专利名称：检测单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物基因技术领域的检测单核苷酸多态性的方法，特别是一种检测与精神分裂症相关的单核苷酸多态性的方法。
背景技术：
精神分裂症是一种复杂的且具有破坏性的脑功能紊乱，发病率约为1％，是严重影响人类精神和躯体健康的疾病之一，消耗了大量人力、物力和财力(Hyman SE.The NIMH perspectivenext steps in schizophrenia research.Biol.Psychiatry 2000b；471-7.)。虽然精神分裂症的确切病因还没有找到，但是同胞对分析，家系分析以及寄生子研究一致表明，遗传因素在发病机制中起了重要的作用(Barkur S，Shastry.SchizophreniaA genetic perspective(Review).Int J Mol Med 2002；9207-212.)。基因组遗传连锁筛选鉴别出了染色体上许多位点有阳性LOD值，这样就排除了精神分裂症的发生是由单一主要的位点导致的(Pulver AE，Lasseter VK，Kasch L，et al.Schizophreniaa genome scan targets chromosomes 3p and 8p as potential sites ofsusceptibility gene.Am J Med Genet 1995；60252-260.)。单核苷酸多态性即某一物种中，在基因组的特定位置上存在着的单个核苷酸的序列变化。普遍认为单核苷酸多态性在人类基因组中每1Kb就有1个，总数可达2～3百万个，是人类基因组多态性的主要来源，约占人类DNA多态性的90％(Collins，F.S.，Brooks，L.D.& Chakravarti，A.，A DNA polymorphism discovery resourcefor research on human genetic variation，Genome Res，1998，8(12)，1229.31.)。由于单核苷酸多态性密度很高，数量众多，非常稳定，并且绝大多数情况下只有两种等位基因型，可进行自动化的大规模检测，所以它是很好的遗传标记。进行全基因组的关联分析是一个具有良好前景的精神分裂症分子遗传学研究方法。Affymetrix公司的基因芯片为高密度寡核苷酸芯片，利用原位光刻专利技术可使一张芯片上合成多达500,000个寡核苷酸。这种类型的芯片具有极高的特异性和灵敏度，重复性好，假阳性率非常低，是全基因组的关联分析的有力工具。通过利用The GeneChip Mapping 100K Set对中国和苏格兰人群中精神分裂症患者的全基因组关联分析，我们首次检测到一组12种与精神分裂症相关的核酸序列中单核苷酸多态性位点rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777。
经对现有技术的国内外文献检索，至今未见与本发明主题有密切联系的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供检测单核苷酸多态性的方法。使其不仅适用于人类，也可诊断实验动物，用于精神分裂症治疗药物的开发和药效的评价，促进开发治疗精神分裂症药物的进程。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体步骤包括(a)收集待测者的静脉血液样品，提取DNA；(b)取250ng基因组DNA分别用Xba I or Hind III于37℃酶切2小时，70℃灭活20分钟；(c)酶切后的DNA分别用0.25μM Xba I or Hind III adapter(Affymetrix)和250U T4 DNA联结酶(New England Biolabs)16℃联结2小时，70℃灭活20分钟；(d)连接产物分成3孔，每孔PCR反应体系总体积为100ul，具中MgCl21.0mM，dNTP(each)0.3mM，Platinum Pfx DNA Polymerase(InvitrogenCorporation)0.05U/μL；(e)PCR反应产物经纯化，与Affymetrix GeneChip Human Mapping 50KArray Xba 240和Hind 240基因芯片杂交；(f)杂交后的芯片经洗涤、染色，用扫描仪和分析软件检测单核苷酸位点是否存在多态性。
所述的PCR反应，其条件94℃3分钟，30X(94℃ for 30秒，60℃for 45秒，and 68℃ for 60秒)，extension at 68℃7分钟。
步骤(f)中，检测rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777单核苷酸位点是否存在多态性。
本发明核苷酸序列测定方法的过程是首先，将样品基因组DNA稀释至标准50ng/μL，利用Xba I和Hind III两种核酸限制性内切酶对样品DNA进行特异性酶切，将基因组DNA转化为200-2000bp的核酸片段。然后，在酶切位点末端连接通用扩增引物adaptor。利用Pfx聚合酶，通过PCR反应，将样品DNA进行全基因组扩增。扩增后产物经QIAGEN多孔纯化板纯化，浓缩。将浓缩后的扩增产物稀释至40μg/45μL，通过DNA酶片段化，使之成为20-200bp左右的小片段DNA。片段化产物经过标记反应，在核酸片段末端添加荧光标记物，再与基因芯片上特异的寡核苷酸探针杂交。杂交后的芯片经洗涤、染色，去处干扰信号，通过用扫描仪和分析软件，利用基因芯片上特异位点的杂交信号检测不同的单核苷酸位点是否存在多态性。
本发明的检测单核苷酸多态性的方法，不仅适用于人类，也可诊断实验动物，与目前正在使用的依据各种量表评价的诊断方法相比，它不依赖于医生对诊断对象的主观判断。由于静脉取血具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此本发明促进开发治疗精神分裂症药物的进程，使诊断具有极大的临床应用的可能。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1基因的收集和抽提精神分裂症患者来自于中国上海市精神卫生中心，英国阿伯丁大学，以DSM IV(中国精神病分类方案与诊断标准第二版修订版)为诊断标准。匹配的对照个体由上海地区医院门诊部和英国阿伯丁大学提供。中国散发性的精神分裂症患者172例，平均年龄50.17±14.33岁(标准差)，发病年龄为28.48±9.35岁(标准差)。健康自愿对照组171例，平均年龄28.10±8.14岁(标准差)。英国散发性的精神分裂症患者166例，平均年龄44.55±13.80岁(标准差)，发病年龄为24.33±8.25岁(标准差)。健康自愿对照组179例，平均年龄39.11±11.01岁(标准差)。在经过本人或患者家属同意的前提下采集血液，并签署知情同意书。
实施例2SNP的获得以及12种单核苷酸多态性位点的检测所有SNP均来自于Affymetrix GeneChip Mapping 100K Set，其物理间距中值为8.5kb，平均距离为23.6kb。
取250ng基因组DNA分别用Xba I or Hind III于37℃酶切2小时，70℃灭活20分钟，将基因组DNA转化为200-2000bp的核酸片段。
酶切后的DNA分别用0.25μM Xba I or Hind III adapter(Affymetrix)和250U T4 DNA联结酶(New England Biolabs)16℃联结2小时，70℃灭活20分钟，在酶切位点末端连接通用扩增引物adaptor。。
连接产物分成3孔，每孔反应体系总体积为100ul，其中MgCl21.0mMdNTP(each)0.3mMPlatinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen Corporation)0.05U/μLPCR反应条件94℃ 3分钟，30X(94℃ for 30秒，60℃ for 45秒，and 68℃ for 60秒)，extension at 68℃ 7分钟。利用Pfx聚合酶，通过PCR反应，将样品DNA进行全基因组扩增。
PCR扩增后产物经QIAGEN多孔纯化板纯化，浓缩。将浓缩后的扩增产物稀释至40μg/45μL。通过DNA酶片段化，使之成为20-200bp左右的小片段DNA。片段化产物经过标记反应，在核酸片段末端添加荧光标记物，再与AffymetrixGeneChip Human Mapping 50K Array Xba 240和Hind 240基因芯片上特异的寡核苷酸探针杂交。
杂交后的芯片经Fluidics Station 450(Affymetrix)洗涤、染色，去处干扰信号，用GeneChip Scanner 3000扫描仪和GeneChip GCOS software，GeneChip DNA Analysis Software(GDAS)3.0分析软件进行单核苷酸等位基因检测，通过识别基因芯片上特异位点的杂交信号检测不同的单核苷酸位点是否存在多态性。
实施例312种单核苷酸多态性位点与精神分裂症的相关性统计利用Varial.0(Silicon Genetics)软件通过对全基因组115,071个SNP划分Block，构建Haplotype，进行全基因组关联分析。统计学的显著性水平设定为False Discovery Rate(FDR)＜0.01。
结果位于基因组中的一组12种单核苷酸多态性位点rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777的关联分析结果见表1。
表一、中国和英国人群中FDR(q＜0.01)的12个单核苷酸多态性位点。
从上表中可见单核苷酸多态性位点rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777军均检测到明显的单核苷酸多态性，其统计学分析FDR值均低于0.01，是产生精神分裂症的危险等位位点。
本发明的具有实用性的例证1)采用本发明提供的实验方法可以特异、高效的检测出上述单核苷酸多态性位点。
2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1所述等位位点作为药物设计靶点来进行药物的筛选，促进新的抗精神疾病药物的发现。
3)利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒。
4)所建立的方法可用于分析人类基因组上述单核苷酸多态性位点，来应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
权利要求
1.一种检测与精神分裂症相关的单核苷酸多态性的方法，其特征在于它包括步骤(a)收集待测者的静脉血液样品，提取DNA；(b)取250ng基因组DNA分别用Xba I or Hind III于37℃酶切2小时，70℃灭活20分钟；(c)酶切后的DNA分别用0.25μM Xba I or Hind III adapter和250UT4 DNA联结酶16℃联结2小时，70℃灭活20分钟；(d)连接产物分成3孔，每孔PCR反应体系总体积为100ul；(e)PCR反应产物经纯化，与Affymetrix GeneChip Human Mapping 50KArray Xba 240和Hind 240基因芯片杂交；(f)杂交后的芯片经洗涤、染色，用扫描仪和分析软件检测单核苷酸位点是否存在多态性。
2.如权利要求1所述的检测与精神分裂症相关的单核苷酸多态性的方法，其特征是，步骤(d)中，其中MgCl21.0mM，dNTP(each)0.3mM，Platinum PfxDNA Polymerase0.05U/μL。
3.如权利要求1所述的检测与精神分裂症相关的单核苷酸多态性的方法，其特征是，所述的PCR反应，其条件94℃3分钟，30×(94℃for30秒，60℃for45秒，and68℃for60秒)，extension at68℃7分钟。
4.如权利要求1所述的检测与精神分裂症相关的单核苷酸多态性的方法，其特征是，步骤(f)中，检测rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777单核苷酸位点是否存在多态性。
全文摘要
检测单核苷酸多态性的方法。包括收集待测者的静脉血液样品，提取DNA；取250ng基因组DNA分别酶切；酶切后DNA联结酶联结；连接产物分成3孔，每孔PCR反应体系总体积为100ul；PCR反应产物经纯化，与基因芯片杂交；杂交后的芯片经洗涤、染色，用扫描仪和分析软件检测单核苷酸位点是否存在多态性。本发明利用分子标记检测单核苷酸多态性的方法，而不依赖于医生对诊断对象的主观判断。由于血液具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此本发明使诊断具有极大的临床应用的可能。本发明同时可用于评价治疗精神分裂症药物的疗效，指导药物开发。
文档编号C12Q1/68GK1706968SQ20051002620
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者贺林, 秦炜, 师咏勇, 卞莉, 冯国鄞 申请人:上海交通大学