兼具核酸外切和单链dna交换活性的重组酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的通过人工合成的重组酶，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，以及其所组成的组合物和试剂盒。本发明还公开了其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，采用该新型重组酶所进行的将外源基因克隆至载体靶位点的方法，准确率更高,更为简单方便,更为快速,稳定性更好,且多片段链接一步成功率更高。
【专利说明】兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子克隆【技术领域】，具体涉及一种新型的兼具核酸外切和单链DNA交 换活性的通过人工合成的重组酶及其应用。
【背景技术】
[0002] DNA克隆和亚克隆以当今生物技术产业和分子生物学为基础，如今市场上将若干 个DNA片段连接起来以及将目的片段克隆到目标载体靶位点的需求一直持续不断，传统的 将外源基因导入载体靶位点中的方法通常包括以下几个步骤：（1)首先要用一种或多种限 制性内切酶将载体进行酶切，将载体线性化；(2)用碱性磷酸酶处理线性载体防止连接过 程中载体的重新环化；（3)利用引物进行外源DNA的PCR扩增反应；(4)利用同样的限制性 外切酶处理扩增后的外源DNA产物并纯化；（5)将载体与外源DNA连接；（6)将连接产物转 化到受体细胞中，比如大肠杆菌，并筛选出包含目的DNA片段的重组子。传统的克隆方法繁 琐费时，克隆效率相对较低，并且受限于载体和外源基因上的的限制性酶切位点。
[0003] 近来基于重组的克隆方法已经大大加快了克隆的速度，Pentao Liu等（2003)阐 述了一种不依靠限制性内切酶和连接酶，只利用S coli噬菌体同源重组来获得基因敲除 产物的重组方法,该方法利用噬菌体红蛋白及重组酶Cre、Flpe通过空缺修复把来自于BAC 人工染色体中的DNA导入高拷贝的质粒中，进而将LoxP, FRT位点融合到亚克隆DNA中，此 方法中的同源区域长度超过45-55bp。和其他重组方法类似，这一方法依靠于宿主细胞中特 异性表达的噬菌体蛋白与载体之间的特异序列区域，因此受限于特殊的载体和宿主细胞。
[0004] 另一个基于重组克隆的例子是由Clonetech Laboratories开发的In-Fusion? PCR试剂盒，该试剂盒可以在无任何限制性内切酶和连接酶的情况下，将任意片段导入任意 线性载体中，此款In-Fusion?系列通过将引物末端加上15bp的与线性载体末端同源的碱 基，进而把PCR产物的末端插入到线性载体的同源序列中。这种方法首先要对线性载体、 PCR产物以及酶的混合物进行30分钟孵育，再转化到大肠杆菌中。此方法中的In-Fusion 酶可以将双链DNA产物转变成单链，并融合到线性载体的同源序列中。此种方法不受宿主 细胞与载体限制，即可实现PCR产物的快速克隆，但是由于In-Fusion酶的专有性，因此制 约了 In-Fusion? PCR试剂盒以及Clonetech公司生产的其他类似试剂盒的使用。
[0005] 而最新的案列是GenScript公司所开发的CloneEZ?试剂盒，基于之前的专利，此 方法是利用一种含有核酸外切酶和单链DNA结合蛋白的酶复合物来实现的同源重组方法。 但酶混合物的选用，依然无法克服克隆效率和稳定性的问题。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种兼具核酸外切和单链DNA 交换活性的新型重组酶，以及其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，采用该新型重组 酶将外源基因克隆至载体靶位点的方法，本方法准确率更高，更为简单，使用方便，更为快 速，且具有更高的克隆效率和稳定性。
[0007] 本发明所提供的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的新型重组酶，其特征在于， 具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0008] 本发明还提供了一种所述重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合 物。
[0009] 所述组合物包含所述酶，以及反应缓冲液，所述反应缓冲液配比为： 50-500mM Tris-HCl, pH7. 5 10-50mM MgCl2 50-200mM KCl IO-IOOmM (NH4)2SO4 0· 01-0. 2% BSA。
[0010] 本发明还提供了所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，其特征在 于，具体包括如下步骤： 1) 延长外源DNA :将外源DNA的两条引物5'端和3'端分别加上与线性载体末端序列 一致的，且核苷酸长度> 12bp的碱基序列； 2) 将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系； 3) 孵育反应体系以获得中间产物； 4) 将中间产物进行细胞转化，从而获得转化细胞； 5) 培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子。
[0011] 步骤1)所述的延长外源DNA通过聚合酶链式反应（PCR)来制备。
[0012] 步骤3)所述的孵育温度为22-25°C，时间20-40分钟。
[0013] 步骤4)所述的转化细胞为ToplO大肠杆菌感受态细胞。
[0014] 步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下： a. 5 μ 1加入至50 μ I ToplO大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置20分钟； b. 42 °C加热90秒钟后，再在冰上放置5分钟； c. 加入945 μ 1带有Amp抗性的LB培养基，37°C振荡培养40分钟； d. 以5000rpm的速度离心3分钟，倒掉上清液，取20 μ 1铺板，得到含有外 源DNA的单克隆抗体。
[0015] 本发明还提供了一种用于克隆外源基因至载体靶位点的试剂盒，所述试 剂盒包含：组成成分以及使用这些组合成分的说明书；所述的组成成分包括： 1) 线性载体； 2) 延长了的外源DNA :外源DNA的两条引物5'端和3'端分别加上与线性载体末端序 列一致的，且核苷酸长度> 12bp的碱基序列； 3) 所述的新型重组酶； 4) 所述的反应缓冲液。
[0016] 本发明所述的新型重组酶以及其在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，相比于 现有技术，具有如下优势： 1. 准确率高（阳性克隆>95%); 2. 简单（一种重组酶，一种反应体系）； 3. 快速（20-40分钟）； 4. 使用方便（常温使用，22-25 °C ); 5. 稳定性高； 6. 多片段连接一步成功率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明所述的重组酶的制备方法流程图； 图2为本发明所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的流程图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] 如无特别说明，本文中的所有技术和科学术语均按本发明所涉及的行业普通技术 人员普遍理解的正常含义，否则请参考标注，所有已发表的专利和引用的出版物已经在文 中详尽展示；特别指出的是，本文中的所用的"一"和"这一"如无特别说明，也包括其复数 含义。
[0020] 文中的"序列"代表着聚合物中单体的排列顺序，比如氨基酸残基在多肽中的排列 或者核苷酸在多核甘酸序列中的排列顺序，此处所说的"核苷酸序列""核酸"或者"多核苷 酸"指的是单链或者双链中的脱氧核糖核苷酸，核酸序列是由自然的核苷酸A，T，C，G，U或者 其他合成的自然碱基的类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A，鸟嘌呤缩写为G，胞嘧啶缩 写为C，胸腺嘧啶缩写为T，尿嘧啶缩写为U。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说 明，多核苷酸也包括了较长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。
[0021] 文中米用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链和左端为5'端，双链的左端 为正链5'端，从5'到3'的方向代表着转录起始的方向，与mRNA具有相同序列信息的链也 被称作编码链，靠近编码链的5'序列被称为上游序列，而在靠近3'端的称为下游序列。
[0022] 本文的"互补序列"是指与核酸序列的碱基100%互补配对的序列，而序列"一致 性"是指两条或两条以上的多肽或核苷酸序列，通过相互比较得出的相似度。"一致性"是 在进行序列比对分析时，相同氨基酸残基或者核苷酸所占的比例大小。这可以通过手工 或比对程序来完成，在进行序列比对时，一条链将作为参考链，而查询链将会与之做出比 对。在使用比对程序时，如果需要也会设计其他辅助序列，比对软件中的一些参数已经设计 好。关于一些比较理想的比对软件可参考相关文献，比如对于同源性软件在Needleman & ffunsch, .1. Mol. Biol. 48:443(1970), Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) or Pearson &Lipman, Proc. Nat ' I. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)中都有所 描述，通过计算机来操作这些程序（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)，或者肉眼鉴定。BLAST算法也是适合做序列间的一致性和相似程度的一个程序，在 Altschul et al, Moh Bioh 215:403-410 (1990)曾报道，而且进行 BLAST 比对的软 件在NCBI网站上为在线公开使用。
[0023] 本文中的"重组"代表着由被分析生物学修饰过的单核苷酸或者细胞、病毒、微生 物所编码的多核苷酸、多肽。
[0024] 实施例1兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶的制备方法 本实施例中所述的重组酶通过基因合成的方法制备，是一种人工合成的具有重组功 能的酶，此重组酶兼具核酸外切和单链DNA交换活性，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
[0025] 如图1所示，本发明所述的兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶的制备方 法具体为： 1. 合成编码本重组酶的DNA序列以及和载体酶切位点相对应的碱基序列； 2. 用NcoI和XhoI酶切，酶切反应体系和反应条件为 酶切后的DNA片段 2μ1 NcoI 2μ1 XhoI 2μ1 IOX酶反应缓冲液 5μ1 ddH20_39μ1 总体积 5〇μ1 3. 酶切载体pET-15b，酶切反应体系和反应条件与上一步相同； 4. 酶切片段用T4 DNA连接酶连接，反应中DNA片段和质粒载体的摩尔比为2:1.反 应体系和反应条件为： 酶切后的DNA片段 3μ1 酶切后的线性载体 ιμ? Τ4 DNA连接酶 ?μ? 5 X Τ4 DNA连接酶缓冲液 2μ1 ddH20_M 总体积 ιομ? 在22 °C，反应60分钟； 5. 转化入ToplO大肠杆菌感受态细胞在37°C，摇床40分钟表达； 6. 转化后的大肠杆菌表达以后，纯化得到重组酶。
[0026] 实施例2组合物 实施例1所述的重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物，包括实例1 所述的酶，以及反应缓冲液，所述反应缓冲液配比为： 50-500mM Tris-HCl, pH 7. 5 10-50mM MgCl2 50-200mM KCl IO-IOOmM (NH4)2SO4 0· 01-0. 2% BSA。
[0027] 实施例3实施例2所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用 如图2所示，具体包括如下步骤： 1) 延长外源DNA通过聚合酶链式反应（PCR)来制备：将外源DNA的两条引物5'端和 3'端分别加上与线性载体末端序列一致的，且核苷酸长度> 12bp的碱基序列；所使用的线 性载体为PUC19载体； 2) 将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系，反应中DNA片段和质粒载 体的摩尔比为2:1.具体反应体系如下： pUC19 ?μ? DNA片段 ?μ? 重组酶 ?μ? IOX酶缓冲液 2μ1 ddHoO_15μ1 总体积 2〇μ1 ; 3) 孵育反应体系以获得中间产物，孵育温度为25°C，时间30分钟； 4) 将中间产物进行细胞转化，从而获得转化细胞； 5) 培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子 其中：步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如下： a. 5 μ 1加入至50 μ I ToplO大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置20分钟； b. 42 °C加热90秒后，再在冰上放置5分钟； c. 加入945 μ 1带有Amp抗性的LB培养基，37°C振荡培养40分钟； d. 以5000rpm的速度离心3分钟，倒掉上清液，取20 μ 1铺板，得到含有外 源DNA的单克隆抗体。
[0028] 步骤1用PCR扩增获得不同长度的外源DNA片段，本实验中获得的片段长 度分别为lkb，2kb，4kb和8kb，通过上述应用所获得克隆结果如表1所示： 表1不同片段大小的外源DNA的克隆活性_
【权利要求】
1. 兼具核酸外切和单链DNA交换活性的重组酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 1所示 的核苷酸序列或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的重组酶形成的用于克隆外源基因至载体靶位点的组合物。
3. 权利要求2所述的组合物，其特征在于，包含所述重组酶，以及反应缓冲液，所述反 缓冲液配比为： 50-500mM Tris-HCl, pH7. 5 10-50mM MgCl250-200mM KC1 10-lOOmM (NH4)2S040? 01-0. 2% BSA。
4. 权利要求2或3所述的组合物在克隆外源基因至载体靶位点中的应用，其特征在 于，具体包括如下步骤： 1) 延长外源DNA :将外源DNA的两条引物5'端和3'端分别加上与线性载体末端序列 一致的，且核苷酸长度> 12bp的碱基序列； 2) 将所述的组合物、线性载体、外源DNA混合形成反应体系； 3) 孵育反应体系以获得中间产物； 4) 将中间产物进行细胞转化，获得转化细胞； 5) 培养该转化细胞，获得包含外源DNA的重组DNA分子。
5. 权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)所述的延长外源DNA通过聚合酶链 式反应（PCR)来制备。
6. 权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3)所述的孵育温度为22-25°C，时间 20-40分钟。
7. 权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4)所述的转化细胞为ToplO大肠杆菌 感受态细胞。
8. 权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4)和5)中的转化和培养条件具体如 下： a. 5 yl加入至50 yl ToplO大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置20分钟； b. 42 °C加热90秒钟后，再在冰上放置5分钟； c. 加入945 ill带有Amp抗性的LB培养基，37°C振荡培养40分钟； d. 以5000rpm的速度离心3分钟，倒掉上清液，取20 yl铺板，得到含有外源DNA的 单克隆抗体。
9. 一种用于克隆外源基因至载体靶位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：组 成成分以及使用这些组合成分的说明书；所述的组成成分包括： 1) 线性载体； 2) 延长了的外源DNA :外源DNA的两条引物5'端和3'端分别加上与线性载体末端序 列一致的，且核苷酸长度> 12bp的碱基序列； 3) 权利要求1所述的重组酶； 4) 权利要求2所述的反应缓冲液。
10. 权利要求9所述的试剂盒在克隆外源基因至载体靶位点中的应用。
【文档编号】C12N15/66GK104498451SQ201510004317
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】刁文一, 孙德斌, 杨平 申请人:苏州泓迅生物科技有限公司