基于数字pcr鉴定纯合型或杂合型mon810的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型MON810的方法，涉及分子生物学及转基因检测【技术领域】。本方法是：①收集：采用欧盟经过验证的MON810特异性转化事件以及玉米内标准基因hmgA定量检测方法；②数字PCR扩增：以MON810的DNA为研究模板；③数据分析：如果MON810特异性转化事件和玉米内标准基因hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型MON810；如果MON810特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉米内标准基因hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型MON810；本发明是一种快速、准确和可靠地鉴定纯合型和杂合型转基因抗虫玉米品系MON810绝对定量的方法。
【专利说明】基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型M0N810的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及转基因检测【技术领域】，尤其涉及一种基于数字PCR鉴定 纯合型或杂合型M0N810的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生 产，截止到2013年，世界范围内已经有27种作物涉及336个转化体在36个不同的国家和 地区获准种植或用作加工原料，种植面积已达1. 75亿公顷，其中27%的面积种植着包括多 个转化事件的基因叠加品种（James，2013,国际农业生物技术应用服务组织)。随着转基因 事件的不断增加，给各国转基因生物安全监管带来了越来越大的挑战。
[0003] 转基因产品检测标准物质是转基因生物及其产品成分检测的重要物质基础，在制 备转基因标准物质的程序和环节过程中，原材料纯合度鉴定是制备标准物质的关键环节， 目前美国油脂化学家协会(AOCS)和欧盟标准物质和度量研究所（IRMM)鉴定纯合度的方法 主要是采用传统的育种方式或实时荧光定量PCR的方法(李允静等，2013,中国农业科学)。 同时，研究发现采用传统育种方式，需要通过多年多代自交，才能获得纯合转基因材料，耗 时长，费时费力；而实时荧光定量PCR方法本身误差大，对转基因作物进行纯合度鉴定时， 误差比较大，给结果判定带来很大困难。
[0004] 数字 PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为 DNA 定量的新技术， 实现了单分子DNA绝对定量。目前在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微 生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用（李亮等，2012,生物化学与生物物理 进展)。Corbisier等采用数字PCR技术分析了转基因抗虫玉米M0N810种子粉末的外源检 测基因和&基因的拷贝数，发现采用数字PCR检测的拷贝数比值绝对定量结果，同采用 实时荧光定量PCR的方法并利用质粒DNA做标准物质对种子粉末进行相对定量的结果比 值相一致。因此提出了数字PCR具有计量特性，可以用来测量转基因相关标准物质的DNA拷 贝数比率.单分子扩增效率对于改善总DNA片段的拷贝数和短片段完整DNA的估计偏差 有显著意义。目标DNA分子在反应室的随机和独立分布是数字PCR准确定量的关键，Bhat 等认为，反应室的容量是不确定度的主要来源，并且评定的相对不确定度在6%以下，这项 发现可以用于其他数字PCR测量的置信水平研究。
[0005] 我们希望通过利用数字PCR技术，建立一种鉴定纯合型或杂合型转基因抗虫玉米 品系M0N810的方法，进而为制备标准物质或原材料的鉴定繁殖工作奠定基础，保障材料背 景的真实可靠。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就在于克服现有采用传统育种和应用实时荧光定量PCR方法鉴定 转基因材料纯合度存在的困难，提供一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型M0N810的方 法，所述的M0N810是转基因抗虫玉米品种。
[0007] 本发明的目的是这样实现的： 一、基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型M0N810的方法 ① 收集 采用欧盟经过验证的M0N810特异性转化事件以及玉米内标准基因 hmgA定量检测方 法， M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探针序列： M0N810P :5' -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3' ； 内标准基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 内标准基因 hmgA探针序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； ② 数字PCR扩增 以M0N810的DNA为研究模板，分别利用上述引物探针组合进行数字PCR扩增，将 M0N810用水稀释至5ng/ μ 1或8ng/ μ 1的浓度，在48. 770的数字芯片上分别对两个参数进 行数字PCR扩增，并收集目标分子荧光信号； ③ 数据分析 利用数字PCR仪数据分析软件对检测数据进行统计，分别计算Μ0Ν810特异性转化事 件和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间；如果Μ0Ν810品系中特异性 转化事件和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型 M0N810 ;如果M0N810品系中特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉 米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型M0N810。
[0008] 工作机理： 本方法利用数字PCR技术对单分子DNA进行绝对定量的基本工作原理，采用当前分析 化学热门研究领域的微流控方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每 个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的 反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的 体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。对转基因作物的外源基因和内标准基因分别进 行独立的扩增，根据采集到的目标荧光分子数，分别计算统计外源基因和内标基因目标分 子数，以及特异性转化事件和内标准基因目标分子数计算值的95%置信区间是否有重叠， 来鉴定转基因作物的纯合度。
[0009]二、应用 当模板量为6ng和9. 6ng时，本方法能够成功鉴定出纯合型或杂合型转基因抗虫玉米 品系 M0N810。
[0010] 与现有技术方法相比，本发明具有下列优点和积极效果： ①首次提供了利用数字PCR技术来鉴定转基因抗虫玉米品系M0N810纯合度的方法； ② 避免了利用传统育种方法筛选纯合型或杂合型转基因抗虫玉米品系M0N810耗时长 的问题； ③ 避免了利用实时荧光定量PCR方法鉴定纯合型或杂合型转基因抗虫玉米品系 M0N810误差大、结果判断困难的问题。
[0011] 总之，本发明是一种快速、准确和可靠地鉴定纯合型或杂合型转基因抗虫玉米品 系M0N810绝对定量的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是模板量为6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复1 ; 图2是模板量为6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复2 ; 图3是模板量为6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复3 ; 图4是模板量为6ng的纯合型M0N810，玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复4 ; 图5是模板量为6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复5 ; 图6是模板量为6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复6 ; 图7是模板量为6ng的纯合型M0N810，M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩增 曲线，重复1 ; 图8是模板量为6ng的纯合型M0N810，M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩增 曲线，重复2 ; 图9是模板量为6ng的纯合型M0N810，M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩增 曲线，重复3 ; 图10是模板量为6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复4 ; 图11是模板量为6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复5 ; 图12是模板量为6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复6 ; 图13是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复1 ; 图14是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复2 ; 图15是模板量为9. 6ng的纯合M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复3 ; 图16是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复4 ; 图17是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复5 ; 图18是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复6 ; 图19是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复1 ; 图20是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复2; 图21是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复3; 图22是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复4 ; 图23是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复5 ; 图24是模板量为9. 6ng的纯合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复6 ; 图25是模板量为6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复1 ; 图26是模板量为6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复2 ; 图27是模板量为6ng的杂合M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增曲 线，重复3 ; 图28是模板量为6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复4 ; 图29是模板量为6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复5 ; 图30是模板量为6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩增 曲线，重复6 ; 图31是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复1 ; 图32是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复2 ; 图33是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复3 ; 图34是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复4 ; 图35是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复5 ; 图36是模板量为6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的扩 增曲线，重复6 ; 图37是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复1 ; 图38是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复2 ; 图39是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复3 ; 图40是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复4 ; 图41是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复5 ; 图42是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810,玉米内标准基因 hmgA在微流体面板上的扩 增曲线，重复6 ; 图43是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复1 ; 图44是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复2; 图45是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复3; 图46是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复4 ; 图47是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复5 ; 图48是模板量为9. 6ng的杂合型M0N810, M0N810特异性转化事件在微流体面板上的 扩增曲线，重复6 ; 图49是数字PCR反应热图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和实施例详细说明： 1、采用CTAB法提取转基因玉米M0N810的基因组DNA 1)先将研钵和研棒在_20°C下冷冻IOh以上，同时将I. 5XCTAB提取液加热100°C，将 10%CTAB预热到56°C ;液氮研磨8. 0 g左右的转基因玉米M0N810新鲜叶片，将粉末转移至 50ml的离心管中；向离心管中加入20 ml预热的I. 5 X CTAB提取液，用玻璃棒迅速搅拌均 匀后，放到56°C水浴40 min，期间不时轻轻颠倒均匀；水浴后，冷却至室温；加入20 ml氯仿 /异戊醇（24 :1)，加盖，颠倒均勻至形成乳池状，室温下4000 r/min离心20 min ;转移上清 到新的50 ml离心管中，加入1/10体积56°C预热的10%CTAB溶液，再加入等体积氯仿/异 戊醇（24 :1)，颠倒混合30min，4000 r/min离心20 min ;转移上清至新的50ml离心管中，力口 入等体积1%CTAB析出液，轻轻混合至形成DNA絮状物，3000 r/min离心10分钟使DNA沉于 管底；弃去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上几分钟以风干沉淀，加入5 ml I M NaCl溶液 和5 μ I RNase，56°C水浴溶解DNA，过夜；加入10 ml预冷的95%乙醇，析出DNA，把DNA勾 出放到76%乙醇中浸泡30min ;转移DNA到95%乙醇中5 min，离心去掉95%的乙醇，真空干 燥；干燥后，用ImlTE溶解DNA。
[0014] 2)采用Nanodrop 2000超微量分光光度计对提取的样品进行浓度测定，用IOOng/ μ 1的XDNA作为参照，将纯合型和杂合型转基因玉米M0N810的浓度定量到lOOng/μ 1的 浓度，260/280的吸光值测定值分别为1. 84和1. 83,备用。
[0015] 2、数字PCR检测 1) 选取了经欧盟验证的Μ0Ν810转化体的特异性和内标准基因 hmgA定量检测方法， 其中M0N810特异性转化事件扩增片段大小是92bp，内标准基因 hmgA的扩增片段大小是 79bp，M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探针序列： M0N810P :5' -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3' ； 内标准基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 内标准基因 hmgA探针序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； 2) 数字 PCR 分析是在一台 BioMark HD System (Fluidigm, BioMark HD, USA) 上进行，采用48. 770数字芯片，检测及信号搜集软件为BioMark Data Collection，分 析软件为 Fluidigm Digital PCR analysis。
[0016] 数字PCR反应体积为4 μ 1，其中DNA模板量为6ng或9. 6ng，其他组分含量为： TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystem,PN 4369016) 2 μ I, 20XGE Sample Loading Reagent (Fluidigm ,PN 85000746) 0.4 μ 1,20X gene-specific assays 0· 2 μ I，DNA-free water 0· 2 μ 1，DNA 溶液量为 I. 2 μ 1。
[0017] 数字PCR反应程序为：50° C UNG处理120秒，95° C预变性600秒，进行40次 PCR循环：95° C变性15秒，60° Cl分钟退火及延伸，收集荧光信号。
[0018] 用水将转基因玉米M0N810基因组DNA梯度稀释至5ng/y 1和8ng/y 1两个浓度， 以1. 2 μ L基因组DNA为模板，进行数字PCR反应，每个浓度每个参数反应重复6次。 3、实验结果 利用本发明中提供的方法对纯合型或杂合型Μ0Ν810进行分析鉴定。
[0019] 以DNA量为6ng的纯合型Μ0Ν810为模板，采用玉米内标准基因 hmgA和Μ0Ν810转 化体特异性事件的引物和探针分别进行数字PCR扩增反应，内标准基因 hmgA扩增曲线图如 图 1 ?6,热图反应如图 49 中的 PanelOl-SOl、Panel02-S02、Panel03-S03、Panel07-S07、 Panel08-S08、Panel09-S09,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完好，Ct值集中在 20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的363-391之间，平均值为381. 5， 检测到的目标分子数平均值为527. 2,如表I ; M0N810转化体特异性事件扩增曲线如图 7 ?12,热图反应如图 49 中的 Panel04-S04、Panel05-S05、Panel06-S06、PanellO-SlO、 Panel I I-Sl UPanel 12-S12,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完好，Ct值集中在 20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的340-368之间，平均值为353. 8， 检测到的目标分子数平均值为474. 3,如表1。M0N810特异性转化事件和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，结果符合遗传规律，可判定为纯合型转基 因抗虫玉米M0N810。
[0020] 以DNA量为9. 6ng的纯合型M0N810为模板，采用玉米内标准基因 hmgA和M0N810 转化体特异性事件的引物和探针分别进行数字PCR扩增反应，内标准基因 hmgA扩增曲 线图如图 13 ?18,热图反应如图 49 中的 Panell3-S13、Panell4-S14、Panell5-S15、 Panel 19-S19、Panel20-S20、Panel21-S21，均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完 好，Ct值集中在20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的476-495之间， 平均值为484. 2,检测到的目标分子数平均值为764. 0,如表I ; M0N810转化体特异性事件 扩增曲线如图19?24,热图反应如图49中的Panell6-S16、Panell7-S17、Panell8-S18、 Panel22-S22、Panel23-S23、Panel24-S24,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完 好，Ct值集中在20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的456-483之间， 平均值为468. 7,检测到的目标分子数平均值为723. 5,如表1。M0N810特异性转化事件和 玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，结果符合遗传规律，可判 定为纯合型转基因抗虫玉米M0N810。
[0021] 以DNA量为6ng的杂合型M0N810为模板，采用玉米内标准基因 hmgA和M0N810转 化体特异性事件的引物和探针分别进行数字PCR扩增反应，内标准基因 hmgA扩增曲线图如 图 25 ?30,热图反应如图 49 中的 Panel25-S25、Panel26-S26、Panel27-S27、Panel31-S31、 Panel32-S32、Panel33-S33,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完好，Ct值集中在 20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的338-372之间，平均值为347. 7， 检测到的目标分子数平均值为463. 2,如表I ; M0N810转化体特异性事件扩增曲线如图 7 ?12,热图反应如图 49 中的 Panel28-S28、Panel29-S29、Panel30-S30、Panel34-S34、 Panel35-S35、Panel36-S36,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完好，Ct值集中在 20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的194-214之间，平均值为200. 3， 检测到的目标分子数平均值为232. 3,如表1。M0N810特异性转化事件目标分子数计算值的 95%置信区间的二倍和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，结 果符合遗传规律，可判定为杂合型转基因抗虫玉米M0N810。
[0022] 以DNA量为9. 6ng的杂合型M0N810为模板，采用玉米内标准基因 hmgA和M0N810 转化体特异性事件的引物和探针分别进行数字PCR扩增反应，内标准基因 hmgA扩增曲 线图如图 37 ?42,热图反应如图 49 中的 Panel37-S37、Panel38-S38、Panel39-S39、 Panel43-S43、Panel44-S44、Panel45-S45,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完 好，Ct值集中在20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的475-501之间， 平均值为489. 3,检测到的目标分子数平均值为778. 7,如表I ; M0N810转化体特异性事件 扩增曲线如图43?48,热图反应如图49中的Panel40-S40、Panel41-S41、Panel42-S42、 Panel46-S46、Panel47-S47、Panel48-S48,均可以观察到在每个微流体面板上扩增曲线完 好，Ct值集中在20-35之间，且每个面板上有信号的反应室的数量集中在的285-358之间， 平均值为318. 3,检测到的目标分子数平均值为412. 3,如表1。M0N810特异性转化事件目 标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95% 置信区间有重叠，结果符合遗传规律，可判定为杂合型转基因抗虫玉米M0N810。
[0023] 以上结果可以看出，本发明为转基因抗虫玉米品系M0N810纯合度鉴定提供了一 种基于数字PCR检测的准确、可靠的绝对定量测定方法，可以鉴定出纯合型或杂合型的转 基因抗虫玉米品系M0N810。本发明为转基因品种的鉴定和控制提供了必要的手段。
[0024] 表1玉米内标准基因 hmgA和M0N810特异性转化事件目标分子数的统计分析表
【权利要求】
1. 一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型M0N810的方法，其特征在于： ① 收集 采用欧盟经过验证的M0N810特异性转化事件以及玉米内标准基因 hmgA定量检测方 法， M0N810引物序列： M0N810F :5, -TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3，， M0N810R:5' -GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3' ； M0N810探针序列： M0N810P ：5, -FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-TAMRA-3,； 内标准基因 hmgA引物序列： hmgAF :5' -TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'， hmgAR:5' -GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3' ； 内标准基因 hmgA探针序列： hmgAP :5' -FAM-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-TAMRA-3' ； ② 数字PCR扩增 以M0N810的DNA为研究模板，分别利用上述引物探针组合进行数字PCR扩增，将 M0N810用水稀释至5ng/ ill或8ng/ ill的浓度，在48. 770的数字芯片上分别对两个参数进 行数字PCR扩增，并收集目标分子荧光信号； ③ 数据分析 利用数字PCR仪数据分析软件对检测数据进行统计，分别计算M0N810特异性转化事 件和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间；如果M0N810品系中特异性 转化事件和玉米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型 M0N810 ;如果M0N810品系中特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉 米内标准基因 hmgA目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型M0N810 ; 所述的M0N810是转基因抗虫玉米品种。
【文档编号】C12Q1/68GK104480218SQ201510003973
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】李允静, 吴刚, 李晓飞, 武玉花, 李飞武 申请人:中国农业科学院油料作物研究所