨缺损的骨修复，磷酸钙骨水泥已被国家卫生部门批准可以应用于临床骨再生治疗，对于该治疗方法的施行提供了可能。
【附图说明】
[0014]图1为打开过滤器组件，取下过滤芯，并打开过滤器盖。
[0015]图2为连接血袋，准备引流骨髓血。
[0016]图3为控制骨髓血的流入和气体的排除。
[0017]图4为引流完成，关闭二通旋塞开关。
[0018]图5为将硅胶管嵌入蠕动泵中，启动循环过滤。
[0019]图6为异位成骨效果(左图为负载富集骨髓干细胞的CPC，右图为负载未经富集的骨髓干细胞的CPC )。
[0020]图7为犬下颁骨缺损修复(A为颁骨缺损，B为负载富集骨髓干细胞的CPC填充骨缺损区)。
[0021]图8为Micro CT(左图为负载富集骨髓干细胞的CPC，右图为未负载细胞的CPC)。
[0022]图9为犬下颁骨缺损骨修复情况(苦味酸品红染色，深红色区域为新生骨，A为负载富集骨髓干细胞的CPC，B为未负载细胞的CPC)。
[0023]图10为负载富集骨髓干细胞磷酸钙骨水泥填充颁骨缺损区。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0025]实施例1.负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法利用细胞粘附的原理，采用血液循环流通的方法，直接富集骨髓间充质干细胞于自固化磷酸钙骨水泥上。
[0026]实验中采用干细胞富集器进行操作，包括如下步骤:将自固化磷酸钙骨水泥放入干细胞富集器的过滤芯内，干细胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，启动蠕动泵，循环过滤，过滤芯内即为负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥。
[0027]实验中优选的一种方案包括如下具体步骤:
1、选定干细胞丰富的部位(如髂骨)，利用骨穿针对准预定穿刺部位进行穿刺，完成后拔出针芯；
2、连接真空抽吸注射器和骨穿针手柄，利用真空抽吸注射器抽取50-100mL骨髓血，并注射到含抗凝剂的血袋中备用；
3、取干细胞过滤富集器，取下过滤器组件按图1依次打开过滤器组件，将CPC材料放入干细胞过滤富集器的过滤芯内中，并重新将过滤器组件连接复位；
4、将整套产品固定，并放置于相应的支撑架，并用引流管连接装有骨髓血的血袋，如图2位置所示；
5、引流开始时，三通旋塞的开关转动至图3所示位置，控制骨髓血的流入和气体的排出；
6、待所需的骨髓血全部进入器械后，按图4所示位置关闭三通旋塞的开关；
7、完成骨髓血的引流后，将干细胞过滤富集器的硅胶管段(即图5所示部分)嵌入蠕动泵泵头中，并固定好其余部件的位置，启动蠕动泵，按规定时间、频率开始进行循环过滤；
8、蠕动结束后，取下干细胞过滤富集器，打开过滤器组件，取出负载富集自体骨髓干细胞的CPC。
[0028]本发明采用华东理工大学自主研发的磷酸钙骨水泥，可向上海瑞邦生物有限公司购买，其已获得国家药品监督管理局准生产批文。本发明不需专门、复杂和昂贵的设备，操作流程简单，有利于推广使用。
[0029]实施例2.负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥在颁骨修复中的应用
分别将负载未经富集的骨髓干细胞的CPC和负载富集骨髓干细胞的CPC埋入裸鼠皮下，8周后取材，观察CPC的异位成骨效果。结果显示负载富集骨髓干细胞的CPC较分别将负载未经富集的骨髓干细胞的CPC好。
[0030]图6为异位成骨效果(左图为负载富集骨髓干细胞的CPC，右图为负载未经富集的骨髓干细胞的CPC )。
[0031]犬下颁骨缺损修复试验:在犬的下颁骨制造20mmX8mm的颊舌侧缺损，分别将未负载细胞的CPC和负载富集骨髓干细胞的CPC填充入骨缺损区(见图7)，4个月后取材，观察下颁骨缺损修复的效果。结果显示:1) Micro显示负载富集骨髓干细胞的CPC较未负载细胞的CPC与周围骨组织的融合性较好(见图8) ;2)苦味酸品红染色显示显示负载富集骨髓干细胞的CPC较未负载细胞的CPC有更多的新骨形成(见图9)。这提示着显示负载富集骨髓干细胞的CPC较未负载细胞的CPC的成骨能力较强。
[0032]临床病例:将负载富集自体骨髓干细胞的CPC填充颁骨缺损区(图10)，并缝合粘膜创口。
[0033]患者术后I周行颁骨全景片及CBCT检查，术后3个月行颁骨全景片检查，术后6个月行颁骨全景片和CBCT检测。
[0034]本发明不仅适用于根尖囊肿的缺损修复，对颁骨角化囊肿、囊性成釉细胞瘤等囊肿也同样适用。
[0035]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，例如改变抽取骨髓的部位，抽取骨髓的体积量，富集的时间，以及自固化磷酸钙骨水泥的规格等，这些改进也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，利用细胞粘附的原理，采用血液循环流通的方法，直接富集骨髓间充质干细胞于自固化磷酸钙骨水泥上。
2.根据权利要求1所述的一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤:将自固化磷酸钙骨水泥放入干细胞富集器的过滤芯内，干细胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，启动蠕动泵，循环过滤，过滤芯内即为负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥。
3.根据权利要求2所述的一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥的制备方法，其特征在于，所述循环过滤的时间是10 — 20分钟。
4.一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥，其特征在于，通过以下方法制备获得:将自固化磷酸钙骨水泥放入干细胞富集器的过滤芯内，干细胞富集器的引流管中通入骨髓血引流，启动蠕动泵，循环过滤，过滤芯内即为负载富集骨髓间充质干细胞自固化磷酸钙骨水泥。
5.权利要求4所述的负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥在制备颁骨修复材料中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种负载富集骨髓间充质干细胞的自固化磷酸钙骨水泥及制备方法，利用细胞粘附的原理，采用血液循环流通的方法，直接富集骨髓间充质干细胞于自固化磷酸钙骨水泥上。本发明的优点在于：（1）本发明通过细胞粘附这一简单有效的方法提高磷酸钙骨水泥中骨髓间充质干细胞的数量；（2）直接富集自体骨髓间充质干细胞于三维支架材料上，干细胞不通过体外扩增，避免了细胞扩增中可能产生的变异、污染等问题；（3）本发明提供的负载自体富集骨髓干细胞的自固化磷酸钙骨水泥，可以显著促进颌骨缺损的骨修复，磷酸钙骨水泥已被国家卫生部门批准可以应用于临床骨再生治疗，对于该治疗方法的施行提供了可能。
【IPC分类】A61L27-38, A61L27-12
【公开号】CN104587523
【申请号】CN201410254518
【发明人】蒋欣泉, 张志愿, 吴玉琼, 张秀丽
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年6月10日