甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量pcr检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法及应用，该方法以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的核苷酸序列为模板，设计扩增SPCSV-WAcp基因的特异性引物和特异性CSV探针，提取感病甘薯叶片的总RNA；用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链，然后用CSV-CP-P2引物反转录合成cDNA第一链，利用CSV-CP-P1进行PCR扩增反应；通过优化反应条件，建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该方法最低可检测到约3.31拷贝/μL的阳性质粒，灵敏度高。本发明可用于田间甘薯样品的检测，为SPCSV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。
【专利说明】甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】中的病毒检测方法，特别是涉及一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法及应用。
【背景技术】
[0002]甘薯裡绿矮化病毒(Sweetpotato chlorotic stunt virus, SPCSV)为长线形病毒科(Closteroviridae )毛形病毒属(Crinivirus)病毒,是侵染甘薯的主要病毒之一。SPCSV基因组为双组分单链正义RNA，大小17kb左右。根据血清学关系和核苷酸序列，SPCSV可划分为东非(EA)和西非(WA)2个株系，目前侵染我国甘薯的主要是西非株系。SPCSV与甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotato featherymottle virus, SPFMV)共同侵染甘薯,可引起甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease, SPVD)的发生。
[0003]SPVD对甘薯产量影响极大，严重时可造成90%以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯上的毁灭性病害。目前，广东、江苏、四川、安徽等主要甘薯产区均有SPCSV和SPVD的发生和危害，该病毒在我国甘薯产区有扩散蔓延的趋势。目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附(ELISA)技术和PCR技术。ELISA技术存在灵敏度低、特异性差等问题，而普通的PCR方法不能对病毒进行定量分析。另外，由于甘薯植株体内富含胶质、多酚和多糖等物质，这些物质会干扰NCM-ELISA和常规RT-PCR的检测效果，导致结果的误判。为了克服这些干扰，需先将待检测甘薯样品嫁接到指示植物巴西牵牛上，待巴西牵牛发病后，再对巴西牵牛进行检测，费时费力。
[0004]实时突光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)技术是近几年发展起来的一种新型核酸定性、定量技术，既有普通PCR灵敏、快速的特点，又可实时监测，已应用于多种植物病毒的检测。目前尚无SPCSV实时荧光定量PCR检测方法的研究报道，如何利用实时荧光定量PCR技术，建立SPCSV高效灵敏的检测技术，加强对SPCSV的早期监测预警，对SPVD的防控具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题:提供一种简便、快速、灵敏的甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法；
本发明还提供了 PCR检测方法在检测甘薯褪绿矮化病毒中的应用。
[0006]本发明的技术方案:
一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤:
(I)以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的核苷酸序列为模板，设计扩增SPCSV-WAcp基因的特异性引物CSV-CP-Pl和CSV-CP-P2，在SPCSV-WA cp基因内部设计特异性引物CSV-DLl、CSV-DL2和特异性CSV探针，设计的引物和探针序列分别为:
CSV-CP-Pl:ATGGCTGATAGCACTAAAGTCGA ；CSV-CP-P2:TCAACAGTGAAGACCTGTTCCAG ；
C SV-DLl:5/ -GACTCAGATTTGGAAACTAA-3':
CSV-DL2:5; -TGGAGAATTGGAATATACTTG-3':
CSV 探针:FAM-5' -AACTACAGTCCGAGTATGCGTCTC-3' -BHQl ；
(2)病毒RNA的提取和RT-PCR
用柱式总RNA抽提试剂盒，提取感病甘薯叶片的总RNA ;用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链，用于实时荧光定量PCR检测；
然后用CSV-CP-P2弓丨物反转录合成cDNA第一链，利用正向引物CSV-CP-Pl进行PCR扩增反应，以得到SPCSV-WA的标准质粒DNA ；
(3)实时荧光定量PCR方法的建立
以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的标准质粒DNA为模板，荧光定量PCR扩增反应体系为20 μ L，包括标准质粒DNA模板2 μ L，预混酶Premix Ex Taq?10 μ L，ROXReference Dye 110.4 μ L，正向引物 CSV-DLl 和反向引物 CSV-DL2 各为 0.4 μ L，CSV 探针0.4 μ L，其中正向引物、反向引物和探针的浓度均为IOymol / L，用灭菌DEPC水补足20 μ L ;同时设立未加模板的空白对照试验； 荧光定量PCR扩增反应程序为:95°C预变性30s，95°C变性5s，55°C退火30s，72°C延伸30s并采集荧光，共40个循环。
[0007]所述标准质粒DNA模板由以下方法制备:利用常规RT-PCR方法扩增出SPCSV-WA的外壳蛋白CP基因序列，该基因序列全长774bp ;将CP基因克隆到PMD19-T上，经测序验证正确后获得SPCSV-WAcp基因的重组质粒；用分光光度计测定重组质粒的浓度和纯度，根据阿伏伽德罗常数计算出重组质粒的拷贝数为3.31 X 101°拷贝/ μ L，对重组质粒进行10倍连续梯度稀释，获得10倍浓度差的质粒，即质粒浓度为KT1~10_1(1，作为标准质粒的DNA模板。
[0008]所述用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链时的反转录反应体系为10 μ L:包括2 μ L5 XM-MLV Buffer, I μ L 浓度为 25mmol / L 的 MgCl2、I μ L 浓度为 IOmmol / L 的 dNTP混合物、0.5 μ L浓度为10 μ mol / L的反向引物CSV_DL2、0.25 μ L浓度为40U / μ L的抑制剂、0.5μ L浓度为200U / μ L的反转录酶M-MLV，4.75 μ L甘薯叶片的总RNA ；
反转录反应条件:42°C反转录40min, 95°C 5min, 5°C 5min。
[0009]所述利用正向引物CSV-CP-Pl进行PCR扩增反应时的PCR扩增反应体系为50 μ L，包括:10XExTaq缓冲液5yL、2.5mol / L dNTP混合物2 μ L、浓度均为IOymol / L的正向引物CSV-CP-Pl和反向引物CSV-CP-P2各I μ L、浓度为5U / μ L的ExTaqDNA聚合酶
0.25 μ L，用5 μ L反转录产物作模板，补充ddH20至反应体系至50 μ L ;
PCR扩增反应条件:94 °C变性lmin，56 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、UVP凝胶成像系统观察和照相，得到SPCSV-WA的标准质粒DNA。
[0010]所述荧光定量PCR扩增反应后，得到的荧光定量PCR的标准曲线为:Y=-3.239Χ+40.193。
[0011 ] 所述的PCR检测方法在检测甘薯褪绿矮化病毒中的应用。
[0012]本发明的积极有益效果:(I)本发明以SPCSV-WA外壳蛋白(CP)基因的保守区域设计特异性引物和探针，建立了检测SPCSV-WA的实时荧光定量PCR方法。该方法检测的灵敏性高，最低可检测到约3.31拷贝/ UL的阳性质粒，比常规PCR方法高1000倍，而且特异性强，重复性好。该方法对田间样品的SPCSV-WA检出率显著高于NCM-ELISA和常规RT-PCR方法，在一定程度上弥补了ELISA和传统PCR检测方法的不足。
[0013](2)本发明建立了荧光定量PCR检测方法的标准曲线，标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.239和1，扩增效率为103.568% ;该方法只能检测到目的病毒，能定量检测单个拷贝数的病毒，可作为甘薯病毒互作机制研究的高效工具，具有较高的实用价值。
[0014](3)本发明的PCR检测方法可用于田间甘薯样品的检测，对加强SPCSV的早期监测预警和流行学研究提供了技术手段，对SPVD的防控具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1SPCSV-WA CP 基因 RT-PCR 扩增结果；
图中，M:DL2000分子量标记；1-2 =SPCSV-WA CP ；3:空白对照；
图2SPCSV荧光定量PCR扩增动力学曲线；
图中，1~6:模板量依次为 3.31Χ108、3.31Χ107、3.31Χ106、3.31Χ105、3.31 X ΙΟ4、3.31 XlO3Copies.μ L-1 ;7:空白对照；
图3SPCSV荧光定量PCR的标准曲线；
图4荧光定量PCR灵敏性试验的扩增曲线；
图中I~10:模板量依次为3.31 X IO9~3.31 X 1O0Copies.μ L—1 ；11:空白对照；
图5常规PCR灵敏度试验；
图中 M:DL2000 ；1 ~10:模板量依次为 3.31 X 1O9 ~3.31 X IOciCopies.μ L-1 ；11:空白对照；
图6荧光定量PCR特异性试验的扩增曲线；
图中1:标准品(阳性对照)；2:含SPFMV CP基因的重组质粒；3:含SPVG CP基因的重组质粒；
4:含SPLV CP基因的重组质粒；5:含SPVMV CP基因的重组质粒；6:空白对照。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法 I材料与方法
1.1质粒和甘薯病毒材料
分别含有甘薯 羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus, SPLV)、甘薯 G 病毒(Sweet potato virus G, SPVG) >甘薯脉花叶病毒(Sweetpotato vein mosaic virus, SPVMV)外壳蛋白(CP)基因的四种重组质粒，用于荧光定量PCR的特异性检验，这4种重组质粒均由本实验室构建并保存；
分别在浙江、四川、江苏等地采集具有典型SPVD症状的甘薯茎蔓，栽种于防虫温室中，用于硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)、常规RT-PCR和实时荧光定量PCR三种方法检测效果的比较。[0017]主要试剂与仪器
SPCSV硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定(NCM-ELISA)检测试剂盒，购自国际马铃薯中心(CIP) ;UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒，为上海生工生物工程公司产品；RNase抑制剂、M-MLV反转录酶、TaqDNA聚合酶、Premix Ex TaqTM预混酶，购自大连宝生物技术公司，其它试剂为国产分析纯。
[0018]ABI7500型荧光定量PCR仪，NanoVue PLUS超微量分光光度计，为美国GE公司产品；DNA测序由上海生工生物工程公司完成。
[0019]引物和探针的设计及合成
根据GenBank中登录的SPCSV核苷酸序列(登录号:FJ807785)，设计扩增SPCSV-WA cp基因的特异性引物CSV-CP-Pl和CSV-CP-P2。在SPCSV-WA cp基因内部设计一对特异性引物CSV-DL1、CSV-DL2和一条特异性探针，用于荧光定量检测SPCSV，引物和探针均由大连宝生物技术公司合成，其序列见表1。
[0020]表1引物和探针序列
【权利要求】
1.一种甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的核苷酸序列为模板，设计扩增SPCSV-WAcp基因的特异性引物C SV-CP-Pl和CSV-CP-P2，在SPCSV-WA cp基因内部设计特异性引物CSV-DLl、CSV-DL2和特异性CSV探针，设计的引物和探针序列分别为:
CSV-CP-Pl:ATGGCTGATAGCACTAAAGTCGA ；
CSV-CP-P2: TCAACAGTGAAGACCTGTTCCAG ；
CSV-DLl:5/ -GACTCAGATTTGGAAACTAA-3'；
CSV-DL2:5/ -TGGAGAATTGGAATATACTTG-3'；
CSV 探针:FAM-5' -AACTACAGTCCGAGTATGCGTCTC-3' -BHQl ； (2)病毒RNA的提取和RT-PCR 用柱式总RNA抽提试剂盒，提取感病甘薯叶片的总RNA ;用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链，用于实时荧光定量PCR检测； 然后用CSV-CP-P2弓丨物反转录合成cDNA第一链，利用正向引物CSV-CP-Pl进行PCR扩增反应，以得到SPCSV-WA的标准质粒DNA ； (3)实时荧光定量PCR方法的建立 以甘薯褪绿矮化病毒西非株系SPCSV-WA的标准质粒DNA为模板，荧光定量PCR扩增反应体系为20 PL，包括标准质粒DNA模板2 μL，预混酶Premix Ex WmIO μL,ΚΟΧ ReferenceDye II 0.4 μL，正向引物CSV-DL1和反向引物CSV-DL2各为0.4 μL，CSV探针0.4 μL，其中正向引物、反向引物和探针的浓度均为lOMmol/L，用灭菌DEPC水补足20 μL ;同时设立未加模板的空白对照试验； 荧光定量PCR扩增反应程序为:95°C预变性30 s，95°C变性5 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s并采集荧光，共40个循环。
2.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征是:所述标准质粒DNA模板由以下方法制备:利用常规RT-PCR方法扩增出SPCSV-WA的外壳蛋白CP基因序列，该基因序列全长774 bp ;将CP基因克隆到pMD19-T上，经测序验证正确后获得SPCSV-WA cp基因的重组质粒；用分光光度计测定重组质粒的浓度和纯度，根据阿伏伽德罗常数计算出重组质粒的拷贝数为3.31 X 101°拷贝/μL，对重组质粒进行10倍连续梯度稀释，获得10倍浓度差的质粒，即质粒浓度为10_卜10_1(1，作为标准质粒的DNA模板。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征是:所述用CSV-DL2引物反转录合成cDNA第一链时的反转录反应体系为10 μι:包括2PL 5XM-MLV BufferUμL浓度为25mmol/L的MgCl2、lPL浓度为10mmol/L的dNTP混合物、0.5PL浓度为10Mmol/L的反向引物CSV-DL2、0.25μL浓度为40U/^L的抑制剂、0.5μL浓度为200U/^L的反转录酶M-MLV，4.75μL甘薯叶片的总RNA ； 反转录反应条件:42°C反转录40 min, 95°C 5 min, 5°C 5 min。
4.如权利要求1-3任一项所述的实时荧光定量PCR检测方法，其特征是:所述利用正向引物CSV-CP-Pl进行PCR扩增反应时的PCR扩增反应体系为50 μL，包括.AQXExTaq缓冲液5 μL,2.5 mo I/L dNTP混合物2 μL、浓度均为10Mmol/L的正向引物CSV-CP-Pl和反向引物CSV-CP-P2各I PL、浓度为5 U/ μ L的ExTi^DNA聚合酶0.25 μL,用5μL反转录产物作模板，补充ddH20至反应体系至50 μL ； PCR扩增反应条件:94°C变性I min，56°C退火30 s，72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10 min ;扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、UVP凝胶成像系统观察和照相，得到SPCSV-WA的标准质粒DNA。
5.如权利要求4所述的PCR检测方法，其特征是:所述荧光定量PCR扩增反应后，得到的荧光定量PCR的标准曲线为:Y= - 3.239Χ + 40.193。
6.权利要求1-5任一项所述的PCR检测方法在检测甘薯褪绿矮化病毒中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK103937908SQ201410121827
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】张振臣, 王丽, 张德胜, 王爽, 乔奇, 秦艳红, 田雨婷, 王永江 申请人:河南省农业科学院植物保护研究所